Способ определения фазового состояния биологических объектов при криоконсервации

 

Использование: криобиология. Цель изобретения - повышение точности способа и его информативности за счет регистрации кинетики структурных и фазовых переходов. Сущность изобретения: к охлаждаемому биообьекту прикладывают внешние деформирующие напряжения и регистрируют пластическую деформацию биообъекта в процессе его непрерывного отогрева. По термопластическим Kpi^BbiM определяют температурные интервалы существования различных фазовых состояний. 2 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/483

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ !

4 ОО С>

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4903585/14 (22) 21.01.91

:, 46) 07.12.92. Бюл. М 45

Г71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) А, И. Осе цкий., В. Ю. Васила вский и

Т,M.Ãóðèíà (56) Cryoblology, 1972, ч.9, р. 429 — 440. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗОВОГО

СОСТОЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ ПРИ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

Изобретение относится к криобиологии и может найти применение при исследовании процессов, происходящих в охлаждаемых биологических объектах.

Известен способ определения фазового состояния биообъектов методом парамагнитного резонанса.

Недостатки способа — невозможность исследования тканей и низкая информативность способа.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения фазового состояния воды в биообъектах с помощью световой микроскопии, основанный на изменении оптической плотности жидкой фазы при ее кристаллизации или изменении вращения плоскости поляризации света.

Недостатками способа являются низкие точность и информативность способа, Эти недостатки обусловлены следующим, Образцы перед исследованием обрабатывают фиксирующими и красящими растворами, которые вносят погрешности в

„, Ы2„„1780001 А1 (57) Использование: криобиология. Цель изобретения — повышение точности способа и его информативности эа счет регистрации кинетики структурных и фазовых переходов.

Сущность изобретения: к охлаждаемому биообьекту прикладывают внешние деформирующие напряжения и регистрируют пластическую деформацию биообъекта в процессе его непрерывного отогрева. По термопластическим крИвым определяют температурные интервалы существования различных фазовых состояний. 2 ил, определение фазовых состояний, соответствующих определенным температурам и временным интервалам, В случае исследования тканей готовятся их ультратонкие среды, при этом кинетика кристаллизации воды в таких срезах может существенно отличаться от кинетики кристаллизации в объемных образцах как за счет поверхностных эффектов, так за счет воздействия на жидкие фракции фиксирующих и красящих препаратов. Кроме этого, происходит маскировка процессов внутри- э клеточной кристаллизации внеклеточным льдом. Все это снижает точность получаемой информации.

Способ не позволяет осуществлять непрерывную регистрацию фазового состояния биообъекта в процессе их охлаждения и нагрева, что делает способ малоинформативным.

Цель изобретения — повышение точности и информативности способа за счет регистрации кинетики структурных и фазовых переходов.

r 780001

20

Поставленная цель достигается тем, что

: способе определения фазового состояния логи;ос«их обьектов при криоконсерви:", .к, включающем охлаждение образца ос; едувощую регистрацию его физических а ктеристик, к охлажденному образцу при. -.лывают внешниедеформирующиенапрялия, затем проводят отогрев образца, при .>м в процессе непрерывного отогрева ре:::сто:.оуют его термопластическую дефор;цню.

Способ поясняется следующим примеОбразцы тканей головного мозга, сер дца, печени, почек, желудка, поперечно-полосатои мышцы крысы и эритромассы человека, инкубированной с 30%-ным вод1 з ным раствором глицерина, объемом 0,5 GM помещали R устройство для излучения упруго-пластических свойств замороженных растворов и биообьектов и охлаждали со скоростью 4 град/мин до -170 С с последу.ощей стабилизацией температуры в течение 10 мин, Затем к исследуемым образцам тканей прикладывали деформирующие напря>кенля о == 400 гlмм, а к образцам из т

2 эритромассы 200 г/мм . Величина деформирующлх напряжений выбиралась такой, чтобы с,одной стороны, не вызывать пласти«есг«>;; деформации образца при конечной темг1ера гуре охлаждения, а с другол — обеспечи- ать оптимальную разность в скорости сn3c..<,å<..ê<>rà течения образца при происходя дих в нем фазовых переходах, После приложения деформирующих напряжений о,, ществляли отогрев исследуемых образ;ч со с<оростью 1 град/мин с одновремен..сй регистрацией термопластической

;..:иво.-й в координатах е =г (T) при о=

::;»,-;t, где r; — пластическая деформация образца, г> — прикладываемое деформирующес напря>кение.

ТерviGilластические кривые были пол: -ены для все;; вышеуказанных образцов.

; ивич .—:ый вид таких кривых для клеточных

;;.успензий показан на примере эритромас; ы (фиг.1, крлвая 1), для тканей на примере

10 г еречно-полосатой мы ш цы (фиг.1, кривая I). Представленные кривые имеют ярко вы.а>кеннь и многостадийный характер, при:.ем каждая из стадий соответствуст

;.. r-редел ен ному фазовому состоянию блообъекта. Зто связано с тем, что упруго-пла,:тические характеристики отдельных фракций образца при их переходе от жидко: и к кристаллическому или застеклованному сос",ояниям изменяется на несколько по:ядков по абсолютной величине. Соответстгенно изменяется сопротивление ткани

55 внсшним напряжением, а значит и ее гуммарная пластическая деформация r,,1ъ происходя щая под действием этих напряжений за определенный промежуток времени At. В свою очередь изменения величины Ж ь сопровождающие фазовые переходы в исследуемых образцах, приводят к характерным перегибам на термопластических кругах, что крайне упрощает процедуру определения температурных интервалов существования определенных фазовых состояний биообъектов.

Согласно полученным кривым (фиг.2) в интервале температур -180...-150 C образцы тканей находятся в эакристаллизованном состоянии с высокостабильной структурой, Диффузионные и рекристаллизационные процессы s этом интервале температур в них подавлены, в результате чего скорость нарастания пластической деформации с повышением температуры здесь практически равна ryr ro, Выше температуры -150 С в замороженных тканях начинаются рекристаллизационные процессы, которые протекают вплоть до температур

-80ОС. На графике (фиг.1, фиг.2) эта стадия характеризуются нарастанием деформации

8 r с повышением температур. Скорость деформации здесь пропорциональна интенсивности протекания рекристаллизационных процессов. После завершения рекристаллизации структура образца вновь стабилизируется, что отражается на термопластических кривых уменьшением скорости пластической деформации, Таким образом, область протекания рекристаллиэационных процессов выделена на термопластической кривой специфическим перегибом и хорошо определяется экспериментально. При дальнейшем повышении температуры начинаются процессы расстеклования биополимерных комплексов и плавления образовавшихся в образцах кристаллов льда, которые сопровождаются резким увеличением пластичности образцов.

Температура начала этих процессов Т . для разных тканей может сильно отличаться, что следует из фиг,2. Так для тканей головного мозга (кривая 1) Tnn = 77 С, для, ткани почки крысы (кривая 2) Тпл. = -б1 С, ткани сердца крысы и (кривая 3) Т.nn, =-44,5 С, ткани поперечно-полосатой мышцы крысы (кривая 4)

Тпд. =-43 С, ткани желудка крысы (кривая 5) ! .лл, =--38 С.

Таким образом способ позволяет не толы<о определять температурные интервалы происходящих в образце структурных и фазовых переходов, но и проследить их кинетику.

Измеряемые пластические характеристики.

1700001 Я, л сл

900

-350 которые при пер"ходе от одного фаэовогс состояния к другому изменяются по величине на несколько порядков, однозначно отображают происходящие в образце фаэовые и структурные превращения. 5

Формула изобретения

Способ определения фазового состояния биологических объектов при криоконсервации, включающий охлаждение образца и последующую регистрацию его 10 физических характеристик, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения точности способа и его информативности за счет регистрации кинетики структурных и фазовых переходов, к охлажденному образцу прикладывают внешние деформирующие напряжения, затем проводят отогрев образца, при этом в процессе непрерывного отогрева регистрируют его термопластическую деформацию.

1780001

< ) О !

CU

Составитель Т.Гурина

Редактор С.Кулакова Техред М.Моргентал Корректор M. Максимишинец

Заказ 4432 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская, наб., 4/5

Произв<.д"твенно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101