Способ определения сенсибилизации лейкоцитов
Использование: изобретение может быть использовано в иммунодиагностике аллергических состояний. Цель изобретения - повышение чувствительности способа . Сущность изобретения: образцы крови с антигеном инкубируют на стекле в изотонической среде, высушивают и обрабатывают реактивом Дунгера 3-4 мин. Затем препарат окрашивают азуром и исследуют. Положительнцй эффект: условия проведения способа исключают приготовление мазка, приводящее к раздавливанию наиболее измененных под влиянием антигена клеток, рассматривается наиболее активная популяция лейкоцитов - прилипающие клетки, -чувствительность способа возрастает в 10 и более раз.
CO)03 СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/49
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) Г
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
1 (21) 4730708/14 (22) 14.08.89 (46) 23.12.92. Бюл. N. 47 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины AH УССР (72) Л.П.Реус, Ж.Н.Манина и Э,И.Обозная (56) ABTopcKOG свидетельство СССР
М 1359743, кл, G 01 N 33/48, 1987..
I (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ, (57) Использование: изобретение может быть использовано в иммунодиагностике аллергических достояний. Цель изобретеИзобретение относится к. медицине, в частности иммунодиагностике аллергических Состояний.
Наиболее близким к заявляемому является способ сенсибилизации лейкоцитов, согласно которому образцы помещают в пробирки, добавляют аллерген íà 5%-Hoì растворе цитрата натрия, инкубируют при
450С, готовят мазки и подсчитывают содержание измененных нейтрофилов, Недостатком способа является невысокая чувствительность; обусловленная тем, что клетки, наиболее поврежденные антигеном, разрушаются в процессе приготовления мазков.
Целью изобретения является повышение чувствительно ти способа.
Поставленная цель достигается тем, .что. в способе or.зеделения сенсибилизации лейкоцитов, вк1ючающем их инкубацию с антигенами; приготовление препарата и оценку результатов, инкубацию проводят в изотонической среде на предметном стекле, . Ж,„, 1783431 А1 ния — повышение чувствительности criocoба. Сущность изобретения: образцы крови с антигеном инкубируют на стекле в изотонической среде, высушивают и обрабатывают реактивом Дунгера 3-4 мин. Затем препарат окрашивают азуром и исследуют. Положи-. тельный эффект: условия проведения ctiocoба исключают приготовление мазка, приводящее к раздавливанию наиболее измененных под влиянием антигена клеток, рассматривается наиболее активная популяция лейкоцитов" прилипающие клетки, чувствительность способа возрастает в 10 и более раз. после чего неприлипшие клетки смывают и высушенный препарат обрабатывают реактивом Дунгера в течение 3-4 мин, а оценку сенсибилизации осуществляют по изменению размера сегментоядерных лейкоцитов по сравнению с контролем, м
: . Способ осуществляется следующим образом.
5 мл венозной крови набирают в иликонированную пробирку; содер>кащую гепарин из расчета 5 ед на 1 мл крови. Пробирку помещают в термостат и выдерживают под углом 60 .в течение 60 мин при 370С. На чистые обезжиренные стекла наносят рамку из расплавленного парафина, ограйичивающую квадрат 2х2 см. На подготовленное ложе наносят 0,4 мл среды 199, рабочую дозу коммерческого аллергена (0,0025, 0,005, О,001) и 0,1 мл плазмы, обогащенной лейкоцитами. На стекло. контрольного препарата наносят среду 199 и плазму в таком же количестве;
1783431
Инкубационную смесь размешивают покачиванием на стекле или продуванием воздуха из пипетки, соединенной с резиновой грушей. Стекла помещают в эксикатор, на дно которого наливают небольшой объем воды для создания влажной камеры, закрывают и помещают на 60 мин в термостат при
37 . Через час препараты сливают, смывают неприлипшие клетки и тромбоциты теплой средой 199 (рН 7,2), содер>кащей 5 ед гепарина в 1 мл. Препараты . высушивают на воздухе, после чего на поверхность высушенных прилипших клеток наносят реактив
Дунгера и выдерживают 3-4 мин, Препараты быстро сливают, высушивают в.вертикальном положении. Окрашинание препарата водным раствором 2%-ного азура осуществляют путем погружения его в краситель на 1-2 с, после чего препарат быстро ополаскивают водой. После высушивания препаратов производят их иммерсионную микроскопию, сопоставляя размеры сегментоядерных лейкоцитов контрольного и опытного образцов.
Пример. Больной Р„диагноз: облитерирующий эндартериит левой нижней конечности, трофические. язвы, микробная экзема. Проведено определение сенсибилизации лейкоцитов крови к стрептококковому и стафилококковому аллергенам, 5 мл крови, полученной иэ вены стандартным методом, помещали в силиконированную пробирку, содержащую 25 ед гепарина. На поверхность чистых и обезжиренных предметных стекол наносили рамку из парафина, ограничивающую квадрат 2х2 см, На подготовленное ложе контрольного препарата наносили 0,4 мл среды 199 и 0,1 мл плазмы. Опытные препараты готовили путем добавления к среде коммерческих аллергенов гемолитического стафилококка и стрептококка в дозах 0,0025, 0,005 и 0,01, после чего добавляли по 0,1 мл плазмы.
Смесь размешивали покачиванием стекол, затем помещали в эксикатор, содержавший на дне небольшой объем воды, эксикатор закрывали и помещали н термостат. Инкубацию осуществляли 60 мин при 37 С. После инкубации препараты сливали, смывали .неприлипшие клетки теплой средой 199 (рН
7,2) физраствором, содержащим гепарин (5 ед/мл). Препараты высушивали, наносили реактив Дунгера на 3 мин, после чего высушивали в вертикальном положении. Докрашивание сухих препаратов осущестнляли
Формула изобретения
Способ определения сенсибилизации лейкоцитов, включающий их инкубацию с антигеном, приготовление препарата и оценку результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, инкубацию проводят в изотонической среде на предметном стекле, после чего неприлипшие клетки смывают и высушенный препарат обрабатывают реак50 тином Дункера в течение 3-4 мин, а оценку сенсибилизации осуществляют по изменению размера сегментоядерных лейкоцитов
55 по сравнению с контролем, погружением в 2%-ный водный раствор азура. Препараты смывали, высушивали и исследовали под микроскопом.
В контрольных препаратах клетки
5 не изменены, имели сохранные ядра,четкую аэурофильную зернистость, сохранные мембраны, В опытных препаратах уже в дозе антигенов 0,0025 мл были клетки бесформен10 ные, увеличены в размерах, ядра не определялись.
Результат оценен как резко положительный (100% измененных клеток).
При обследовании этого больного спо15 собом по прототипу в контрольном препарате отмечалось 10% поврежденных клеток, в опытном препарате, содержащем аллерген стрептококка, — 15%, стафилококка — 34%
Индекс сенсибилизации лейкоцитов для
20 15 -10 стрептококкового аллергена = 0,05, 100 для отафилококкового — = 0,24:
34 — 10
Таким образом при обследовании спо25 сабом по прототипу сенсибилизация лейкоцитов к стрептококковому аллергену ничто>кна (индекс 0,05), к стафилококконому — умеренная (индекс 0,24).
При обследовании заявляемым спосо30.бом наблюдается повреждение 100% клеток при дозе в 8 раз меньшей, чем в прототипе, т.е. чувствительность заявляемого способа более чем на порядок превышает чувствительность способа по
35 прототипу.
Высокий положительный эффект заявляемого способа обусловлен тем, что исследование проводится с популяцией наиболее функционально активных клеток — прилипа40 ющих.
