Штамм гриба beauveria ваssiаnа bals в качестве трансформатора для гидроксилирования 1-бензоилпиперидина и 1-бензоиламино-3,7-диметилоктадиена-2,6
Использование: биотехнология - ность изобретения выделен новый uvii грибов рода Beauveria, эффективно тр,. формирующий 1-бензоилпиперидин и v - ральбензамид. Штамм идентифицирован как Beauveria basslana Bal- P-KMF3P-0 Выделенный штамм эффе,ивно гидро 1 - лирует 1-бензоилпиперидин с образован, - ем 1-бензоил-4-гидроксипиперидина (выход 60%, в литературе 18%), кроме того образ ется оптически активный З-гидроксииг В отличие от известных штаммов это с гр - ба новый штамм трансформирует бензамид. 7 табл. диен-2,6(гидроксицитральбензэмид) v,- мои насекомых Ближайшим аналогом предлагаем л изобретения является ку-tavc микрсн,ки пических грибов Beauve- з harslnna Агг 7159 (до 1970 года называлась SporotncU i sulfurescens (1)), которую иногда назыв к i Beauveria sulfurescens ATCC 7159. Культура гриба Beauveria basslana ATCC 715е сне. собна трансформировать производные ОС с к: а ос 1ч
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕ НТ СССР) ОП И САН И Е И ЗОБ P ET E Н И Я
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4903326/13 (22) 15.11.90 (46) 23.06.93. Бюл. N. 23 (71) Химический факультет МГУ им. М.В,Ломоносова (72) И.А.Паршиков, Л.И.Воробьева. Л,В.Модянова, Е.B.Äîâãèëåâè÷, П.Б.Терентьев (SU) и Хольгер Хофман (00) (56) Johnson R.À. Oxegenation with
microorganisms In: OxIdatIon in arhanlc chemistry
N Y: Асо4 Press 1978, parte, р. 131-210.
Johnson R.À, Murray H.С., Relnekc LM., Fonken G.S, Stechlometry of mIcrobIolohlcal
hydroxylation. !! oxygenation of 1-benzoylalkIlpIperydIns.J.Org. Chem, 1969, v. 34, ч. 8, р, 2279-2284.
Johnson R.À. Murray Н.С., Reineke LM, The mecrobiollgIcal oxygenatIon of acycllc NalkylbenzamIdes-J. Am, Chem. Soc., 1р971, ч.
93, М 19, 4872-4880.
Klesllch К. Mlcroblol transformatlons of
non - Stегоid compounds. Stuttgart: Georg
ThIeme Publishers, 1976, 1123 р.
Johuson R.À., Herr М.E„Murray Н.С., Fonken G,S. The microbiological oxygenatIons
of aracycloalcanes. Structural determInatIons
and some chemical modIfIcatIons leading to
transannular reactions. J, Org. Chem. 1968, ч.
33, N. 8, р. 3187-3195.
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма гриба Beauverla basslana Bals BKM F31110, который может найти применение в микробиологическом синтезе производных многих лекарственных препаратов, таких как 1-бензоил-4-гидроксипиперидин и (+)-1бензоил-3-гидроксипиперидин-полупродук тов противовоспалительных препаратов и
1-бензоиламино-5-гидрокси-3,7-диметокта
„„. Ж „„1 822886 А ю (sI)s С 12 Р 17/12, С 12 N 1/1л
2 (54) ШТАММ ГРИБА BEAUVERIA BASSIANA
BAIS В КАЧЕСТВЕ ТРАНСФОРМАТОРА ДЛЯ
ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ 1-БЕНЗОИЛПРПЕРИДИНА И 1-БЕНЗОИЛАМИНО-3 7-,Ц!—
МЕТИЛОКТАДИЕ НА-2,6, (57) Использование: биотехнология. Cv«â€” ность изобретения: выделен новый . п л л грибов рода Beauveria, эффективно т,,:,:формирующий 1-бензоилпиперидин и ральбензамид, Штамм идентифицирован как Beauveria bassiana Bai PIMF 3i I»
Выделенный штамм эффе:, инно гндро;лирует 1-бензоилпиперидин с образован;:,ем 1-бензоил-4-гидроксипиперидина (выход
60, в литературе 18 ь), кроме того обргз,— ется оптически активный З-гидроксии."i,, В отличие от известных штаммов это с Гр— ба новый штамм трансформирует цитр-. 1.— бензамид. 7 табл. диен-2,6(гидроксицитральбензамид) ф»;..;;мон насекомых.
Ближайшим аналогом ппедлагаел;;.) изобретения является культи > Ml краек< пических грибов Beauve. a ;а..slana Аг "
7159 (до 1970 года называлась Sporntllr и
sulfurescens (1)), которую иногда называк,Beauverla sulfurescens АТСС 7159. Культура гриба Beauveria basslana АТСС 7159 с и:собна трансформировать произаод ь е
1822886 бенэоилпиперидина-1-бензоилалкилпипе ридины при росте на среде с глюкозой и кукурузным экстрактом (2), например гидроксилирование 1-бензоил-4-метилпиперидина (1) приводит к смеси двух продуктов; н — н
lOPh COPh
И,„
COPh COPh
Они были идентифицированы как 1-бенэоил-4-гидроксиметилпиперидин (II) и 1-бензоил-4-гидрокси-4- метилпиперидин (1П).
При испольэвании в качестве субстрата (+)-1-бенэоил-3-метилпиперидина (IV) в продуктах реакции наблюдалось два компонента: 1-бенэоил-3-метил-4- гидроксипиперидин (V) в оптически активной форме и
1-бензоил-3-гидрокси-3-метилпиперидин (VI), оптически неактивный: сн1 соРл „н CoPh он. (1V)
Н (7) 6/.
COP h
Культура гриба Beauverla basslana
АТСС 7159 способна также окислять аналоги цитральбенэамида-ациклические амиды (3), При росте на указанной выше среде культура гидроксилируют 1-(3-метилбутил)бензамид(ЧП) в положение 3 алкильного заместителя с выходом продукта (Vill) 13 (,: Н3
СН -CH-CH,-СН, НН..1 С,Н, о (п) сн, ("I!ç "--СН,-СН,-КН g-C H
C % и (жп) ву, Гидроксилирование в тех же условиях
1-(1-пентил-3-)-бензамида (IX) культурой
Beauverla bassiana ATCC 7159 приводит к образованию оптически активного спирта (X)с выходом 10)ь:
Ннспсьнь ! снн-СН1-СН --СИ1-СНг ((Х) ннсnC,H, 1 — (-) -CH)-CH-CH-СН,- СН, он Культура бактерии Рзсобопопаз aerugInosa способна окислять аналог цитральбензамида — цитраль (XI) с образованием четырех продукгов: (Xli) выход 62, (XIII) выход 0,8)ь, (XIV) выход 0.5 и (ХЧ) выход 1$ (4): CHg сн1 сн .c o )---(") (Т + СНО ) СоОН ) СН ОН НзС CHI Н С СН1 И С -CH 5 (XI) (П) 62 / (Zm) n,8/ сн> и сопп ° (HgC+CHн СН1 Снн 10 (XE) 0,5У. Я7) 1/ Наиболее близким прототипом предполагаемого изобретения является культура гриба Beauveria bassiana АТСС 7159, которая была выделена как лабораторный эагряэнитель (1). Данный микроорганизм осуществляет трансформацию 1-бензоилпиперидина (XVI) в растущей культуре на среде следующего состава, г/л: глюкоза10,0; кукурузный экстракт - 20,0; вода водо20 проводная; рН 5,0; t = 28 С/5, 10. Продуктом реакции является 1-бензоил-4-гидроксипиперидин (XVII) с выходом 18;(,: (-„) — — h СоРл СоРЛ (II5H) (I(I2II) )ВУ В литературе не встречается примеров трансформации цитральбензамида ни куль30 турой Beauverta bassiana АТСС 7159, ни какими-либо другими культурами, поэтому можно ограничиться укаэанными выше аналогами. К недостаткам культуры Beauverla bassiana ATCC 7159 относятся: 35 1. В ыход продукта трансформации 1-бензоилпиперидина-1-бен зоил-4-гидроксипипе ридина невысокий и составляет 18 (», При трансформации не происходит введения гидроксила в прохиральный центр с обраэовани40 ем оптически активного З-гидроксиизомера. 2. Культура не гидроксилирует цитральбензамид, а при гидроксилировании его аналогов 1 (3-метилбутил)бензамида и 1-(1пентил-34)бензамида выходы продуктов ре45 акции также малы и составляют 13 и 10 соответственно, Целью изобретения является выделение нового, более продуктивного штамма рода Bearveria, эффективно осуществляющего трансформацию 1-бензоилпиперидина и цитральбензамида. Продукты гидроксилирования этих соединений могут быть использованы: 1-бензоил-гидроксипиперидины в синтезе противовоспалитель55 ных и косметических препаратов (6,7), а гидроксипроизводные цитрал ьбензамида как ферромоны насекомых (8), Цель достигается выделением нового штамма Beauverla bassiana Bals BKM F3111D с личинки колорадского жука. 1822886 Штамм Beauveria basslana ВКМ F31110 является энтомопатогенной культурой и природным паразитом колорадского жука, вредной черепашки, тутового шелкопряда, картофельной коровки и т.д. и был выделен авторами с пораженной грибом личинки колорадского жука, найденной на картофельном поле вблизи r. Ивантеевка Московской области. Культура высевалась с поверхности личинки на среду следующего состава: 4 Б сусло-агар, рН 5,0, вода водопроводная. После нескольких последовательных пересевов на указанной среде была выделена чистая культура гриба и идентифицирована как Beauverla bassiana Bals (9). Данный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером F-31110, непатогенен для человека. Морфологические и культурные признаки. Микроорганизм культивировали на агаризованной среде Чапека. Колонии растут сравнительно быстро, на 8-е сутки достигают 6 см в диаметре при 28 С. Колонии бугристые, белые, форма круглая, край ровный. Цвет спороносящего воздушного мицелия белый, цвет обратной стороны колонии— белый. Растворимый пигмент отсутствует, Эксудата не образует. Центральная часть колонии с хохолком, Воздушный мицелий септированный, диаметр гиф 1,0-2,0 мкм. Небольшие скопления конидиогенных клеток образуются на цилиндрических боковых клетках размером бх15 мкм или располагаются непосредственно на гифе. Бластоспоры развиваются как вздутие конца конидиогненной клетки, обычно цилиндрические с гладкой поверхностью, образуются за счет симподиального роста конидиогенной клетки. Конидии формируются из бластоспор. Конидин бесцветные, одиночные, отшнуровываются поодиночке с образованием коленчатой зубчатой оси конидиогенной клетки. Конидии сферические, поверхность бородавчатая, размер 3,0 « 0,2 мкм, в массе белые На среде состава, г/л: кукурузный экстракт 20, глюкоза 10,0, агар-агар 15,0, вода водопроводная, рН 5,0, колонии растут относительно быстро и на восьмые сутки достигают 5 — 6 мм в диаметре, Колонии белые, круглые, край ровный, в центре колонии небольшой бугорок. Поверхность колонии равная, без бугорков, Цвет спороносящего мицелия белый, обратная сторона колонии белая. Растворимого пигмента не образует. Экссудата не образует. Воздушный мицелий септированный, диаметр гиф 1,0-2,0 мкм, Скопления конидиогенных клеток образуются на цилиндрических боковых клет5 55 ках размером 6х15 мкм или рлс непосредственно на гнфе Блaci виваются как вздутие конца клетки за счет ее последа;я ге . г, -. диального ветвления. r.лас-.; с. -... рические с гладкой по .Г.;н образуются из блас1осп,; ются поодиночке с о татой зубчатой оси v Конидии сферическ1 е бородавчатая, раза.;, (— На среде -oci, :-. . - пептон 10,0, вода вол--п.. -,—," « колонии растут доволы;о 1г.д.г-. °,::день достигают 5-7 мм в д =л — .: белые, круглые, край ровный. С obpa:Стороны колонии слегка складчaTJe. спороносящего воздушного мицел = Растворимый пигмент отс т".ra та не образуется, диаметр гиа i.r, ) На цилиндрических боковых кле ром бх15 мкм или непосредствеi.««,, образуются скопления кю, .ис..., ток. Бластоспоры развива ; конца конидиоген ной ..г.г-- .. линдрические с гладкой,юc..г:, разуются эа счет сим — о- ; . конидиогенной клетки. Кою:.„ фыр .. ются из бластоспор, отшнуровываю. диночке с образованием ко зубчатой оси конидиогенног; .дии сферические, белые, и:.в::,:: давчатая, размер 3,0+ О,":.,:ю: Физиолого-Gvoxv . ески- "„, Рост культуры в а -:::" хотсутствует. Возможен:;;; .:. рах 25-35 С, темпер.-,туа 30 С. Оптимум рН 1 "- отсутствует, имеются с;-;:.;. i щие прогревание пои й", Способна использовать 4 к, сc.—;.- .-,:. венных источников углерода м фон среды Чапека): глюкозу.!.: —. . арабинозу, Л-рамнозу, Д эу, Д-маннит, инозит., сахаре:. Для субкультивироиа: и среду состава. г/л: ку;уруз -, - 20,0; глюкоза 10,0 «гa;;.. допроводная, рН 5Я. Для длительногг. Beauveria bassiana ; . :< .1 ют в течение 10 сут; = глюкоза 20,0; пепто - О,.,;: вода водопроводная; рН 5,(-:. : я ри приготавливают а; аровi, =- ди;. ром 4 мм и подвергают rpn. ; жидком азоте, используя в ка;,;, ротектора 20ф,-ный раствор глице; v;-стиллированной воде. 1822886 ции 1-бензоилпиперидина в количестве 100 мг/л и культивируют на качалке еще 24-96 ч. Биомассу отделяют фильтрованием через бумажный фильтр на воронке Бюхнера Фильтрат упаривают на роторном вакуумном испарителе при 50 С до 0,1 объема. Упаренную культуральную жидкость доводят до рН 7,0, добавляя 40$-ный раствор NaOH и экстрагируют горячим хлорофор35 мом в экстракторе для тяжелых жидкостей в течение 30 ч (экстрагировать можно и неупаренную культуралальную жидкость). Хлороформенный экстракт упаривают в вакууме досуха и остаток растворяют в небольшом (0,3-0,5 мл) количестве этанола.. 40 Выделение продуктов трансформации осуществляли с помощью флэшхроматографии на колонке силикагелем (Slflcagel 40/100, Chemapol ЧССР), используя систему растворителей гексан;этилацетат:метанол 10:10:2. Полученные соединения идентифицировали на основании физико-механиче ских и спектральных свойств; хроматографической подвижности, ВЭЖХ и масс-спектрального распада. Масс-спектры регистрировали на приборе Varlan МАТ-112S при энергии ионизации 80 эВ с прямым вводом вещества в 50 ионный источник. Оценку чистоты веществ и количественное определение осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографе "Милихром" с использованием ультрафиолетового детекто55 ра (Я 220 нм), скорость подачи злюэнта 100 /c t /мин; объем пробы 2/c I чувствительность Поставленная цель достигается выращиванием культуры Beauverla basslana BKVF-3ll ID на модифицированной среде Чапека, указанной ниже, в течение 96 ч при температуре 20-35 С, рН среды 5,0-7,0. 5 Предпочтительной температурой процесса является 28-30 С и рН 5,0. В табл.1 приведены существенные отличия предполагаемого изобретения от прототипа. Пример 1. Культуру Beauverla 10 BassIana BKMF-3IIID выращивают на качалке (200 — 220 об/мин) при 28-30 С в конических колбах на 750 мл, содержащих 100 мл модифицированной среды Чапека состава, г/л: сахароза 20,0; пептон 5,0; МайОз 2,0; 15 КН РОд 1,0; MgS04 7НгО 0,5; KCI 0,5; FeS04 0,01, вода дистиллированная, рН 5,0, Среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Укаэанную среду используют как для выращивания посевного материала, так и как 20 ферментационную среду для проведения трансформации. Посевной материал выращивают 48 ч и инокулум вносят в количестве 5 мл на 100 мл среды. Через 24 ч культивирования вносят субстрат для трансформа- 25 0,4; время измерения 0,6 с; скорость движения ленты самописца 720 мм/ч. Углы вращения измеряли на приборе ЕПО-1. В Н ИИпродмаш. Из 100 мг 1-бенэоилпиперидина получают 65,1 мг (60,2$) бензоил-4-гидроксипиперидина и 5,4 мг (4,9 (,) 1-бенэоил-3-гидроксипиперидина (табл.2), 1-бензоил-4-гидроксипиперидин: хроматографическая подвижность на силикагеле "Merk" Kleselgel 60 Его, Art 5554- Rt - 0,37; время удерживания ВЭЖХ вЂ” 225 с. Массспектр: М+ 205/30/, 204/50/, 183/3/, 187/5/, 186/8/, 160/4/, 149/4/, 105/100/, 100/8/, 78/4/, 77/55/. Здесь и далее даны m/z (интенсивность от максимального). /+/-1-бензоил-3-гидроксипиперидин: Яг 0,12, время удержания ВЭЖХ 87,5 с. Массспектр: М 205/16/, 204/28/. 188/6/, 187/8/, 186/5/, 177/3/, 176/6/, 160/2/, 149/4/, 148/8/, 134/6/, 105/100/, 100/20/, 78/4/ 77/64/. Угол вращения при 300 нм 1 а1зоо + 124,48 (с. 0,45, метанол). Иэ табл.2 видно, что реакция полностью проходит эа 72 ч и увеличение времени трансформации до 96 ч не приводит к увеличению выхода продуктов трансформации. Пример 2. Трансформацию.1-бенэоилпиперидина проводят аналогично примеру 1, при t = 28-30 С в течение 72 ч, но при разных значениях рН (см. табл.3), Из данных табл.3 видно, что увеличение или уменьшение рН среды не приводит к увеличению выхода продуктов трансформации, Наилучший выход продуктов наблюдается при рН среды 5,0. Пример 3. Трансформацию 1-бенэоилпиперидина проводят аналогично примеру! при рН среды 5,0 в течение 72 ч, но при разных температурах (см. табл.4), Из данных табл.4 видно, что процесс микробиологического окисления протекает при температуре от 20 до 35 С, но оптимальным является интервал 28-30 С, наиболее благоприятный для роста гриба и работы ферментн ых систем. Пример 4. Трансформацию цитральбензамида проводят аналогично примеру 1 при рН 5,0, температуре 28-30 С, но при различной длительности процесса (см. табл.5). Из данных табл.5 видно, что реакция полностью проходит за 72 ч и увеличение времени трансформации до 96 ч не приводит к увеличению выхода гидроксицитральбенэамида. Хроматографическая подвижность гидроксицитральбенэамида на силикагеле "Merk" Kleselgel 60 Fzw, Art 5554 - Rt - 0,40, Массспектр: М 273/25/. 232/40/, 214/15/. 187/100/, 152/55/, 134/9/, 77/50/. 1822886 Таблица1 Существенные отличия предлагаемого изобретения от прототипа П е агаемое иэоб етение П ототип С ественные отличия Beauverla Ьаззlапа ВМК F3111 Веацчег! а basslana АТСС 7159 Микроорганизм П кт, выхо П о кт выхо Т анс о ма ия 1-бензоил-4-гидроксипиперидин, 18ф, 1-бензоил=4 — гидроксипиперидин, 607ь; (+)1-бензоил-3-гидроксипиперидин 5ф„ +124,48 (с0,45 метанол) 1. 1-Бензоилпиперидин 0н! COPh C0Ph он 1 сОРй гидроксицитральбензамид, 0 2. Цитральбензамид сн, продукты отсутствуют H)NHCQPh CH NHC0Ph НО н,с сн, нс сн, сахароза 20,0; пептон 5,0; глюкоза 10,0; кукурузный экстракт 20,0; вода водопроводная, рН 5,0 Май Оэ-2,0; КН2Р 041,0;Mg SO4 7Н20-0,5; КС10,5;FeSO4 -0,01 вода дист., Н50 1. Оптимальная среда для роста и трансформации.г/л Складчатая 2. Поверхность колонии 3. Способ выделения Бугристая а ораторный загрязнитель араэит колорадского жука Пример 5. Трансформацию цитральбензамида проводят аналогично примеру 1 при t = 28-30 С в течение 72 ч, но при разных значениях рН (см. табл.6). Иэ данных табл.6 видно, что увеличение или уменьшение значения рН не приводит к увеличению выхода продукта; наибольший выход продукта наблюдается при рН 5,0. Пример 6. Трансформацию цитральбензамида проводят аналогично примеру 1 при рН среды 5,0 в течение 72 ч, но при разных температурах (см. табл.7). Из данных табл.7 видно, что процесс микробиологического окисления протекает при температуре от 20 до 35 С, но оптимальной является температура 28-30 С, наиболее благоприятная для роста и работы ферментных систем, Выделен новый штамм Beauverlu basslana (BKMF-3lID). В отличие от известного хорошо изученного штамма В.Ьазз1апя АТСС 7159 он более эффективно гидрокси5 лирует 1-бензоилпиперидин (выход 1-бен.эоил-4-гидроксипиперидина составляет . 607ь, для Beauverla Ьазз1апа АТСС 7159-18ф,), кроме того образуется еще и оптический активный 3-гидроксиизомер. Штамм поэволяе10 также расширить спектр применения субстратов для трансформации. Впервые показано, что грибы этого рода гидроксилируют терпены - цитральбензамид. Формула изобретения 15 Штамм гриба Seauverla basslana Ва!з В KMF-311110 в качестве трансформатора для гидроксилирования 1-бензоилпиперидина и 1-бензоиламино-3,7-диметилоктадие на-2,6. 1822886 Таблица2 ТаблицаЗ Выход продуктов трансформации 1-бензоилпиперидина в зависимости от рН среды (t -2830 С; время 72 ч) Выход продуктов трансформации 1-бензоилпиперидина в зависимости от времени процесса(pH 5,0; t-28-30 С) 14 1822886 Таблица Выход продуктов трансформации 1-бензоилпиперидина в зависимости от температуры проведения процесса (рН 5,0; время 72 ч) Та бл ица . Таблица(Выход продукта трансформации цитральбензамида в зависимости от рН среды (t-28— 30 С; время 72 ч) Выход продукта трансформации цитральбензамида в зависимости от времени процесса (pH 5,0; т-28 — 30 С) 1822886 16 Таблица7 Составитель И.Паршикова Техред М.Моргентал . Корректор М.Ткач Редактор М.Кузнецова Заказ 2174 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Ра шская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Выход продукта трансформации цитральбензамида в зависимости от температуры проведения процесса (рН 5,0; время 72 ч) 
