Способ получения пролактина человека из гипофиза

 

Способ получения пролактина человека из гипофизов, используемый при создании и производстве медицинских иммуноэналитических наборов реагентов для измерения уровня пролактина с целью диагностики и контроля эффективности лечения эндокринных заболеваний. Целью изобретения является повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Это достигается способом выделения пролактина из свежезамороженных гипофиз, который включает кислую водную экстракцию гликопротеинов и других побочных белков, продолжительную духстадийную щелочную экстракцию пролактина, очистку пролактина из щелочного экстракта, колоночной хроматографией на анионообменнике, катионообменнике и гельфильтрацию. Новым в способе является полный отказ от использования органических растворителей в сочетании с применением двухстадийной процедуры щелочной экстракции ткани, которая включает 15-минутную экстракцию 0,1 н. NaOH при 35° и следующую за ней длительную экстракцию в течение 15-17 ч при рН 9,5 и температуре 4°С. Способ может также найти применение при научных исследованиях строения и свойств пролактина человека. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5I)S А 61 К 35/30

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

° °

ыи

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4874250/14. (22) 16.10,90 (46) 15,07.93. Бюл. М 26 (71) Институт экспериментальной эндокринологии Всесоюзного зндокринологического научного центра (72) А,А.Булатов и А.В.Мартынов (56) J,Endocrinology, Suppl„1985, р. 71, 104. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОЛАКТИНА

ЧЕЛОВЕКА ИЗ ГИПОФИЗОВ (57) Способ получения пролактина челОвека из гипофизов, используемый при создании и производстве медицинских иммуноаналитических наборов реагентов для измерения. уровня пролактина с целью диагностики и контроля эффективности лечения эндокринных заболеваний, Целью изобретения является повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Это доИзобретение относится к области медицины, а именно, к получению белкового гормона человека пролактина, входящего в качестве ключевого реагента в иммунохимические аналитические системы для количественного определения этого гормона. Оно может быть использовано в медицине при создании и производстве наборов реагентов для определения концентрации пролактина в крови и других биологических жидкостях с целью диагностики и при контроле за ходом лечения эндокринных заболеваний.

Цель изобретения — получение пролактина человека с сохранением его нативных иммунологических свойств и с высоким выходом, что обусловливает высокое качество

». Ж, 1827256 А1 стигается способом выделения пролактина из свежезамороженных гипофиз, который включает кислую водную экстракцию гликопротеинов и других побочных белков, продолжительную духстадийную щелочную экстракцию пролактина, очистку пролактина из щелочного экстракта, колоночной хро- матографией на анионообменнике, катионообменнике и гельфильтрацию. Новым в способе является полный отказ от использования органических растворителей в сочетании с применением двухстадийной процедуры щелочной экстракции ткани, которая включает 15-минутную экстракцию

0,1 í. NaOH при 35 и следующую за ней длительную экстракцию в течение 15-17 ч при рН9,5итемпературе4 С. Способможет также найти применение при научных исследованиях строения и.свойств пролактина человека. 1 табл.

° аиаааж 00 и уменьшение стоимости диагностических ) систем иммуноанализа этого гормона..

Цель достигается применением нового способа выделения пролактина, в котором полностью исключается использование органических растворителей и применена новая процедура щелочной экстракции.

Сеежезамороженные гииофизы гомогени- ) а зируют и извлекают из них гликопротеины и а балластные белки путем духкратной экстракции кислым буферным раствором без использования этанола. Из остатка ткани, который не высушивают ацетоном. как в прототипе, получают щелочной экстракт.

Для этого ткань экстрагируют в течение 15 минут 0,1 н раствором NaOH при 35, а затем быстро охлаждают смесь, закисляют до

1827256 рН 9,5 соляной кислотой и, в отличие ат прототипа, экстракт не отделяют, з продолжают экстракцию в течение 15-17 часов при температуре 4, то есть в более мягких условиях. Экстракт отделяют, а содержащийся в нем пролактин подвергают очистке путем ионообменной хроматографии и гельфильтрации, так же как эта делается в способепрототипе.

Заявляемый способ выделения пролактина человека имеет существенные отличия от прототипа и других аналогичных способов, поскольку новая совокупность примененных в нем приемов позволяет увеличить выход и улучшить качество конечного продукта. В серии из трех выделений заявляемым способом выход пролактина составил

12-57 мкг на 1 гипофиз (в прототипе 8-35 мкг) при активности 48-80 ME!ìã (в прототипа 25-35.6. МЕмг). Таким образом, наибольшая величина удельной иммунологической активности пролактина, получаемого заявляемым способом, в два разз превосходит величину иммунорезктивности лучших препаратов пролактина, получаемых в настоящее время другими способами и используемых в лучших мировых образцах иммунахимических аналитических систем (7, 8).

Пример 1, Выделение пролактина заявляемым способом.

Заморожен йые гипофизы человека (секционный материал) в количестве 122 штук, 61 r, гамогенизировали в 0,15 М цитратфосфатнам буфере, рН 4.0, а затем, доводили объем до 0,8 л и перемешивали гомогенат в том же растворе 30 мин при температуре 4 .

Экстракт отделяли путем центрифугиравания. з осадок экстрагировали повторно, кзк в первый раз. Осадок после отделения второго кислого экстракта суспендиравали в

450 мл воды, подогретой да 35О, добавляли

50 мл 1 í NaOH и перемешивали при 35 е течение 15 мин; Смесь затем быстро охлаждали, падкисляли до рН 9,5 с помощью HCI, добавляли в нее ингибитор пратеаз фенилметилсульфонилфторид да концентрации

0,15 мМ и оставляли до следующего дня на

15-17 ч в холодной комнате при температуре 4 при перемешивзнии магнитной мешалкой. Осадок отделяли ат щелочного экстракта путем центрифугирования и дважды промывали порциями па 50 мл Gyфернаго раствора 10 мМ Трис-HCI, 100 мМ

NaCI. рН 8,5 с последующим центрифугировзнием, Три порции щелочного экстракта объединяли, доводили рН смеси до 8,5 с помощью НО и сразу же наносили на колонку (2,6к90) см с ДЭАЭ-Сефарозай CL68 (Фармция, Швеция), уравновешенную тем

4 же раствором. Элюцию колонки проводили до полного исчезновения белка в элюате.

Фракции, содержащие максимальное количество иммунологически активного пролактина, объединяли, разбавляли в 2 раза водой и наносили после доведения р Н да 5,6 на колонку (1,6х15) см с карбоксиметилцеллюлозой СМ,23 (Ватман, Великобритания), уравновешенную 10 мМ ацетатом аммония, "0 рН 5,6. Колонку с сорбированным пролактином промывали последним из указанных буферов с добавлением 50 мМ NaCI. Затем элюиравали пролактин 0,1 M бикарбанатом аммония при скорости тока 20 мл/час. Элю"5 ат, содержащий пролактин, концентрировали до объема 10 мл при помощи погружаемаго ультрафильтрацианного патрона СХ 10 (Миллипор, США) и наносили на . колонку(2,5x90) см с Сефадексом 6 100 "су-.

20 перфайн" (Фармаци, Швеция). Элюцию колонки проводили восходящим током 0,1 М . бикарбоната аммония при скорости 8 мл/час. Фракции, содержащие пик иммунореактивного пролактина, объединяли. В ко25 нечный продукт, имеющий концентрацию белка 0,25 мгlмл добавляли сахарозу из расчета 50 мг на 1 мг белка, после чего продукт аликватировали и хранили в замороженном состоянии. Концентрацию белка в процессе

30 выделения и в конечном продукте определяли спектрофотаметрически паи длине Bollны 280 нм, принимая, что А1 для 1 г/л=1.

Конечный выход продукта составил 7 мг или

57 мкг. в расчете на 1 гипафиз. Исследование

35 препарата методом электрафореза в полиакриламиднам геле с окраской белка серебром (12, 13) и иммунаблатингам (14) не выявило в препарате присутствия иных белков, кроме иммунареактивного пролактина.

40 Иммунореактивность препарата исследовали с помощью двух различных радиоиммунолагических систем: набором реагентов фирмы Фармос Диагностика (Финляндия) (7) и тест-системы Всемирной организации

45, здравоохранения. 8 обеих системах были получены одинаковые результаты. Выход иммунологически активного пролактина составил 560 МЕ (из 122 желез) при удельной иммунологической активности 80 МЕ/мг

50 белка.

Пример 2. Выделение пролактина заявленным способом, В опыт взято 120 свежезамороженных гипофиза общим весом 74 г. Дальнейший

55 хад выделения не отличается от описанного в примере 1. Величины поэтапного выхода белка и иммунареактивнага пралактина приведены в таблице 1, Конечный выход продукта — 4,5 мг. то есть 37,5 мкг на 1 гипофиз. Концентрация белка в конечном

1827256 продукте — 0,22 мг/мл (A1<> . Величина гво иммуологической активности конечного продукта — 48,0 МЕ/мг белка.

Пример выделения пролактина способом-прототипом.

Свежезамороженные гипофизы в количестве 1000 штук весом 525 r гомогенизировали при 4 порциями по 200 штук в смеси

107, ацетата аммония. рН 5,1 и абсолютного зтанола в соотношении 60;40. Объем смеси

1 л. Порции гомогената обьединяли и оставляли, перемешивая, на ночь в холодной комнате. Утром следующего дня осадок отделяли центрифугированием или фильтрованием через бумагу, заливали его 0,5 л свежей смеси ацетата аммония с этанолом и продолжали экстракцию 2 часа при перемешивании и охлаждении. Осадок вновь отделяли и промывали на фильтре 0;5 л этанола. Спирт после промывки осадка обьединяли с двумя порциями аммонийноспиртового кислого экстракта и сохраняли для выделения гонадотропинов, Осадок обезвоживали на фильтре путем промывки восемью порциями по 0,5 л холодного ацетата и высушивали при комнатной температуре на бумаге в вытяжном шкафу. Вес сухого осадка 87,3 г.

Для выделения пролактина 10 r сухого осадка, что соответствует примерно 114 гипофизам, суспендировали в 450 мл воды, подогретой до 35О, добавляли 50 мл 1 и

Na0H и экстрагировали при 35 15 мин.

Затем смесь быстро охлаждали на льду, одновременно подкисляя ее соляной кислотой до рН 9;5, центрифугировали и доводили надосадочную жидкость (щелочной экстракт) до рН 8,5. Осадок дважды промывали порциями по 50 мл буферного раствора 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCI, рН 8,5, добавляли ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид до 0,15 мМ и сразу накосили на колонку (2,6х90) см с ДЭАЭ-Сефарозой С

6В. Дальнейший ход выделения пролактина не отличался от описанного в примере 1.

Величины поэтапного выхода общего белка и иммунорективного пролактина приведены в таблице 1. После гельфильтрации получено 158 мл раствора белка с концентрацией 0,18 мг/мл (A1g г - 1,1 мг/мл).

Пргпарат сконцентрирован с помощью пат5 рона СХ 10 до концентрации белка 0,2 мг/мл. Выход пролактина составил 2,84 мг или 24,9 мкг на 1 гипофиз. Иммунологическая зктивмость — 29,7 МЕ/мг белка, Постадийный выход общего белка и

10 иммунореактивного пролактина при выделении пролактина из свежезамороженных гипофизов способом-прототипом и заявляемым способом в расчете на 1 гипофиз.

Предлагаемый способ получения про15 лактина человека обладает следующими ..техника-экономическими преимуществами по сравнению с прототипом и аналогами:

1) повышается качество целевого продукта, так как получается пролактин, имею20 щий более высокую удельную иммунологическую активность;

2) повышается эффективность выделения, поскольку увеличивается конечный выход гормона в расчете на 1 гипофиз;

25 . 3)обеспечиваетсясозданиеболеевысококачественных иммуноаналитических диагностических наборов при уменьшении их стоимости.

ЗО Формула изобретения

Способ получения пролактина человека

35 из гипофиза, включающий измельчение свежезамороженного сырья, гомогенизацию в кислой среде, отделение остатка ткани, его экстракцию в NaOH при 35 С в течение 15

40 мин, охлаждение смеси, подкисление ее до рН 9,5, центрифугирование, доведение рН экстракта, содержащего целевой продукт. до 8,5с исследующей его очисткой хроматографией, отлича кующий ся тем, что,с целью

45 повышения выхода и специфической активности целевого продукта, перед центрифугированием смеси в нее добавляют ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид до концентрации 0,15 мм и перемешивают 1550 17 ч при 4оС

1827256

М выделения, В щелочном колич. гипо, экст акте

После ДЭАЭ- После CM - цел- После гельфильСе а озы люлозы таии

Способ-и ототип

3,900 мг

4,86 ME

51 мг

5,14 МЕ

0,129 мг

2,53 МЕ

114 гипофизов

39,Фрпофизов

0,500 мг

2,460 МЕ

53 мг

4,97 МЕ

3,86 мг

4,290 ME

4,100 мг

4,400 МЕ

47 мг

4,63 ME

0,142 мг

2,100 ME

119 гипофизов аявленный способ

4,188 мг

5.220 ME

0,130 мг

3,68 МЕ

55 мг

6,540 МЕ

122 гипофиза

0,119 мг

3,43 МЕ

3,87 мг

4;83 МЕ

49,7 мг

5,890 МЕ

120 гиппофизов

59,6мг

6,95 МЕ

0,134 мг

3,78 МЕ

4,400 мг

5,45 ME

125 гипо изов

Редактор

Заказ 2338 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рэушская наб., 4/5

Производственно-изДательский комбинат Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Составитель А;Мартынов

Техред М.Моргентал Корректор M.Ткач

0,025 мг

0,839 ME

33,7 МЕ/мг

0,031 мг

0,980 ME

31,4 МЕ/мг

0,030 мг

0,431 ME

14 45 МЕ/Mr

0,057 мг

4,59 МЕ

80,5 ME/ìã

0,042 мг

2,00 МЕ

48,1 МЕ/мг

0,038 мг

1,425 МЕ

38,0 МЕ/мг