Способ получения диагностического агента для определения протромбинового времени
Использование: для оценки состояния системы свертывания крови. Цель: повышение экономичности способа. Способ изобретения: цельный кадаверный мозг измельчают и обрабатывают ацетоном. Экстрагирование проводят поэтапно. Вначале порошок суспендируют в дистиллированной воде, а затем образовавшуюся водную суспензию гомогенизируют в проточном режиме при скорости 0,2 л/мин. К полученному экстракту добавляют стабилизатор и смесь лиофилизируют. Положительный эффект: активность диагностического агента сохраняется в течение не менее 1 года при + 6o в лиофилизате. Способ высокоэкономичен за счет упрощения технологической схемы, сокращения времени его проведения и рационального использования исходного сырья.
Изобретение относится к медицинской и микробиологической промышленности, касается способа получения диагностического агента для оценки состояния системы свертывания крови, в частности для определения протромбированного времени. Известен способ получения диагностического агента для определения протромбированного времени (ДА), включающий следующие этапы. Получение ацетонового порошка кроличьей мозговой ткани. Получение экстракта, содержащего тромбопластин, путем обработки кроличьего мозга или легких смесью, содержащей глицин, уксуснокислый натрий, уксусную кислоту, а также метанол в соотношении 1:19. Получение активирующей субстанции из лошадиной крови путем ее обработки гепарином, удаления протромбина, ступенчатого фракционирования смесью этанола и метанола в ацетатном буфере pH 4,6 для удаления альбумина и 
-глобулинов. Объединение выделенных по пп. 1-3 веществ, их растворение в 0,85% растворе хлористого натрия, добавление хлористого кальция, центрифугирование и лиофилизация. Существенным недостатком данного метода является многостадийность получения отдельных компонентов, сложность выделения активирующей субстанции из лошадиной крови, а также полное отсутствие ее характеристики, препятствующее получению воспроизводимых результатов. Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является способ приготовления диагностического агента для измерения коагулируемости крови. Способ включает следующие операции: Отмывка тромбогенной ткани от крови 0,9% NaCl, измельчение и центрифугирование. Приготовление водной суспензии, гомогенизация 10 мин при 10оС и подщелачивание 5N NaOH до pH 10-12. Экстракция водной суспензии, причем продолжительность обратно пропорциональна температуре. Подкисление 5 HCl до слабощелочного pH с повторной гомогенизацией 10-30 мин при охлаждении. Отделение экстракта от ткани центрифугированием. Введением стабилизирующих добавок: манитола или сорбитола, а также дезоксихолевой кислоты и солей марганца и цинка. Подкисление смеси до pH 6,3. В зависимости от источника, активность ДА по Квинту для прототипа составляет 16,5 с (из мозга кролика), 10,2 с (из легких кролика), 27,1 с (из плаценты свиньи), а при разбавлении в 10 раз 111,2, 52,5 и 210,0 с соответственно. Препарат стабилен в течение 2 лет при +4оС. Существенным недостатком известного способа является его трудоемкость, использование только части тромбогенной ткани мозга (серого вещества), необходимость добавления детергента для солюбилизации целевого продукта. Целью настоящего изобретения является повышение экономичности способа получения ДА для определения протромбинового времени. Это достигается благодаря сокращению технологической схемы: исключением таких операций, как трехкратное регулирование pH, вторичная гомогенизация, двухкратное центрифугирование. Поставленная цель достигается тем, что в качестве тромбогенной ткани используется цельный кадаверный мозг, избыток нейтральных липидов удаляется промывкой ацетоном, экстракцию проводят поэтапно дистиллированной водой с дезинтеграцией в проточном режиме, продукт разбавляют буферным раствором, содержащим стабилизирующие добавки и лиофилизируют. Существенным отличительным признаком является использование в качестве источника ДА цельного кадаверного мозга, что значительно упрощает первичную его обработку и способствует повышению выхода целевого продукта. Вторым отличием является проведение экстракции ДА дистиллированной водой, способствующее более полному разрушению гидрофобных связей и переходу тромбопластиновый везикул в жидкую фазу. Третьим отличием является применение дезинтегратора ФУГ-1М в проточном режиме для получения тромбопластиновых везикул оптимальной величины, что также способствует их стабилизации и повышению активности препарата. Четвертым отличием является добавление криопротектора, предотвращающее образование нерастворимых агрегатов тромбопластиновых везикул при замораживании в процессе лиофилизации, а также продлевающее время использования рабочего раствора. В отличие от прототипа, с этой целью используется лактоза или декстран с молекулярной массой 60
10 кДа. Кроме того, вместо соли цинка или марганца используется хлористый магний, а вместо подкисления препарата перед лиофилизацией, препарат разбавляют 0,005 М вероналовым буфером pH 7,5-7,9. П р и м е р 1. Кадаверный мозг промывают водой, удаляют кровеносные сосуды и оболочки, измельчают и лиофилизируют. Берут навеску 11 г, подвергают трехкратной экстракции ацетоном в соотношении 1:8,1:7 и 1:5. Полученный таким образом сухой ацетоновый порошок (10 г) суспензируют в 0,2 л дистиллированной воды, размешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, обрабатывают на дезинтеграторе ФУГ-1М при температуре +6оС со скоростью протока 0,2 л/мин, разбавляют в 20 раз 0,005 М вероналовым буфером pH 7,3, содержащим 0,005 М MgCl2, фильтруют сквозь хлопчатобумажную ткань и добавляют раствор лактозы в том же буфере до конечной концентрации 0,1 М. Выход лиофильно высушенного препарата составляет 2,3
104 измерений, активность 16-20 с по Квику. П р и м е р 2. 25 г ацетонового порошка кадаверного мозга, приготовленного как приведено в примере 1, суспендируют в 1 литре дистиллированной воды, экстрагируют и дезинтегрируют, как в примере 1, камеру дезинтегратора в том же рабочем режиме промывают 1 л 0,01 М вероналового буфера pH 7,9, содержащего 0,01 М MgCl2, фильтруют, разбавляют в 2,5 раза 0,005 М вероналовым буфером pH 7,5, содержащим 0,005 М MgCl2, добавляют раствор декстрана с молекулярной массой 6010 кДа до конечной концентрации по Квику 12-16 с. Активность диагностического агента, получаемого предлагаемому способу, составляет 12-22 с по Квику и сохраняется в течение не менее 1 года при +6о в лиофилизате и не менее 1 мес при -15оС в растворе. Полученный диагностический агент пригоден для определения протромбинового времени и вычисления протромбинового индекса по Квику, о чем свидетельствует прилагаемый акт клинических испытаний. Обладая оптимальным сочетанием активности и скорости свертывания, диагностический агент по предлагаемому способу выгодно отличается от прототипа тем, что протромбиновое время сохраняется на том же уровне и после разведения в 20 раз, в то время как при разведении в 10 раз препаратов по прототипу время свертывания продлевается в 5-8 раз.
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АГЕНТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ, включающий измельчение мозговой ткани, экстрагирование целевого продукта, последующую его стабилизацию введением стабилизирующих добавок и лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения экономичности способа, предварительно измельченную мозговую ткань обрабатывают ацетоном, экстрагирование осуществляют поэтапно, при этом вначале полученный порошок суспендируют в дистиллированной воде, а затем образовавшуюся водную суспензию гомогенизируют в проточном режиме при скорости 0,2 л/мин.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Номер и год публикации бюллетеня: 31-2000
Извещение опубликовано: 10.11.2000
