Способ получения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного hiy

 

Область использования: вирусология. Сущность изобретения: предлагается неиноекционный иммуноген, содержащий реровирусные частицы, лишенные белков наружной оболочки, или содержащий выбранные антигены, выделенные из ретровируса. Также предлагается вакцина, эффективная против HIV. В одном варианте осуществления изобретения иммуноген пригоден для иммунизации индивидуума, ранее зараженного ретровирусом, включая HIV. с тем. чтобы индуцировать иммунозащитные факторы, защитные против развития заражения. Иммуноген может также использоваться для получения антител для пассивной иммунотерапии как таковой или в сочетании с активной иммунотерапией, у индивидуумов, зараженьых ретровирусом, включая HIV, предпочтительно тех индивидуумов , которые проявляют низкие уровни антител к продуктам ретровирусного гена иным, нежели наружная оболочка. 3 ил., 1 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 А 61 К 39/12

НОЕ ПАТЕНТНОЕ

CCP сс Р) - Ы".)Щ@фд - ©

АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПАТЕНТУ

1) 4613460/13

6) РСТ/US 88/01955 (09.06.88)

2) 08.02.89

6) 30.08.93. Бюл. N 32

1) 200752

2) 31.05.88

3) US

1) Дзе Имьюн Респонс Корпорейшн Инк.

S)

2) Джонас Салк и Деннис Дж.Карло (US)

4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕНА, ТИМУЛИРУЮЩЕГО ИММУННУЮ СИСТЕУ ЧЕЛОВЕКА, ЗАРАЖЕННОГО HIV

7) Область использования; вирусология. ущность изобретения: предлагается неинекционный иммуноген, содержащий реровирусные частицы, лишенные белков аружной оболочки, или содержащий выИзобретение относится к борьбе с реровирусами, более конкретно к способу олучения иммуногена, стимулирующего ммунную систему человека, зараженного;

IV.

Цель изобретения — создание высокоффективного средства для борьбы с ретроирусами, преимущественно ретровирусом

IV.

Поставленная задача решается предлааемым способом получения стимулируюего иммунную систему человека, араженного HIV, заключающимся в том, то зараженные HIV клетки выращивают в реде РРМ 1640 в присутствии эмбриональой сыворотки крупного рогатого скота, 5-супернатант фильтруют, к фильтрату обавляют/3-пропиолактон и инкубируют в ечение 5 часов при 37 С и рН среды 7,2 — 7,4, осле чего замораживают, облучают гам!

Ж. „1837890 Al бранные антигены, выделенные из ретровируса. Также предлагается вакцина, эффективная против HIV. В одном варианте осуществления изобретения иммуноген пригоден для иммунизации индивидуума. ранее зараженного ретровирусом, включая

HIV, с тем, чтобы индуцировать иммунозащитные факторы, защитные против развития заражения. Иммуноген может также использоваться для получения антител для пассивной иммунотерапии как таковой или в сочетании с активной иммунотерапией, у индивидуумов, заражен1.ых ретровирусом, включая HIV, предпочтительно тех индивидуумов, которые проявляют низкие уровни антител к продуктам ретровирусного гена иным, нежели наружная оболочка. 3 ил., 1 табл. ма-лучами, размораживают, концентриру- . ют, пропускают через миллипоровые полисульфоновые фильтры, очищают вначале центрифугированием с 30%-ной сахарозой, затем центрифугированием в градиенте 30—

45%-ной сахарозы, а це . soA продукт получают ресуспендированием полученного осадка в PBS буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.

На фиг. 1 представлена схематическая модель HIV.

Как показано на фиг.2, геном РНК HIV кодирует три основных структурных гена:

g3g, ро! и епч, которые фланкированы на обоих концах длинными концевыми дупликациями (LTR). Ген gag кодирует специфические белки ядра, р55, р39, р24, р17 и р15.

Гены pol кодируют обратную транскриптазу р65/р51 и протеазу р31, Гены епч кодируют гликопротеин наружной мембраны gp 120 и

1837890

10 его предшественник gp 160, а также трансмембранный гликопротеин gp41. Некото.рые из генов являются черезвычайно вариабельными, в частности, гены env.

Кроме того, существуют пять других генов, не присутствующих в других ретровирусах, которые либо вовлечены в транскрипционную или трансляционную регуляцию, либо кодируют другие структурные белки, Структура гена HIV известна.

Она описана Ратнером и др. Nature, 313, стр.277 (1985).

НИ присоединяется к клеткам хозяина путем взаимодействия мембранных гликопротеинов с поверхностным рецептором клетки, Оказывается, что при контакте HIV с клеткой Т4 протеин gp120 взаимодействует с рецептором CD4. Вирусная оболочка затем слияется с клеточной мембраной, и внутреннее ядро вируса входит в зараженную клетку, где транскрипция PHK в вирус

ДНК катализируется обратной транскриптазой. Провирус может оставаться в клетке в латентной форме в течение нескольких месяцев или лет, и все это время зараженный индивидуум является бессимптомным. Однако, если вирус позднее активируется, вызывая вирусную репликацию и иммуносупрессию, индивидуум будет затем восприимчив к условно-патогенным заражениям, включая рак, ассоциируемым со спидом.

На фиг. 3 представлено схематическое воспроизведение уровня некоторых антител и антигенов, присутствующих в развитии из бессимптомного состояния до состояния ARC (связанный со спидом комплекс) и до спида у НИ вЂ” сероположительных пациентов, зараженных HIV.

Результаты анализа.по Вестерну иммуногена по примеру 1 показывают, что он свободен от белков наружной оболочки при скрининге гомологичными и гетерологичными сыворотками, которые содержат высокие титры антитела против белков наружной оболочки.

Как показано схематически на фиг.3, высокие уровни антитела против gp 160/120 (наружная оболочка), которые присутствуют в бессимптомной фазе заражения HIV, также продолжают существовать в симптом ной фазе. Уровень антитела р24 в бессимптомной фазе является высоким, но, по-видимому, снижается в симптомной фазе.

Аналогично, HIV — сероположительные сыворотки содержат антитело, которое ингибирует функцию обратной транскриптазы, У пациентов, в которых антитело против обратной транскриптазы присутствует на высоких уровнях, попытки относительно выделения вируса менее часта положительны, нежели у тех, в которых оно отсутствует.

Поэтому следует, что уменьшение клеточных и гуморальных иммунозащитных факторов, таких, как Т4-клетки и антитела против

GAG, включая анти-р24, и антитела против

pol, включая а нтитело и роти в обратной транскриптазы, связано с развитием HIL до спида.

Используемый термин "HIV" включает типы 1 и 2 и является синонимом HTLV — III, LAY-1 и LAV-2. HIV относится к вирусу в общем смысле и включает все формы, подтипы и вариации.

Используемый термин "белок наружной оболочки" относится к той части мембранного гликопротеина ретровируса, которая выступает за пределы мембраны, в противоположность трансмембранному белку, gp41. Белок наружной оболочки HIV является синонимом gp120 и его предшественника

gp160, Используемый термин "gp120" или

"gp160/120" относится к гликопротеинам, имеющим либо антигенную специфичность, либо биологическую функцию белка наружной оболочки; gp160, как полагают, является предшественником gp120.

Используемый термин "генный про дукт" относится к полипептиду или белку, который кодируется геном. Термин, как предполагают, включает в себя белковые производные, такие, как гликопротеины.

Понятно, что в аминокислотную последовательность генного продукта могут быть внесены ограниченные модификации без нарушения биологической функции или иммуногенности генного продукта, и только часть первичной последовательности может потребоваться для иммуногенности.

Идентификация HIV — специфических генов и генных продуктов основана на терминологии HIV типа 1, представленной на фиг.1. Предполагается, однако, что ссылка на специфический ген или генный продукт

Н!Ч типа 1, на основе его молекулярной массы, будет также включать соответствующий ген или генный продукт HIV . типа 2 и, когда присутствует гомологичный ген, другие ретровирусы. Генные продукты других типов и родов могут иметь незначительно отличающиеся молекулярные массы. Например, gp41 Н1Ч типа 1 эквивалентен gp36 типа 2, тогда как gp120 типа 1 соответствует gp130 типа 2.

HIV можно культивировать из пробы периферической крови зараженных индивидуумов. Например, одноядерные клетки из периферической крови, такие, как лимфоциты, могут быть получены путем наслоения

1837890

10

20

30

40 данной области

55 и обы гепаринизированной венозной кров по градиенту плотности Ficoll-Hypaque u ц нтрифугировэния пробы. Одноядерные .к етки затем собирают, активируют, наприер, фитогемэгглютинином, в течение двух— т ех дней и культивируют в подходящей с еде, предпочтительно пополненной инт рлейкином 2. Вирус может быть обнаруен либо анализом на обратную т анскриптээу, анализом с захватом антигена для р24, иммунофлюоресценцией, либо э ектронной микроскопией для обнаружения присутствия вирусных частиц в клетках. се эти методы хорошо известны специалис ам в данной области. После выделения в рус может быть включен в другие клетки.

Важно использовать неинфекционную в кцину с тем, чтобы избежать проникновеия инфекции в хозяина, Различные методы х роша известны для придания болезнет орному организму неинфекционности. ирус можно инактивировать или сделать епликационно-недостаточным. Предпочт тельно, однако, обрабатывать его комбиацией бета-пропиолактона и

r мма — излучения. При этом Р-пропиолакт н должен находиться в контакте с вируом, как минимум, 2,5 часа. С тем, чтобы олностью удалить какой-либо остаточный ета-пропиолактон, бета-пропиолактон олжен оставаться в растворе в течение, как инимум, пяти часов при температуре 37 С.

Выделенный .вирус затем обрабатыват так, чтобы удалить белки наружной обоочки. Такое удаление предпочтительно существляют неоднократными заморажианием и оттаиванием вируса в сочетании с изическими методами, которые вызывают абухание и сокращение вирусных частиц, отя также можно испольэовать другие фиические и нефизические методы, такие, как азрушение ультразвукОм, в отдельности ли в сочетании друг с другом.

Для иммунизации человека или живоного получаемый предлагаемым способом ммуноген применяется вместе со всоомоательными веществами. Но он можеттакже рименяться в своей водной форме без спомогательного вещества. При этом дозу

ыбирают так, чтобы она была иммунологиески эффективной, и она, как правило, сотавляет от 1 до 100 мкг белка, редпочтительно, около 30 мкг белка.

Активную иммунизацию осуществляют, предпочтительно, повторяют раз с миниальным интервалом, по меньшей мере, 90 ней, хотя дополнительные ревакцинации агут подходить в соответствии с измененими в уровне иммунной активности на осное, например, уменьшения количества антител против НИ-генным продуктам, другим, нежели белки наружной оболочки, Такую иммунизацию предпочтительно осуществляют первоначально путем внутримышечной инъекции с последующей внутрикожной инъекцией, хотя может быть использована любая комбинация внутрикожной и внутримышечной инъекции.

Предпочтительно иммунокомпетентность или иммунную активность сероположительного индивидуума определяют перед иммунизацией с тем, чтобы определить подходящий путь лечения. В качестве метода такого определения сыворотки пациентов подвергают скринингу на присутствие антител против р24 (например, при помощи иммуноферментного твердофазного анализа), антитела против обратной транскриптаэы и/или уровня клеток Т4 при помощи хорошо известных методов. Пациенты, проявляющие индикаторы низкой иммунокомпентентности, например, низкие титры р24 или антитела против обратной транскриптазы или низкие количества клеток Т4, являются подходящими кандидатами для пассивной иммунотерапии, предпочтительно в сочетании (проводимой перед или совместно) с активной иммунизацией.

Серонегэтивные индивидуумы могут быть вакцинированы с Tf м, чтобы вызвать иммуноэащитные факторы для предотвращения инфекции. Предпочтительно, вакцину вводят первоначально путем внутримышечной инъекции с последующим введением бустера, осуществляемым либо внутримышечно, либо внутрикожно. Физиологически эффективная доза содержит предпочтительно от 1 до 100 мкг, и более предпочтительно, около 30 мкг иммуногена.

Вакцину предпочтительно вводят в сочетание с адъювантом, т.е. вспомогательным веществом, наиболее предпочтительно, адъювантом для обеспечения получения препарата типа "вода в масле". Различные подходящие адъюванты хорошо известны в

Кроме того, поскольку антитела против

gp160/120 могут содействовать вирусной абсорбции клетками, эти специфические антитела могут быть удалены из пациента, зараженного HIV, перед иммунотерапией.

Иммуносорбентные колонки, выполненные из полых целлюлозных волокон, модифицируют с тем, чтобы ковэлентно связать лиганды, реакционноспособные с антителами против 9р160/120. Такие лиганды включают антигены др160/120, полученные из очищенных гликопротеинов, которые в свою очередь получены из только что собранных вирусных частиц или из культурального су1837890 триевом буфере

35

50 пернатанта HI V-продуцирующих Т4- лимфоцитов, Альтернативно, такие лиганды могут быть получены методами рекомбинантной

ДН К с использованием трансфецированных клеток. Альтернативно, идиотипы, рекционноспособные с антителами против

gp160/120, могут быть использованы для этих целей.

Такие анти-идиотипные антитела могут быть получены методами, хорошо известными в данной области.

Пример 1, Получение вирусных частиц. свободных от белков наружной оболочки.

Клетки, зараженные штаммом HIV No

Hz 321 (выделившимся из плазмы 26-летней африканской женщины из Саира), выращивают в среде А, состоящей из RPMI 1640 с

10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 25 мМ буфера НЕРЕ$, 50 мкгlмл гентамицина и 100 мгк/мл стрептомицина.

Культуры увеличивают в объеме путем подачи исходных клеток в центрифужные пробирки и доведения объема приблизительно до 8 л добавкой предварительно нагретой среды А. При этом степень разведения составляет приблизительно 1;5.

Затем осуществляют второе разведение в соотношении 1:3. Супернатант от 5 — 7-дневной суспензии HlV-зараженных клеток фильтруют через фильтр размером 0,45 мкм.

Свежеприготовленный раствор 1:40 бетапропиолактона прибавляют к супернатанту до конечной концентрации 1;4000. Раствор инкубируют в течение пяти часов при температуре 37. С и рН поддерживают на уровне

7,2-7,4, Через 5 ч 20 мл раствора супернатанта удаляют с тем, чтобы определить уровень инфективности и количество оставшегося бета-пропиолактона. Затем супернатант замораживают при температуре -70 .С. Замороженный супернатант затем подвергают гамма-облучению кобальтом 60 мощйостью

4,5 мй.

Раствор супернатанта затем оттаивают и концентрируют путем 40-кратной фильтрации через выполненные с молярной массой 100000 фильтры. Концентрат подают в снабженные мешалкой колбы Т-21, предварительно обработанные 70%-ным изопропанолом, и центрифугируют при 28000 об/мин в течение одно о часа. Супернатант удаляют и осадок повторно суспендируют в содержащем ЭТУК натриевом буфере до общего конечного объема приблизительно 24 мл. 4 мл этой суспензии расслаивают над 8 мл 30%-ной сахарозы в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных

70%-ным изопропанолом, и центрифугируют втечение одного часа при 28000 об/мин.

Супернатант сливают из 30%-íîé сахарозы и осадок ресуспендируют в указанном наГрадиент в ультрасветлых центрифужных пробирках, предварительно обработанных 7b -ным изопропанолом, устанавливают путем прибавления 3 мл

15%-й сахарозы в пробирку и наложения сверху 6 мл 30 -й сахарозы, 3 мл вышеописанной суспензии наслаивают на раствор.

Пробирки центрифугируют в течение 60 мин при 28000 об/мин.

Раствор над слоями при 35%-ном переходе отсасывают пипеткой и сливают. Слои из всех пробирок соединяют в одной конической пробирке и разбавляют в соотношении 1:10 фосфэтсодержащим буферным солевым раствором, Раствор центрифугируют в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных 70 -ным изоппопанолом, в течение одного часа при

28000 об/мин. Супернатант удаляют и осадки в пробирках ресуспендируют в указанном фосфатсодержащим буферном растворе при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.

Альтернативно, особенно, когда иммуноген получают в больших количествах, стадию облучения можно осуществлять после объединения слоев, Затем вирус расслаивают на градиенте 15-50%-ной сахарозы, Вирусные слои объединяют и ресуспендируют в вышеуказанном фосфэтсодержащем буферном растворе, Вирус центрифугируют при 28000 об/мин в течение одного часа и ресуспендируют в упомянутом буферном растворе до конечной концентрации. равной 1,0 мгlмл.

Количество имеющегося белка определяют в соответствии с методом Бредфорда (cM.Anal, Blochem., 72, с.248, 1976). Белок разбавляют вышеуказанным фосфатсодержащим буферным раствором до концентрации, равной 1,0 мг/мл, Уровень остаточного бета-пропиолактона в иммуногене определяют с использованием капиллярного газо-жидкостного хроматографа. При этом приготовляют стандартные растворы бета-пропиолактона и масляной кислоты, имеющие концентрации между 1 и 500 частями на миллион. Пробы объемом 2 мкм вводят в капиллярный хроматограф в соответствии с рекомендацией изготовителя. Предел обнаружения составляет 0,1 ч/мл. Иммуноген содержит менее, чем 0,05 ч/мл, бета-пропиолактона

Восемь проб иммуногена анализируют на содержание бета-пропиолэктонэ капил1837890

10 л м с т м с и

2 н

У л

7 и б

Ц

У р в б с

10

50 рной газовой хроматографией, используя сляную кислоту в качестве внутреннего андарта, Используют следующие хромаграфические условия: колонка: 30 м х 0,25, кварцевое стекло, открытая, трубчатая; ационарная фаза: 100%-ный цианопрол-кремний; температура ввода пробы

0 С; рабочая температура: 70 С/1мин, С/мин до 130 С; методика ввода пробы: расщепляющая. При вышеприведенных ловиях время удерживания бета-пропиоктона и масляной кислоты соответствует

52 мин и 6,70 мин, соответственно. Ввод 2 л 1 ч/мл. раствора бета-пропиолактона иводит к получению пика, который может

nb измерен количественно. Концентрая 1 ч/мл раствора до 1/10 его объема ариванием растворителя при температу40 С при пониженном давлении не придит к ощутимой потери та-пропиолактона. Предел обнаружен пое концентрации составляет 0,1 ч/мл./0 1 кг/мл. С тем. чтобы подтвердить то, что муноген свободен от белков наружной алочки, иммуноген вначале разделяют на,0%-ных полиакриламидных гелях с приенением додецилсульфата натрия в соот тствии со способом Лэммли, см,Nature

7, стр, 680, 1970). Очищенный материал тем переносят на нитроцеллюлозную буагу в соответствии с методом, предложеным Таубином и др. (см.Proc, Nature. Acad, с!., 76. стр. 4350, 1979) и иммуноокрашиват в соответствии с методом, предложеным Цанг и др. (см.Meth, Enzymalogy, 92, р. 377, 1983 г.). Пятна полученного таким бразом иммуногена не имеют полосу, соотетствующую g p 120/160, как указано в кон,,ольных испытаниях, при взаимодействии сыворотками, содержащими высокие титы анти-9p160/120.

Коммерческие полоски с имеющимися а них белках HIV, подвергнутые скрипингу гетерологичной сывороткой (шимпанзе

86-С и А — 3), и содержащие высокие титры нтител против белков наружной оболочки, р160/120, являются негативными (нереакионноспособными) на полосках, полученых при анализе полученного

ышеописанным образом иммуногена, своодного от наружной оболочки, Гомологичекие человеческие сыворотки (003 и 010), одеожащие высоко-титры антител против елков наружной оболочки, gp160/120, явяются реакционно-способными с коммерескими полосками, но негативными с олосками, полученными из иммуногена, вободного от наружной оболочки, Как гоологические, так и гетерологические сывоотки вступают Во взаимодействие с другими генными продуктами HIV. Отсутст вие белков наружной оболочки на предлага емом иммуногене подтверждаю электронной микроскопией, К иммуноген. ному препарату последовательно добавляют 2,5%-ный глутаральдегид и осмиевый ангидрид, дегидратируют с помощью растворов этанола разных концентраций и заливают в EPON — 812, Тонкие шлифы получают с помощью прибора I KB Ml

crotome (фирма LKB, Уписала. Швеция) с использованием алмазного скальпеля. Толщина шлифов составляет 60 нм. Шлифы окрашивают уранилацетатом и лимоннокислым свинцом, наблюдают и фотографируют с использованием электронного микроскопа марки Цейс 109. Служащие в качестве контроля клетки, зараженные Н!Ч, подготовляют с использованием той же ме-. тодики. При этом обнаруживают, что иммуноген не имеет темно-окрашенную наружную оболочку, которая присуща контрольным пробам и которая отражает

gp160/120 на вирусной поверхности.

Пример 2. Иммунотерапия сероположительных индивидуумов. Девять пациентов, сероположительных к HIV, лечат иммунотерапией при даче иммуногена по примеру 1. При этом иммуноген эмульгируют в соотношении 1:1 в неполном адъюванте Фройнда в эмульсификаторе марки Spex

8000 Mixer Mill инофирмы Спекс Индастриз

Инк., США. 1,0 мл раствора, содержащего

100 мкг белка, вводят внутримышечно. Бустер 100 мкг белка беэ адъюванта вводят через 90 дней путем внутрикожной инъекции.

Присутствие вируса HIV a лимфоцитах периферической крови пациентов определяют как до, так и после иммунизации путем сокультивирования вместе со свежеприготовленными лимфоцитами периферической крови, стимулированными фитогемагглютиНоМ и интерлейкином-2 в соответствии с методом Галло и др. (см,1.СПп. Microb., 25, с.

1291, 1987). Оборудование для обнаружения присутствия антигенов HIV, таких, как р24, коммерчески доступно (например, от инофирмы Е.И.Дю-Пон энд Де-Немурс Ко., Инк, CLIjA). Каждого пациента обследуют три раза перед иммунизацией и через 2,4,6,8,12 и

14.недель после иммунизации.

В таблице представлены результаты исследований. Пациенты 010 и 003, из которых

K IV выделен перед иммунизацией, не и роявляют выделяемый вирус вплоть до 12 недели после иммунизации. Пациенты 008 и

009 не являются переносчиками вируса вплоть до 8 недели после иммунизации. Все четыре этих пациента проявляют высокие

1837890

2) Неатралиаующее аититело

Мембр пап титры анти-р24 (> 1:5000) и антитела против обратной транскриптазы (> 1;1000) перед иммунизацией. Остальные пять пациентов, которые проявляют низкие титры анти-р24 и антитела против обратной транскриптазы перед иммунизацией, продолжают проявлять выделяемый вирус после иммунизации.

Формула изобретения

Способ получения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного HIV, заключающийся в том, что зараженные HlV клетки выращивают в среде RPMl 1640 в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5-7дневный супернатант фильтруют, к фильтрату добавляют Р -пропиолактон и инкубируют в течение 5 ч при 37 С и рН

5 среды 7,2-7,4, после чего замораживают, облучают у-лучами, размораживают, концентрируют, пропуская через миллипоровые полисульфоновые фильтры, вначале центрифугированием с 30%-ной сахарозой, 10 затем центрифугированием в градиенте 3045%-ной сахарозы, а целевой продукт получают ресуспендированием полученного осадка в PBS буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.

fO

Ф

1. у о

8 о

Я

Ф, о м к х к

1837890

Корректор Л.Ливрин

Редактор М.Букреева

Заказ 2879 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,,Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.. Ужгород, ул, Гагарина. 101 Ю

СМ

CL

0) и

Я

Составитель А,Модль

Техред М.Моргентал