Способ очистки микробной эстеразы
Сущноаь изобретения: после осаждения эстеразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем (NH ) SO 40 - 35% насыщения десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в том же буфере в градиенте концентрации (NH ) SO от 20-15% до 0 с последующей доочисткои на сефакриле S - 200. 3 табд
К АВТОРСКОМУ СВИДЕ (PA
G6 (2 (2 ( (7 (7
ЮЗ СОВЕТСКИХ
ЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК
СУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ ССС
) 4912311/13
) 18.0291
) 30.12.93 Бюп М 48-47
) Всесоюзный научно-исследовательский инстиособо чистых биопрепаратов; Всесоюзный научсследовательский институт биотехнологии
) Антипова Т.О„ Соловьева Л.Я„Алешина В.В„. дова ГА; Данилова T.И„. Беспалова T.È„ÔåäîH,М„Карабанова EA
СПОСОБ ОЧИСТКИ МИКРОБНОЙ ЭСТЕ,Ы (в) Ят (и) 1839190 А1 (51) 5 C12N9 18 (57) Сущность изобретения: после осаждения эстеразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем (NH ) SO 40—
42 4
35% насыщения, десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в том же буфере в градиенте концентрации (NH ) $0 от 20 — 1596
+2 4 до 0 с последующей доочисткои на сефакриле S—
200. 3 таба
1839190
Изобретение относится к биотехнологии, э именно к способу очистки эстеразы из
Bacillus subtilis, которая может быть использована в химической, медицинской и микробиологической промышленности, Известно несколько способов выделения и очистки эстеразы Bacillus subtilis (1,2,3).
По способу (1) для получения гомогенного препарата экстракт фермента из клеток подвергают дробному осаждению сульфатом аммония, а затем очистке методом хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ-сефадексе, прогреванию в различных условиях, препаративному электрофорезу. Выход по активности указывается авторами лишь на промежуточных стадиях и составляет после ДЭАЭ-сефадекса 39 при степени очистки 16 раз, Многостадийность схемы очистки является недостатком данного аналога.
В способе (2) фермент был очищен в 400 раз с использованием осаждения солями
MnClz, прогреванием, хроматографией на
ДЭАЭ-целлюлозе и гель-хроматографией на
Bio Rad P-15О, выход составил 590, однако полученный фермент не гомогенный, что является серьезным недостатком данного аналога.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому решению, который выбран авторами в качестве прототипа, является способ (3). По данному способу грубый экстракт клеток Bacillus subtilis ДС-1 (F Е R M В P-1254) подвергают дробному осаждению сульфатом аммония, диализу, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе С1=6В, гель-хроматографии на Сефэкриле $-200 и Сефадексе G-150 и ионообменной хроматографии ía QAE-сефадексе. Гомогенность эстеразы подтверждена методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS).
Недостатками данного технического решения является то, что для получения гомогенной эстеразы необходимо провести 5 стадий очистки, в результате чего выход фермента составляет лишь 9,9, Целью изобретения является упрощение технологии и повышение выхода конечного продукта, Поставленная цель достигается тем, что для получения гомогенного препарата используется культура Bacillus subtilis ЦМПМ
B-3236. После осаждения эстеразы из грубого экстракта сульфатом аммония без предварительного обессоливания ферментный раствор сорбируют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем сульфат аммония 40 — 35 насыщения, десорбцию эстеразы проводят после элюции балластных белков в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20 — 15 до О, доочистку эстеразы проводят на Сефакриле S-200.
Авторами было найдено, что возможность существенного упрощения технологии достигается за счет улучшенной сорбции фермента при гидрофобной хроматографии по сравнению с ионообменной, это свойство фермента ранее в литературе не описано. В результате появилась возможность ограничиться одностадийной очисткой. Существенным является выбор экспериментально обоснованных условий проведения хроматографии на гидрофобном сорбенте, рН сорбции подбирают для конкретного сорбента.
Только совокупность взаимосвязанных и взаимозависимых признаков обеспечивает положительный эффект, заключающийся в эффективном способе получения гомогенной микробной эстеразы.
Пример 1, 40 мл грубого экстракта клеток Bacillus subtilis ЦМПМ В-3236 с удельной активностью эстеразы (активность эстеразы определяется колориметрически, субстратом является
30 индофенилацетат) 4,0 ед/мг белка подвергают дробному осаждению сульфатом аммония 20 (4,4 г с.а./40 мл) — 80 (16,8 г с.а./40 мл) от насыщения. Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 M фосфатном
35 буфере рН 7,5, содержащем сульфат аммония 400/ насыщения и наносят на колонку объемом 55 мл с гидрофобным сорбентом
Butyl-TSK 650, уравновешенным тем же буфером. Элюцию балластных белков прово40 дят 0,02 М фосфатным буфером с сульфатом аммония с 20 насыщения рН 7,5, Фермент десорбируют градиентом сульфата аммония
20 до О в 0,02 Мфосфатном буфере,,со скоростью элюции 16 мл.ч/см, собирают
45 фракции обьемом 5,5 мл. Объединяют фракции, содержащие эстеразную активность, получают 30 мл раствора фермента. Этот раствор наносят на колонку объемом 800 мл с сефакрилом $-200, уравновешенным 0 1 М
50 фосфатным буфером рН 7,1. Фракции, со держащие эстеразу, объединяют, В результате очистки получили 60 мл раствора эстераэы с удельной активностью 400 ед/мг белка и общим выходом 60%. Для хранения раствор лиофилизируют, Пример 2-5 выполняют аналогично примеру 1, меняя условия сорбции íà сорбенте Butyl-TSK, условия проведения и полученные результаты приведены в табл.1.
1839190
Таблица 1
Выход, %
Сорбент
Условия сорбции
Условия десорбУдельная активность, ед/мг бели риии рН градиент концентсодержание сульфата аммония, % от насы ения мерации сульфата аммония,% от наров сы ения
В utyl-Т$ К
20-0
7,5
38
33
240
58
59
20-0
7,5
20-0
7,5
7,5
20-0
20-0
7,5
СолозаКГ
20/30
20-0
5,3
200
56
54
5,3
8
10
15-0
5,3
10-0
5,3
25-0
Солоза КГ
8/24
5,1
20-0
300
50
Пример 6. 40 мл грубого экстракта клеток Bacillus svbtllis В-3236 с удельной активностью эстеразы 4,5 ед/мг белка подвергают дробному осаждению сульфатом аммония 20% — 80% от насыщения, Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М фосфатного буфера рН 5,3, содержащего сульфат аммония 40% насыщения, и наносят на колонку объемом 55 мл с гидрофобным сорбентом Солоза КГ 20/30, 10 уравновешенным тем же буфером. Злюцию балластных белков проводят 0,02 М фосфатным буфером с сульфатом аммония 20% насыщения рН 5,3. Фермент десорбируют градиентом сульфата аммония 20% до 0 в 15
0,02 М фосфатном буфере. Остальные операции проводят аналогично примеру 1. В результате очистки получили 60 мл раствора эстеразы с удельной активностью 320 ед/мг белка с общим выходом 56%. 20
ll р и м е р 7 — 9, Выполняют аналогично примеру 6, меняя условия десорбции эстеразы на сорбенте Солоза КГ 20/30, данные приведены в табл.1.
Пример 10. Выполняется аналогично 25 примеру 1 на сорбенте Солоза КГ 8/24, условия проведения и полученные результаты приведены в табл.1.
Из табл.1 следует, что наилучшие результаты по сорбции эстеразы на гидрофоб- 30 ном сорбенте получают при содержании в ф фатном буфере сульфата аммония от40—
35, от насыщения. Десорбцию следует проводить в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20-15% до О, В та бл.2 приведены данные о степени очистки и выхода продукта на каждой стадии при минимальном значении удельной активности грубого экстракта, Гомогенность эстеразы показана методом электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Основные параметры, характеризующие очистку по предлагаемому способу в сравнении с прототипом, представлены в табл.3.
Таким образом, по предлагаемому способу в сравнении с прототипом в 5,6-6,0 раз увеличивается выход конечного продукта, сокращается количество стадий очистки при условии получения гомогенного фермента с
5 до 3.
Кроме того, использование гидрофобных сорбентов вместо ионообменных после осаждения белка сульфатов аммония не тре" бует проведения предварительного обессоливания, (56) 1,Hlgeral T.Â., Spfzizen J. isolation of two
acety! esterase from extract of Вас,subtlils, l.
of bacterial, 1973 — 114, р.1184-1192.
2.Rifler О.F„Higeral Т,В, Cbaracterisatlon of intracellular esterase А from
Васйоз subtllls, BBA-1976 — 429, р,191 — 197, З.EP М 0243167, кл. С 12 N 9/18, 1987.
Таблица 2
Таблица 3
Составитель В, Алешина
Тех е М.Мо гентал Коо екто М A«" "
Реда кто
Тираж Подписное
НПО "Поиск" Роспатента
113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5
Заказ 3404
Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101
Формула изобретения
СПОСОБ ОЧИСТКИ МИКРОБНОЙ.ÇCТЕ РАЗЫ, предусматривающий дробное осаждение фермента сульфатом аммония из грубого экстракта клеток Bacillus
subtills и хроматографию с использованием сефакрил $-200, отличающийся тем, . что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, фермент осаждают из грубого экстракта клеток
;Bacillus subtilis ЦМПМ 8-3236. сорбцию осуществляют на гидрофобном сорбенте в фосфатном буфере, содержащем сульфат аммония 40 - 35 -ного насыщения, десорбцию эстеразы проводят в фосфатном буфере в градиенте концентрации сульфата аммония от 20- 15 до 0 с последующей доочисткой на афакриле $ - 200.
