Способ лечения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой gt рнк

 

Использование: в терапии Сущность изобретения для печения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой дт РНК в организме человека вводят пожноспаренную дт РНК в количестве 1 - 1000 мкг/1мм биологической жидкости. При этом ложноспаренная дт РНК представляет собой комплекс полиинозмната и толицитидилата содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 урациловых или гуанидиновых оснований включает районы разрыва связей и соответствует формуле г1 )хп П 11-14

(19) RU (11) (51) 5 С 07 Н11

OIIHCAHBK И ЗОБРЕТЕНИ И"

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4356574/1 3 (22) 02.09.88 (46) 30.10.93 Бюл. Na 39-40

{71) Хем Рисерч Инк (US) (72) Вильям АКартер(05) (73) Хем Рисерч Инк (US) (54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ

СОСТОЯНИЙ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ НЕХВАТКОЙ ДТ РН К (57) Использование: в терапии. Сущность изобрев I I тения: для лечения патологических состояний, сопровождающихся нехваткой дт PHK в организме человека вводят ложносларенную дт PHK в копичестве 1 — 1000 мкг/1мм биологической жидкости.

При этом ложносларенная дт РНК представляет собой комплекс лолиинозината и толицитидилата содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 урациловых или гуанидиновых оснований включает районы разрыва связей и соответствует формуле г1 хт(С )xn. н 11-14

2001917

Изобретение относится к постановке диагноза состояния нехватки 9тРНК и процедурам подачи экзогенной 9тРНК в подходящей молекулярной конфигурации для восстановления ее нормального уровня.

Новые способы постановки диагноза и терапии вирусных болезней, хронических патогенных инфекций в общем и рака появляются, когда раскрыты разнообразные роли, которые играет отРНК в хозяйской защите. Например, развитие СПИДа (ретровируснвя инфекция, рак) связано с постепенно ужесточающейся дисфункцией биологических процессов, которые каталиэируются QTPHК, включая не только биосинтез интерферона, но также продукцию биоактивного 2 — 5А, активность РНКазы и различные опосредованные клеткой иммунные функции. Специфическое снижение количества биоактивной дтРНК или ферментов, которые зависят от отРНК, внутри специфических клеток вносит вклад в прогрессию болезни.

Состояние нехватки в путях, вовлекающих биоактивную цтРНК, также лежит в корне различных клеточных повреждений в хозяйских системах защити, привходящих к смерти. Ранее был обнаружен ингибитор

РНКазы в лимфоцитах инфицированных

БИЧ пациентов, больных ССК и СПИД, который является только одним результатом из многих неадекватных внутриклеточных уровней отРНК. Терапия при помощи имеющей подходящую конфигурацию синтетической отРНК устраняет один или н .сколько этих ингибиторов, что может частично обьяснить клинический ответ, который наблюдается при уменьшении концентрации вируса и восстановлении иммунной функции с разными хроническими виремиями, которые в настоящее время продолжают в значительной степени противостоять решительному медицинскому вмешательству.

Предлагаемый способ может обълсн,1ть, определить и корректировать ряд состояний нехватки grPHK при различных боле. .нях.

Некоторые 9тРНК, т,н. ложноспаренные

9тРНК, могут фактически замещать цтРНК природного происхождения, что помагает поддерживать функции, необходимые для нормальных клеточных процессов. Отсутствие такоей регуляции 9тРНК, пе будучи скорректированно подходящей зкзогенной

gTPHK, может вызвать развитие аномальных клеточных процессов. Аномальные клеточные процессы затем приводят к хроническим инфекциям вирусoR или других внутриклеточных патогенов, сниженным функциям иммунных клеток. B конце концов к хронической болезненности и к собственно смерти.

Клинические стратегии. Вирусные инфекции могут часто следовать за частичным нарушением иммунной системы такими разными агентами, как стресс и вирусы, которые атакуют непосредственно иммунную функцию. Например, СПИД следует за прогрессивным ухудшением в иммунной систа 0 ме, вызванным инфекцией Т-лимфонитов вирусом иммунного дефицита человека—

ВИЧ (Coffin el sl, Science voL 232, р.697, 1986). э

Существуют Разные обозначения виру15 сз ВИЧ: LAV — обозначение вируса СПИД, выделенного в Пастеровс ком институте, Па риж, Франция; HTLVlll — обозначение виру=а СПИД, выделенного в Национальном институте здоровья, Бетеэда, Мэриленд, 2 - ГША. Зджесь ВИЧ использован в качестве общего названия вируса. Часть в тексте будут ссылки на ВИЧ в общем виде или ВИЧ, или HTLVllL или LAV беэ попыток дифференцировать их. Более того, термин ВИЧ

25- включает все другие вирусы, которые могут быть связаны с образованием СПИД, изолированы они уже или нет.

Инфекция В ИЧ вЂ” это прогрессирующая болезнь, хотя темп перехода от одной фазы 0 к другой варьирует. У асимптоматических индивидуумов, инфицированных ВИЧ, может развиваться состояние (LAS или преARC), характеризованное как лимфоаденопатия. Пациенты прогрессиру85 ют к СПИД связанному комплексу или ССК, демонстрируя дефицит Т4 клеток и позднее сн,женную способность лимфоцитов подвергатьсяя антиген-стимулируемой пролиферации и продуцировать IFN-гамма. Эти

40 пациенты теряют иммунные функции, опосредованные различными клетками, например задержанная кожная гиперчувствительность, со бременем становящаяся совершенно вялой, Они демонст45 рируют свидетельства поломки в защитном хозяйском механизме, включая инфекции герпесного опоясывающего лишая, орального кандидоза и такие симптомы, как продолжите1ьные лихорадки, ночные паты, 50 поносы и потеря веса. В конечном счете эти пациенты испытывают определенные сильные условно-патогенные инфекции (например, пневмония, вызываемая Pneumoc— уз0з — carlnli) и затем их определяют как

55 имеющих полностью развитый СПИД с приблизительно 50Я смертностью в течение 12 месяцев, Инфекция вирусом ВИЧ выбрана в качестве иллюстративного примера, потому что уровень нехватки 9тРНК столь выражен. многие другие болезни, включая вялотеку2001917 щие вирусные инфекции, ассоциированы с похожими нехватками, Существенно, что типичная прогрессия, выведенная выше, не описывает существенных различий в клинической симптоматологии между ВИЧ-инфицированными пациентами или многими другими пациентами с хроническими болезнями, такими как инфекция Эпштейн-Барр или ЭБ, инфекция вирусом гепатита, цитомегаловирусом, герпесные инфекции и т.п, Компоненты иммунной системы распадаются с крайне различной скоростью у разных пациентов, потеря биоактивной 9тРНК вЂ” это причина или фактор, влияющий на данный процесс.

Инфекция ВИЧ может развиваться в различных типах клеток (например, в кровяных клетках, глиальных клетках), У некоторых пациентов в качестве первого симптома развивается нейрологическая дисфункция.

Следовательно, различные индивидуумы могут иметь крайне различные терапевтические потребности, даже если все нуждаются в уничтожении ВИЧ в Т4 клетках.

У многих вирусных инфекций, включая такие у пациентов с ССК, могут быть выделены две общие патологические черты, набор иммунных нехваток и длящаяся вирусная инфекция (,:aucl, Proc. Nat !. Acad.

Sci. USA, vol. 83, р.9278, 1986). Терапевтическое вмешательство, влияющее лишь на иммунные нехватки, но неудачное в борьбе с репликацией вируса. оказывает обратное действие, в особенности когда такая обработка активирует Т4 клетки. Например, Тхелперные клетки с рецепторами Тас способы к ответу на лимфокин IL — 2, У жертв

СПИДа IL — 2 вызывает распространение

ВИЧ-чувствительных клеток и очевидное ухудшение в болезни, Воздействие непосредственно на вирусные инфекции, например инфекцию

ВИЧ, бывает успешным, в особенности ингибитором вирусной обратной транскриптазы, обозначенным азотимидином (АЗТ), который может уменьшить "нагрузку" ВИЧ у некоторых пациентов и продлить жизнь, Такая терапия не свободна от нежелательных результатов, У меньшинства пациентов

А3Т также вызывает временное восстановление иммуности, опосредованной Т4 клетками, судя по измерениям временного роста Т4 клеток и по появлению гиперчувствительности замедленного типа (Fischl et al.

New Eng. J. Med., 1uló, 1987). Однако ингибиторы обратной транскриптазы токсичны в дозах, необходимых для получения значимого антивирусного эффекта, и поэтому плохо переносятся при длительном применении. Применение антивирусных агентов предотвращения и обработки вируса, но мо35 гут иметь существенные ограничения: например, ВИЧ (как и вирус гриппа) легко

45

55

30 может быть необходимо для жизни пзциента. IFN (интерферон) неэффективен и как антивирусное вещество общего действия, и как анти-СПИДовое лекарство, возможно, потому, что он не является противоядием для 9тРНК-связанных дефектов, Конечно, жертвы ССК/СПИДа имеют различные дефекты в пути IFN, такие как и родуцирование дефективного, кислотолабильного1ЕН и неспособность Т4 клеток вырабатывать подходящие количества IFN-гамма, которые хорошо описаны в медицинской литературе.

Эти различные IFN-связанные дефекты у пациентов с СПИД и ССК могут быть частично или всецело связаны с потерей активности

РНКазы в лимфоцитах.

ХОтя в лимфоцитах крови индивидуумов с ССК/СПИД и с другими хроническими виремиями увеличено количество 9тРНК-зависимой 2-5А синтетазы, те же клетки крови демонстрируют уменьшение количества аутентичной 2-5А и низкое количество

РНКазаЕ. Низкую активность РНКазы сопоставляют с небольшими количествами белка с M 80.000, способного связывать фотоаффинно меченые аналоги 2 — 5А. Это согласуется с путем отРНК, который был блокирîван и относительно отсутствует, и/или с ингибитором РНКазы(, Вакцинация против ВИЧ и других вирусов и использование пассивных антител анти-ВИЧ также обсуждаются для может инфицировать клетки скрытно.

9тРНК игранет роль в усилении выработки антител против вирусов вообще и ретровирусов в частности. Двутяжевые РНК, цтРНК, составляют первую группу молекул. которые эффективны против как вирусных, так и иммунных повреждений при различных подострых/хронических вирусных ин" фекцияк, как ВИЧ и другие. Эти дефекты могут быть исправлены с лазерной точностью без неблагоприятного повреждения основных функций тела, что является общим ограничением доступных сейчас терапий хронических вирусных инфекций. Пациенты с неразрешившимися и вялотекущими вирусными инфекциями части имеют специфические дефекты в жизненных внутриклеточных 9тРНК-зависимых путях, которые могут быть обращены или хотя бы частично исправлены экзогенно поданной

9тРНК (это объясняется графически на фиг.

1), и мониторинг этих путей перед и в течение обработки дает новый способ измерения степени терапии замещением 9тРНК, 2001917 требуемой для индивидуального пациента или специфической основы болезни, Критические ферменты, связанные с хозяйской защитой, требуют 9тРНК для проявления биоактивности. Эти ферменты могут быть активированы зкэогенной 9ТРНК, если уровень внутриклеточной природной отРНК столь низок. Часть плейотропного воздействия дтРНК происходит иэ ее способности индуцировать синтез всего спектра IFN-альфа, бета и гамма, которая действует через группу внутриклеточных медиаторов, включая цтРНК-зависимую протеинкиназу, отРНК-зависимую 2 — 5А синтетазу и 2 — 5А зависимую РНКазу1 . Эти 9тРНК-зависимые ферменты могут выполнять многие биологические активности, относимые к IFN, как описано Lengyel (Ann. Rev. Biochem, vol51, р.251, 1982). Например, образование антисмысловой РНК, которая блокирует экспрессию 2 — 5А синтетазы, вызывает абсолютную чувствительность животных клеток к инфекциям разными вирусами (Bendettl et al, Prac. Natl. Acad. Sci USa, vol,84, р,658, 1987), 9тРНК-активируемая протеинкиназа фосфорилирует eLF2, что ингибирует белковый синтез, она также обладает протеолитической активностью для расщепления вирусных белков. 9тРНК-активируемая 2-5А синтеза синтезирует 2 — 5А, который играет критическую роль как в подавлении различных вирусов животных, так и для контроля роста клеток (уход от которого может привести к образованию опухоли).

2 -5 -олигоадениловые кислоты необычны в том,что нормальная ", 5 фосфодизфирная связь, характерная для большинства 9ТРНК, замещена новой фосфодиэфирной свяэьью с приобретением новых биологических

СВОЙСТВ.

Антивирусная активность 9ТРНК. дтРНК вЂ” хорошо известный индуктор антивирусного состояния (Marcus et. ai. Nature, vol.66. р.815, 1977). Поли/А/; поли/У/ генерирует антивирусное состояние без индукции IFN, Но существует природная регуляция gnPHK и, следовательно, действительные состояния нехватки 9ТРНК распространены у людей с патогенными случаями (вирусные, грибковые, протозойные, бактериальные инвазии и т д„в особенности те, которые имеют внутриклеточные (у человека) присутствие в качестве желательного или обязательного компонента жизненного цикла).

Антипролиферативная активность

9тРНК. Ранее обнаружено (J.IFN. Rys., vol.

6, р.373, 1986), что 42 иэ более чем 100 свежих человеческих опухолевых образцов

55 при исследовании в полужидком агарв демонстрировали 50 или более уменьшенив образования колоний опухолевых клеток после лишь одной обработки 9ТРНК, Эти клетки имеют нехватки 9ТРНК. Известна независимая IFN-9ТРНК-чувствительность у разных линий опухолевых клеток человека.

Человеческие опухоли, размножаемые В безволосых мышах, были чувствительны к

9ТРНК; терапия 9ТРНК исцеляла от некоторых опухолей (например, почечной) и животные жили нормальной жизнью (см.

Европейское патентное описание

0,113.162). В данном способе описана корреляция между клиническими ответами н активацией 9ТРНК-зависимых ферментов в противоположность измеримой индукции !

FN или IL-2, вторичной по отношению к прим"чению 9ТРНК, Усиливающая иммунитет активность

9.РНК, Известно (J. Immunol, ч.124, р.1852, 1980), что 9тРНК повышает цитолитическую активность природных киллеров человека (NK) по отношению к клеткам лейкемии человека. Требования к структуре 9ТРНК для прироста К параллельны с таковыми, нужными для активации 2 — 5А и индукции lFN.

Контроль генов, опосредованный

9ТРНК. Sullo etal (Cell, 43, р.798, 1985) продемонстрировали, что 9тРН К индуцирует гбны компетентности в покоящихСЯ фиброобластях, включая онкогены, обозначенные foc u myc. Здесь "гены компетентности"" — те гены клетки, действие которых требуется для модулирования жизненных действий, как мультипликация, рост и т.д.

Индукция гена IFN-бета grPHK может использовать регуляторный белок, который удаляется при обработке 9ТРНК (Zlnn etal, СеИ. ч,45, р,611, 1986), По биологической активности экэогенно поданные 9ТРНК подобны такой природной невирусной внутриклеточной 9тРНК, как гетерогенная ядерная

РНК или комплексы мРНК с поли/У/. Например, IFM — индуцибельная дтРНК в ядрах клеток Hela способна активировать

2-5А синтетазу in vitro. Возникновенив клеточной иммун ности в далеком прошлом 3Волюцион ого цикла животных, очевидно, определило этап эволюции молекул

1ГМ/9ТРНК в направлении обеспечения клеточной дифференцировки, в частности дифференцировки, запускаемой lFM. Таким образом, 9тРНК может обеспечивать дифференцировку, запускаемую другими регуляторными белками, которые определяют этап определения состояний нехввткн

9тРНК.

200191 7

На фиг. 1 показана схема, иллюстриру- можным для пациента оценить степень зающая два пути; к болезненности хозяина и местительнойтерапиидтРНК,требующейся

его выздоровлению; на фиг, 2,а — графиче- для индивидуального состояния. Остальные ская диаграмма: число дней до и после на- значения определения нехваток отРНК дачала терапии IF в обозначенном количестве 5 ны ниже, "Медиаторы" определяются по относительно активности синтетазы, на фиг, способу действия как любые внутриклеточ2, б — график, сравнивающий количество ныечастицы, напримерспецифическиеолибелых кровяных телец и количество ложнос- гонуклеотиды, белки, цтРНК сами по себе паренной отРНК после 120 дней обработки; или в комбинации, которые проявляют спена фиг, 3 — фотография электрофореза в 10 цифические биохимические функции, иниполиакриламидном геле (в пластине), де- циируемые присутствием цтРНК. Такие монстрирующая различные зоны и полосы биохимические функции вносят вкладвусина протяжении каждой дорожки; на фиг. 4 — лие механизма хозяйской защиты на уровне график, сравнивающий абсолютное количе- как единственной клетки, так и всего оргаство Т4 лимфоцитов на кубический милли- 15 низма. метр крови, выраженный в процентном Условия, подходящие для терапевтичеизменении от нулевой линии с месяцами ских процедур, в общем те, при которых терапии. нехватка 9тРНК больше нормальных предДвутяжевые PHK (отРНК) составляют елов по сравнению со здоровыми инидивипервую группу молекул, которые эффектив- 20 дуумами, нехватка отРНК вызывает ны как против вирусных, так и против им- патологии тканей и/или в присутствии немунных повреждений различными нормально низкого уровня 9тРНК, сочетаюподострыми/хроническими вирусными ин- щегося или сосуществующего с фекциями, как ВИЧ и другие. Эти дефекты присутствием внутриклеточного патогена, могут быть исправлены с лазерной точно- 25 Более частные условия или патологии ткастью без нежелательного повреждения ос- ней и конституциональные симптомы вклютальных функций тела. что является общим чают такие вирусные инфекции, как ограничением для доступных в настоящее ретровирусные, включая ВИЧ, семейство время терапий хронических вирусных ин- вирусов герпеса, парамиксовирусы, риновифекций. Пациенты с неразрешенными и вя- 30 рус, гепатит и синдром хронический усталоруемую лотекущими вирусными инфекциями часто сти, Прочие включают неконтролир ем ю имеют специфические дефекты в жизнен- пролиферацию раковых клеток и патологии ных отРНК-зависимых путях, которые могут иммунной системы, находится компонентбыть исправлены или улучшены по крайней ная клетка в процессе мультипликации или мере частично экзогенно поданной дтРНК 35 дифференциации или нет. (это обьясняется графически на фиг. 1),мо- ПодложноспареннойотРНКпонимаютниторингэтих путем до и втечение обработ- ся те, у которых водородные связи (стэкинг ки обеспечивает новый эффективный оснований) между цепями относительно инспособ оценки степени заместительной тЕ- TBKTHbl, т.е. прерываются в общем менее рапии отРНК, требуемой индивидуальным 40 чем один раз на каждые 29 последовательпациентом или специфическим состоянием ных остатков оснований, Ложное спариваболезни. ние — это разрыв в нормальной геометрии

Этотспособобеспечиваетдиагностиче- двойной спирали PHK пугем втягивания скую процедурудля определения состояния (или выпячивания) цепей, который преднехватки9тРНКу пациента, количественно- 45 ставляет собой точку подверженности го определения этой нехватки(при наличии) отРНК расщеплению рибонуклеазами. и обеспечение терапевтической процедуры цтРИК может быть комплексом полидля восполнения любой определенной не- инозината или полицитидилата, содержахватки тРНК. П

g . рименением экзогенной щим часть урациловых оснований или отРНК возможно с лимфокином. Обычно со- 50 гуанидиновых оснований, например, от 1;5 стояние нехватки цтРНК заметно внутри до 1:30 (поли1 — поли/С4-zgx > U или С). клетки — компонента иммунной системы, на- g TP H К может иметь общую формулу г! пх ходится клетка-компонент в процессе муль- xr(CizU)n. Другие примеры 9тРНК приведетипликации или дифференциации или нет. ны ниже.

Нехватка 9тРНК заметна, например, по не- 55 В предпочтительной ложноспаренной способности клетки — компонента иммун- отРНК, rl> г(Сц U)n, район, состоящий из ной системы поддерживать существующий неразрывной последовательности 6 — 12 пар уровень биоактивной РНКазы. Мониторинг основан й, т,е. от полов ний, т,е. от половины до одного полвнутриклеточных 9тРНК-зависимых путей ного витка спирали РНК, служит и как биодо, в течение и после терапии делает воз- триггер. вызыва б р. вызывающии освобождение

2001917

15

40

55 лимфокинов, и как облигатный внутриклеточный кофактор для ферментов, представляющих природные антивирусные пути.

Ложноспаренные районы, состоящие из остатков урацила, периодически инсертированы в полипиримидовую цепь для ускорения гидролизэ PHK и предотвращения токсичНОСТИ.

Ложноспаренная цтРНК, предпочтительная для использования в настоящем изобретении, основана на кополинуклеотидах, выбранных из поли(Сп. G), где и — фактор имеет значения от 4 до 29, и явля ющихся аналогами (ложноспаренными) комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образованными модификацией

rln rCn для введения неспаренных оснований (урацила или гуанидина) в полирибоцитидилатную (rCn) цепь. Альтернативно

grPHK может быть получена из цтРНК поли/1/-поли/С/ модификацией рибозильного скелета полирибоинозиновой кислоты (г1 ), например включением 2 -0-метилрибоэильных остатков. Эти ложноспаренные аналоги rtn . rCn, предпочтительные из которых имеют общую формулу rln r(C>1-и, U)n и г4 г(С29, G)n. описаны Carter u Tso в патентах США N 4130641 и 4024222, цтРНК, описанные в них, удобны для использования в предлагаемом способе. В некоторых случаях комплементарные олигонуклеотидные дуплексы (спирали) также достаточны в качестве заместительной терапии.

Другие примеры ложноспаренной цтРНК для использования в способе включают поли/1/.Поли/С, U/ поли/1/.Поли/С7, U/ поли/1/.Поли/С13, U/ поли/1/.Поли/С22, U/ поли/1/.поли/С20, G/

Поли/1/.поли/С29, G/ поли/1/.поли/Ср/23 6 > р

Синергия цтРНК-лимфокин. Поскольку цтРИК оказывает существенную часть своего биологического действия через специфическую систему лим фоки нов, опосредованную частично IFM, она должна (а) индуцировать IFM в IFM-дефицитных клетках, (б) активировать уместные цтРНКзависимые ферменты-посредники, причем клеточная цтРНК неиндуцибельна в клетках и нв отвечает на зкзогенно примененный

lFN, Если цтРНК действует только через систему IFN и цтРНК находится в клетках в избытке, тогда избыток одного IFN оказывает такое же биологическое действие. как и комбинация IFM и цтРНК. Однако это должно быть относительно редким состоянием, поскольку имеется много примеров цтРНКIFN-синергии и мало примеров отсутствия синергии. Например, цтРНК синергичнэ с человеческими IFN-альфа, -бета или -гамма в ингибировании роста клеток иэ человеской карциномы пузыря, карциномы легких и фибросаркомы. Можно расширить эти результаты на 15 других линиях опухолевых клеток человека, причем только одна из них не показана антипролиферативной синергии, Сходный синергизм был заметен нэ некоторых опухолях человека, привитых нэ безволосых мышах; клинически наблюдают, что комбинация !FN и цтРНК была лучше, чем каждый из агентов в отдельности, в качестве противоракового режима по отношению как к опухолям почки, так и к СЬИ

Состояние нехватки цтРНК, Как прот0типный путь, путь 2 — 5А синтетаэы (РНКагы ) включает одну или более цтРНК, 2-5А, связанные ферменты и ингибиторы. Существует прямая биохимическая связь между

9TPHK u РНКазой в том, что 2-5А, продукт тРНК-зависимой 2-5А синтетазы является необходимым кофактором для активности

РНКаэы, Примеры предназначены служить примером нескольких из многих возможных видо в дефектов в цт Р Н К-опосредованных путях, которые могут быть исправлены экзогенно поданной цтРНК.

Схема на фиг. 1 иллюстрирует связи между достатком цтРНК, приводящим к выздоровлению хозяина, и нехваткой цтРНК, приводящей к болезненности хозяина. БИОактивная цт РН К вы рабатывается внутриклеточно или вводится при некоторых событиях, которые приводят к антивирусному состоянию так же, как и к дифференцировке иммунных клеток и выздоровлению хозяина, Измерение 2-5а синтетазы ln vitro имеет ограниченную ценность, поскольку не отрэжает активности 2 — 5А синтетазы In vlvo.

Отсюда разработан способ экстракции и количественного определения 2-5А из одноядерных клеток периферической крови (ОКПК) здоровых индивидуумов и инфицированных патогеном пациентов до и после терапии ложноспаренной цтРНК. Концентрация 2- А может быть определена по способности 2-5А активировать эффинно очищенную РНКазу1 и деградации поли/U// 2Р/рСр.

Методы.

Гепаринизированную и периферьйескую кровь получали от десяти здоровых индивидуумов и от пяти пациентов-мужских гомосексуалистов с LAS, CCK и СПИД, как определено Центрами по борьбе с болезнями. С клинической точки зрения проводили

2001917

14 вирологические и иммунологи4еские характеристики пациентов, вовлеченных в это исследование (пациенты 1 — 5) были охарактеризованы ранее как пациенты 10, 8, 1, 7 и 2 соответственно со статьей Lancet. 5

June 6, 1987. ОКПК изолировали на Firol!—

Hypagye, Клетки !929 и Н1 929 (РНКаза1.-дефицитный субклон L929) поддерживали в монослоной культуре. Цитоплазматические экстракты иэ клеток L929 и HL929 получали 10 в грицериновом буфете, экстракты из ОКПК получали в NP40-лизисном буфете, Концентрация белка в экстрактах составляла 10 — 15 мгк/мкл. СК, саркома Капощи; ППК, пневмония 15

PneumocystIc cat nÏ

Активность 2-5А синтетазы (колонка 3) определяли в экстрактах ОКПК (50 мкг белка/анализа), используя поли/6/:поли/С/агарозу, 2-5А выделяли из этанолрастворимой фракци экстрактов

ОКПК (100 мгк белка, 70% этанол, об/об), э«:".трагированную этанолом затем лиофилизировали и растворяли в воде (20 мкл).

Концентрации внутриклеточной 2-5А, присутствующей в экстрактах ОКПК (колонка 4), определяли в анализах в кор-целлюлозой с экстрактами клеток L929 в качестве источника РНКазыб по калибровочным кривым, полученным с истинной 2-5А. Активация 30

РНКазы 2-5А в этом анализе основана на превращении полиИ// P/рСр в кислото32 растворимые фрагменты. В контрольных опытах (в отсутствие 2 — 5А) на фильтрах из стекловолокна задерживалось 6500 35 расп./мин иэ общего добавленного количества 17700 расп./мин поли/О// P/рСр (1,3 мкКи/нмоль). В присутствии < 1 х 10

M истинной 2 — 5А поли/U//" P/ðÑð деградировал на 0%; в присутствии > 1 х 10 М 40 истинной 2 — 5А поли/U// Р/рСр деградировал на 100%. Уровни латентной РНКазы определяли двумя способами: (1) в анализах со связыванием радиоактивности после добавления 20000 распlмин рзА / /Р/рСр к 45 экстрактам ОКПК/50 мкг белка/анализ/и(2) в анализах с расщеплением рибосомной

PHK в присутствии 2-5А (колонка 6). Экстракты, полученные из клеток L929 (150 мкг белка/анализ), инкубировали 60 мин при 50 о

30 С в присутствии 5 мкл этанолраствооимой фракции экстрактов ОКПК и 1 х 10 М рзАз в конечном обьеме 20 мкл, Тотальную

P HK экстрагировали, денатурировали и анализировали элекгрофореэом в 1,8% агароз- 55 ном геле. Окрашенные бромистым этидием полосы визуализировали в УФ-свете. Активированные уровни РНКазы (колонка 6) определяли в анализах в расщеплением рибосомальной РНК в отсутствие добавленной 2 — 5А, Концентрация функциональной 2-5А в экстрактах ОКПК варьировала от 0,3 до 1,1 нмоль/г белка у здоровых индивидуумов и от уровней, меньше определяемых до 0,6 нмоль/г белка в экстрактах ОКПК иэ инфицированных вирусом пациентов до обработки ложноспаренной отРНК (табл. 10, колонка 4), Однако 2 — 5А накапливается до более чем 10 н/моль/г белка по мере терапии ложноспаренной отРНК, Ранее отмечалось, что 2-5А активизированная частично очищенная РНКаза предпочтительно расщепляет поли/U/, но не поли/С/. Выделенная человеческая 2-5А(как и истинная 2 — 5А) могла активировать аффинно очищенную

РНКазу из либо клеток L929. либо ОКПК от здоровых людей к специфической деградации поли/И, см. табл. 4. Важно отметить, что когда для экстракции 2 — 5А из ОКПК используется ТХУ в дополнение в поли/U/-деградирующей активности (РНКазы ) экстрагируется поли/С/-деградирующая активность. Эта поли/С/-деградирующая

ТХУ-экстрагируемая активность может быть устранена протеаэным расщеплением или дальнейшей экстракцией этанолом. Поли/С/-деградирующая активность была обнаружена в ТХУ-растворимой фракции

ОКПК от всех людей, но ни в одной из постоянных линий клеток (т.е. Не!а L929, HL929), проверенных на это, Поли/С/-деградирующая активность не была заметна ни в одной из этанолрастворимых фракций ОКПК.

М01 обозначает множественность инфекции. Это означает приблизительное количество вирусных частиц, приходящихся на каждую клетку-мишень.

БОЕ обозначает бляшкообраэующие единицы, Это означает количество вирусных частиц, определенное подсчетом цитопатических (мертвых) клеток, Хотя осуществляли сообщения о присутствии 2-5А в тканях, выделенных из необработанных животных, и о накапливании 2 — 5А в тканях мышей, обработанных 9тРНК, здесь сообщается о накапливании 2 — 5А в ткани человека. Точно установлено, что истинная 2-5А связывается РНКазой и активирует ее к деградации рРНК до высокохарактерных продуктов специфического расщепления (СПСР), Поэтому активность 2-5А, выделенной из экстрактов ОКПК характеризуется в анализе с расщеплением рРНК, Специфический поттерн расщепления, создаваемый РНКазой с экстрагированной этанолом 2-5А, тот же, что и полученный в присутствии истинной 2 — 5А.

Эти результаты показывают, что (внутривен15

2001917

5

20 ное) применение ложноспаренной 9тРНК к инфицированным вирусом пациентам вызывало резкое повышение 2-5А в кровяных клетках от концентраций, которые были ниже определяемых.

Активность РН Казыб.

Отсутствие активности РНКазы у индивидуумов, инфицированных ВИЧ, было подтверждено и данные расширены (табл. 10 колонки 5-7). Чувствительный метод, основанный на специфичности активированной

2-5А РНКаэы к расщеплению рРНК (Wrescher et at, Nucleic Acids Res, ч.9, пп.1571-1581, 1981), позволяли измерять активированную РНКазу в экстрактах иэ

ОКПК, выделенных из всего лишь 1 Мп периферийной крови. Экстракты РНКазы дефицитного субклона линии клеток L929 (HL929) были использованы s качестве источника рибосом. Экстракты ОКПК инфицированных

ВИЧ пациентов имели в 5-7 раз более низкие уровни латентной РНКазы, чем экстракты здоровых индивидуумов, как определено s анализах со связыванием радиоактивности (табл. 1, колонка 5, 240-280 против 1350 распlмин), Сходные наблюдения описаны Wu и др. (AtOS Reserarch, ч. 2, р.127-131, 1986). Применение анализа со связанной радиоактивностью ограничено в отношении определения уровня латентной

РНКазы у пациентов, обработанных ложноспаренной gTPHK, поскольку в образцах

ОКПК от этих пациентов присутствует накопленная 2 — 5А(табл. 1, колонка 4), которая может конкурировать за связывание с

РНКаэой, Поэтому определение уровня активированной 2 — 5А РНКазы необходимо.

Сначала уровни активированной РНКаэы . определяли. измеряя специфическое расщепление рРНК экстрактом из ОКПК в отсутствии экзогенно добавленной 2-5А (табл.1, колонка 7). Используя этот анализ, PHKaaaL не была активирована в экстрактах

ОКПК пациентов, инфицированных ВИЧ, до терапии (полиакриламидные гели, показанные на фиг. 3). Зная, что уровни внутоиклеточной 2-5А в этих образцах OKllV были низкими (табл, 2), эти результаты не были неожиданными. Однако экстракты их ОКПК от всех проверенных здоровых индивидуумов демонстрировали присутствие активированной РНКаэы1, которая образовывала продукты специфического расщепления в анализах с расщеплением рРНК, хотч количество 2-5А у некоторых здоровых индивидуумов было столь низко, как 0,3 нмоль/г белка (табл. 2), Существенно, что о; сутствие активности РН Казы в образцах от ВИЧ-инфицированных пациентов до терапии не могло быть благодаря накоплению конку25

55 рентного ингибитора 2-5А, как сообщалось в Caytet et а1, European J. Bloch., ч.143, р.165 — 177, 1984, активность РНКазы . нв могла быть восстановлена добавлением истинной 2 — 5А (табл. 1, колонка 6).

Затем определяли уровни латентной

РНКазы в двух независимых измерениях.

Латентную активность РНКаэы . определяли в анализах специфическим расщеплением рРНК, но в присутствии добавленной

2-5А (табл, 2). В образцах, взятых до терапии ложноспаренной дтРНК, ни у одного из пяти обследованных пациентов не была обнаружена латентная РНКаэа1..

Способ фотоаффинного мечения с

РзА4(Р)рСр был использован для дальнейшего определения отсутствия PHKaaaL в

0KilK БИЧ-инфицированных пациентов (или она изменена). Предыдущие исследования с ратоаффинным мечением идентифицировали белок с Mr 80.000 с PaA4(P)pCp связывающей активностью и специфической поли/У/эндорибонуклеолитической активностью как РНКазу1 . Аффинное мечение РНКазы, присутствующей в экстрактах

ОКПК, определяли, используя P3A4(P)pCP.

РНКазу из экстрактов ОКПК (50мкг белка) от нормальных индивидуумом в сравнении с ССК-пациентом (пациентом до терапии ложноспаренной 9тРНК) или экстрактом клеток L929 (50 мкг белка) фотгоэффинно метили после добавления РзА4(з Р)рСр (30000 расп,/мин. 3000 Ku/ììîëü) в отсутствии или в присутствии истинной РЗА4 (1 х 10 М).

PHKasyL из экстрактов ОКПКот нормальных индивидуумов (100 мкг белка) очищали от

2-5А кор-целлюлозе и фотометиле после добавления РзА4(згР)рСР (30000расп,/мин, 3000 Ku/ììoëü). После 90 мин инкубации при 0 С образцы переносили на охлажденные во льду фарфоровые капельные пластины и фотомуировали 3 мин, используя 254 нм UVC — 11 Minerallght лампу (Vl)ravtotet

Products) на расстоянии 2 см (1 3/м . Определяли положение маркерных белков и

РНКазы c Mr 80000.

Исследования с фотомечением выявили, что РзА (Р)рСр ковалентно пришиваетзг ся к белку с Mr 80000 в экстрактах ОКПК от здоровых людей (данные полиакриламидного геля не приведены). Однако меченив белков отсутствовало в экстрактах ОКПК от хронически инфицированного вирусом пациента, При тех же экспериментальных условиях в экстрактах клеток L929 специфически фотометился белок с Mr

80000. Добавление РзА4 (1 х 10 М) к инкубационным смесям, содержащим

РзА4(P)pCp предотвращало фотомечение, зг т.е, обеспечивало дополнительное свиде17

2001917

20

30

55 тельство, что фотомечение было высокоспецифично к РНКазеб, Исследования с фотомечением белка, очищенного иэ экстактов

ОКПК от здорового человека корцеллюлозным методом, выявило ковалентное связывание с белком с Mr 80000, который был способен деградировать поли/У/, но не поли/А/, поли/Ц/ и поли/Г/ в присутствии истинной 2 — 5А (табл, 4). Сведенные вместе эти результаты доказывают, что белок очищен от ОКПК здоровых индивидуумов и мечен РзА4(P)pCp.

После 4-17 недель терапии ложноспаренной отРНК активированная PHKaaaL впервые определялась в экстрактах ОКПК от всех пяти хронически инфицированных пациентов; от 17 до 28 недель терапии ложноспаренной отРНК активность активированной РНКазы для всех пяти пациентов была эквивалентна уровням РНКазы, наблюдавшимся у здоровых индивидуумов (табл. 1, колонка 7). Уровень активированной РНКазы показывал очень тесную корреляцию с концентрацией функциональной 2 — 5А. выделенной из тех же образцов (табл, 1, в сравнении с колонками 4 и 7), Крайне интересно, что пациент

1 поддерживал повышенный внутриклеточный уровень 2 — 5А и полностью активированную РНКаэу на 28 неделях 3 неделями позднее того, как терапия ложноспаренной . 9тРНК была прервана (табл, 1, колонки 4 и 7).

Описанные здесь эксперименты показывают, что пять ВИЧ-инфицированных пациентов имеют общий молекулярный фенотип в одноядерных кровяных клетках, сниженный уровень 2 — 5А и отсутствие определяемой активности РНКазыб. Одноядерные кровяные клетки здоровых людей проявляли фенотип, отличный в том. что уровни 2 — 5 были в среднем выше и активность РНКаэы была легко определяема.

Последний фенотип больше сочетается с тем, что ожидается от функционального пути 2-5А синтетазы (РНКазы ). У нормальных индивидуумов неизменное состояние пула

2-5А — измеримое; заметная часть этой внутриклеточной 2 — 5А может стать тесно ассоциированной с РНКаэой, т.е, активируя

РНКазу . В экспериментальных процедурах установлено, что в одноядерных кровяных клетках хронически инфицированных вирусом людей внутриклеточные уровни 2-5А ниже детектируемых и отсутствует активируемая РНКаза(, как определено доступными в настоящее время способами.

Важное открытие здесь то, что дефекты в пути 2-5А синтетаза/РНКаза были исправлены терапией ложноспаренной отРНК.

Результаты не объясняются прост< нормальными уровнями белка РНКаэыб без 25А, поскольку активность РНКазыЕ In vitrc не была восстановлена добавлением 2-5Л к экстрактам ОКПК. Белок РНКазы1 должен отсутствовать или быль ингибированным, Это подтверждается потерей связывания фотоаффино меченного аналога 2-5А. У обработанных пациентов уровни PHK ВИЧ уменьшались в ОКПК эа 10 — 20 дней, количество инфекционных центров (кокультивация) падало более медленно, Увеличение внутриклеточной 2-5А и активности РНКАзы(более близко соответствует уменьшению инфекционных центров у этих пациентов, Путь 2-5Л синтезы (РНКазы() становился у обработанных ВИЧ-инфицированных пациентов более активным, чем у здоровых людей, после нескольких недель терапии ложноспаренной отРНК, таким образом, некоторые хронические вирусные инфекции представляют собой состояние нехватки цтРНК, которое может быть исправлено подачей экэогенного источника биоактивной цтРНК, Пример 1. Координированная обработка IFN и 9тРНК.

Состояние нехватки g TPHK таково, что в нем обработанные IFN опухолевые клетки демонстрируют небольшое IFN-индуцированное прекращение роста или отсутствие такового. Это функциональный или операциональный тест на нехватку отРНК, который может быть строго подтвержден, если необходимо, различными биохимическими измерениями, описанными ниже. Во многих случаях клинический диагноз нехватки

g TP Н К станет до "таточным Ro мере того, как способ станет более широко практикуемым.

Известно, что IFN-устойчивые опухолевые клетки редко дефицитны по рецепторам IFN и могут содержать высокие или низкие уровни медиоторов, но в каждом случае они отвечают на экзогенно поданную 9тРНК, Эти примеры клинически значимы, поскольку они показывают, что отРНК существенно расширяет терапевтическое значение IFN u также других лимфокинов, например IL — 2, различные факторы стимулирования колоний и ФНО. Хроническая миелогенная лейкемия (ХМЛ) — подходящий случай. Около б0% пациентов с ХМЛ отвечают на один интерферон, в то время как 40% — нет, Последние не могут индуцировать 2 — 5А синтетаэу в одноядерных кровяных клетках (ОКК), как описано Rosenblum b/Cancer Res.. ч.460 р.4848, 1986). На фиг. 2,а представлен IFNрезистентный случай, который обработан ложноспаренной 9тРНК плюс IFN после короткого курса (7 дней) одного IFN, затем

2001917

20 ложноспаренная цтРНК в комбинации с

iFN, Этот пациент не мог индуцировать активность 2 — 5А синтетазы, получая один iFN, но показал существенный рост активности этого медиатора при комбинации IFN и ложноспаренной цтРНК. Индукция 2-5А синтетазы сопровождалась полной гематологической ремиссией, которая продолжалась несколько месяцев после мимолетного увеличения клеток крови, вызванного прерыванием предшествовавшей химотерапии, Измеряли также активность РНКазы и обнаружили, что она была в 10 — 100 раз выше нормальной (фиг, 3, дорожка 1), давая продукты расщепления ln

vitro, которые представляют собой дальнейшую деградацию обычных продуктов расщепления РН Казы(, Активность Р Н Казы1 вернулась к нормальным значениям и профиля расщепления после 30 дней терапии комбинацией IFN/g TP H Ê(ôèã. 3, äoðo>êêà 2), Этот вид ответа наблюдается регулярно.

Пример 2. Вирусная инфекция Т4 клеток.

Другое состояние нехватки цтРНК такое, при котором сам животный вирус (или его реплакативный интермедиатор) обеспечивает ингибирование активации медиаторов цтРНК или частично биоактивный цтРНК, хотя IFN и его медиаторы индуцированы вирусными инфекциями. В эту категорию попадают многие вирусы, ассоциированные с хронической симптоматологией у хозяина. Инфекция Т4 клетки

ВИЧ также может представлять такую ситуацию, как предложено на фиг. 1. Репликация

ВИЧ в Т4 клетках эффективно блокируется ложноспаренной цтРНК в культуре ткани (Европейский патент 0.213.921) несмотря на тот факт, что репликация ВЛЧ в этих же клетках только умеренно подавляется UFNальфа, -бета, или -гамма отдельно или в физиологических смесях. Поскольку сама PHK

ВИЧ демонстрирует существенную вторичную структуру, которая не блокируе ее собственную экспрессию, разные цтРНК, возможно, вызывает разные биологические ответы. Один район развитой структуры цтРНК на 5 -конце MPHK ВИЧ связывает полипептид с M 150000, предположительно транслирующий ВИЧ белок (tat)(Muesing et

al, Cell, ч.48, р,691, 1987). Ложноспаренная цтРНК может конкурировать с PHK ВИЧ за белок tat. Свойство поддерживать эффективную инфекцию ВИЧ, так же как и другие хронические виремии, может быть другим состоянием нехватки цтРНК при СПИД и

ССК.

Пример 3. Клетки, инфицированные

ВИЧ.

Третий тип состояния нехватки цтРНК наблюдался в лимфоцитах крови индивидуумов с хроническими вирусными инфекциями, такими как ВИЧ при СПИД и ССК. Preble

atet(J, infect. Dis, ч.152, 1985) сообщали, что эти клетки демонстрируют повышенный уровень цтРНК-зависимой 2-5А синтетаэы.

Этот результат был типичен для серии последовательных ССК и СПИД-пациентов, которые были изучены. Основа изобретения — центральная роль цтРНК в хозяйском выздоровлении и необходимость замещения состояний нехватки gTPHK подходящим источником экзогенной цтРНК, РНКазы1 часто истощена у пациентов с

СПИД и ССК (J une 6, 1987. The Lancet), однако PHKasaL может восстановиться до 0олее нормальной активности после нескольких недель терапии ложноспаренной цтРН К в некоторых случаях. Как предполагает фиг. 3, колонка 4, экстракты

С С К-лимфа цито в могут ин гиби ровать активность нормальной РНКазы при некоторых условиях. Поскольку экстракты ТХУ и эталоны не имеют ингибиторой активности, ингибитор, наблюдаемый в ОЯК CCK-пациентов и допускающий передачу, может быть описан Williams et а! в герпес-индуцированных клетках (Viroigy, V. 151, р,233, 1986). Также не обнаружены ингибиторы в экстрактах

ОЯК от здоровых индивидуумов (дорожка 5), изученных на сегодня.

Поскольку ложноспаренная цтРНК прямо воздействует на эти клетки, они должны быть также цтРНК-дефицитными. Следовательно, разные цтРНК имеют различные биоактивности (цтРНК ВИЧ являются ингибитором, в то время как цтРНК вЂ” нет). Похоже, что лимфоциты пациентов с ССК и СПИД цтРНК дефицитны в том смысле, что выполняются только некоторые иэ необходимых цтРНК зависимых функций. По крайней мере одна функция — поддержка существенного уровня биоактивной РНКазы1 не выполняется, если не добавлена экзогенная цтРН К.

Пример 4, Синдром хронической усталости.

Пример нехватки цтРНК, требующей подходящей заместительной терапии,— синдром хронической усталости (СХУ). Это состояние, охватывающее 10 — 12 миллионов американцев, трудно в диагностике: всеобщее расстройство, характеризуемое экстремальной утомленностью, увеличением лимфатических железок и такими констициональными симптомами, как потеря веса, потеря аппетита и т.д. Состояние возникает преимущественно у молодых, активных людей. Поскольку некоторые пациенты с СХУ

2001917

22 демонстрировали нейропсихиатрические изменения, такие как депрессия, потеря памяти и сходные расстройства, синдром хронической усталости иногда трудно отличим от полностью нейролотических рас- 5 стройств, в частности депрессии. Различные лабораторные исследования показывают, что у индивидуумов имеющих синдром хронической усталости, могут реплицироваться многие вирусы, и что такие люди становятся в реультате вирусными помойками", У таких индивидуумах часто присутствует вирус, ретроеирусы, вирусы герпеса и т,п.

Концентрацию молекул 2 — 5 A In vlvo, 15 биохимически связанное. аккуратное измерение внутриклеточных уровней отРНК у субьектов с синдромом хронической усталости проводили следующим образом: этанолрастворимые фракции образцов от 20 пациентов (очищенных на ВсоИ вЂ” Нурадое лимфоцитах периферической крови) анализировали на содержание в них 2 -5 4 е анализах с 2 — 5 A кор-целлюлозой (аффиннвя хроматография) с поли О-j ð)-рСр. 8 этом 25 анализе способность 2 — 5 A-актвированной

РНКаэы гидролизовать поли/У/ использовали для определения концентрации функциональнойй 2 -5 А.

Относительно уровни были определены 30 тестированием 15-нормальных субъектов, не переносящих вирусные инфекции, судя по отсутствие жара, отсутствию конституциональных симптомов, сыпи и т.д. Уровни концентрации 2 -5 А е их лимфоцитах опре- 35 деляли, используя калибровочные кривые, полученные с истинной 2 — 5A. Относительные уровни нормальных индивидуумов, выраженные е виде наномолей 2 — 54, варьирует от 0.3 до 1,1 нмоль/г клеток 40

ОКПК.

С использованием этого метода анализа было проверено десять пациентов, проявляющих обычные симптомы синдрома хронической усталости, и были получены 45 следующие результаты:

Пациенты с синдромом хронической усталости имеют е общем менее 0.1 и менее примерно 0,2 нмоль 2 — 5 А/грамм белка лимфоцитое. Решительная обработка таких 50 индивидуумов с синдромом хронической усталости обеспечена подачей экэогенных цтРНК до тех пор, пока енутриклеточный уровень 2 -5 А олигонуклеотидов не достигнет нормы, показывая возвращение внутриклеточного уровня отРНК к норме и/или до устранения клинической симптомологии пациента. Устойчивость пациента к синдрому хронической усталости и сопутствующим вирусам поддерживается продолжением измерений уровня енутриклеточных 2 -5 А олигонуклеотидов пациента и подачей экэогенной дтРНК по мере потребности для поддержания уровня 2 — 5 A в нормальном диапазоне, обычно более чем 0,2 нмоль 254 на грамм белка лимфоцитое.

Природная отРНК играет роль в хозяйской защите при борьбе с такой вирусной болезнью, как синдром хронической усталости, Специфическое уменьшение количества биоактивной gTPHK или ферментов, которые зависят от дтРНК, в особенности вирус-ассициированный имгибитор РНКаэы, сочетающийся с ненормально низкими уровнями 2 -5 А в лимфоцитах периферической крови, внутри специфических клеток, вносит вклад в развитие болезни. дтРНК, в особенности ложноспаренная ятРНК. обращает развитие болезни.

Пациенты, имеющие синдром хронической усталости, обработаны внутривенными введением от 200 до 600 мг в зависимости ог тяжести болезни и вирусной нагрузки (г1. г/Сц-14, О) дважды в неделю. Повышение уровня 2 -5 А ассоциировано с климическим улучшением. При опрвдвлении

«оличестеа применяемой дтРНК и частоты применения руководствуются измеренными уровнями 2 -5 4 в сочетании с клиническими улучшением пациента. Количество примененной отРНК обеспечивают уровень от 0,01 до 1 микрограмма ОтРН К на миллилитр системной циркуляции крови пациента сразу после применения при измерении в точке. удаленной от места введения.

Il p и м е р 5. Антивирусный аффект нв популяциях Т4 а леток.

Экзогенно примененная дтРНК, в частности ложноспаренная отРНК, восстанавливает способность пациента отвечать иа вирусную угрозу. В качестве вирусного состояния был выбран ВИЧ как один иэ наиболее опасных. Первичная мишень инфекции ВИЧ-Т4 лимфоциты и их популяция резко уменьшается с прогрессией вирусной инфекции. Далев уменьшение популяции Т4 клеток — нежелательный, количественно оцениваемый параметр болезни, чье уменьшение отражает ухудшение в болезни. Увеличение же популяции Т4 клетки — предпочтительное диагностическое свидетельство, показывающее улучшение при терапевтическом вмешательстве.

Нормальная популяция Т4 клеток у здорового индивидуума — 400 клеток на кубический миллиметр крови. Были проведены измерения у 31 пациентов (см. фиг. 4), диагностированных как находящихся в преССК или ССК состояние, они были разделены на три категории по абсолютному числу Т4

2001917

24 клетки на мм крови: а) более чем 300 (18 пациентов, данные не приведены), б) 150300 (13 пациентов) и в) менее 1500 (8 пациентов, среднее - 92). Пациенты из группы б) и в) были обработаны 100 — 200 мг rl> (Сц

U)/AmpllgenR дважды в неделю путем внутривенного введения s течение 3-16 месяцев (в среднем 8,4 месяца), В целях сравнения данные о популяциях Т4 клеток необработанных ВИЧ инфицированных пациентов (181) включены (саединенные треугольники) для того, чтобы показать неизбежное в противномм случае снижения популяции Т4 у таких индивидуумов.

Нулевая линия — это начальная абсолютная концентрация Т4 лимфацитов до начала терапии. Улучшение выражено в виде процентного изменения (позитивнага или негативного) от этой нулевой линии и показано на фиг. 4. Пациенты были первоначально обследованы и измерена концентрация

Т4 клеток. Группа пациентов б), показанная на фиг. 4 линией, соединяющей светлые кружки, имела концентрацию клеток Т4 в пределах 150-300 кл./мм . Эти пациенты получали снвчала 100 мг Ampllgen (внутривенно дважды в неделю) в виде безопасного количества и их обследовали на неблагоприятные реакции, затем была увеличена дааа до 200 мг, применяемая с тай же частотой. Вторая группа пациентов б), чья концентрация Т4 клеток была менее 150 кл/мм . гквучала 300 мг Ampllgen (внутривенно дважды в неделю). Процентные изменения от нуяевой линии показана в виде линии, соединяющей темные кружки. У необработанных пациентов (181) абсал ютная концентрация Т4 лимфоцитав продолжала резко умвньшатьсл, как показано линией, соединяющей треугольники.

Среднее количество Т4 клеток увеличивалось на 3/4 после 4 месяцев у 30 пациентов, нв 8 (после 8 месяцев у 10 пациентов и на 17% после 12 месяцев у 8 пациентов. Только 2 пациента (среднее количество Т4 клеток 82 клетки) продвинулись к СПИД, получая длящуюся терапи а г1в (С12, U)n, и еще у пациента с ССК, который прервал терапию на 2 месяца, развилась саркома Капоши.

Эти данные демонстрируют, чта инфицированные индивиды, чьи абсолютные уровни Т4 лимфоцитов ниже чем 150 кл/мм, требуют существенные количества лекарства для замедления темпа убывания Т4 клеток, однако пациенты в интервале 150-300 эффективно поддерживаются при меньших дозах. Эти данные также подчеркивают важность начала терапии да крутого спада я састочнии пациента ВИЧ. Эти данные двманстриру ат также прямую связь между степенью нехватки 9тРНК, определенной косвенно, на точно па абсолютной папуля5 ции Т4 клеток, и количество экэогеннай

9тРНК, требующейся для коррекции нехватки и восстановления полного здоровья (в виде восстановления популяции Т4 клеток да уровня, приближающегося у уровню ме10 нее тяжело инфицированных и неинфицированных индивидуумов), Чем больше нехватка Т4, тем большее количество дтРНК требуется для восстановления нехватки.

Пример 6, Заместительная терапия

15 атРНК при парамиксавирусной инфекции,,Цругай пример преходящей нехватки атРНК, требующей подходящей замести1ельнг. и терапии, — различные фазы жизни новорожденного и развития ребенка, у ко2С trраго иммунная система тела не полностью развита. В этих случаях могут возникать потенциально опасные для жиз»ь инфекции, из которых могут возникнуть самалитирующие инфекции в юности и

25 взрослом состоянии. Следует частный пример; члены семейства парамиксовируса, такив как респираторный синцитиальный вирус (РС В1. могут вызывать острый бронхиолит у детей (обычна 6 — 18 месяцев) с вще не

30 полностью развитой иммунной антивирусной системой защиты. В таких случаях заместительная терапия QrPHK rfn "йС12, U)n может быть круциальнай и прерывать та, что в противном случае может привести к ле35 тальнаму событию, Для развития этого нового понимания выращена линия клеток человека, полученных иэ амниана, обозначенная СС25 при стандаптных лабораторных условиях, Клет40 ки СС 25, голученные из American Type

Culture Collection Rockvill, Mary1ang, 0$А, поддерживают рост и репликацию PCB тем же образам. чта и человеческие ткани бранхиал новорожденных. Табл. 4 убедительно

45 демонстрирует, чта возможно снижение мультипликации PCB приблизительно на

99, используя даэы 9тРНК, которые хороша переносятся людьми.

Матс зы.

50 РНКаэы1. очищенные от экстрактов (в

100 мкг белка) ОКПК от здоровых индивидуумов или иэ клеток L929, инкубировали при условиях кар-целлюлозного анализа в присутствии пали(Щ(P)pCP (11000 расп./мин, 55 0,1 мКи,/ммаль) или поли(С)(э2Р(рСР(12400 расп./мин, 0,3 мКи/нмаль) после добавления истинной 2-5А (РэА4. 5 х 10 ) или 2-5А, выделенной иэ экстракта (12,5 мкг белка)

ОКПК от пациента 5 (на 9 неделе терапии лажнаспареннай 9ТРНК), поли(0)(Р)рСр и

2001917

26 вания аутопсией, проведенные на неотобранных пациентах, т.е. непредвзятый отбор пациентов в противоположность исследованиям бопсией на пациентах с гепатомега5 лией и тестом на повышенную функцию печени, всегда демонстрируют широкую интергепатическую патологию. Приблизительно 80-90 всех случаев аутопсии на пациентах со СПИД демонстрируют ано10 мальную анатомию печени. Печеночные аномалии включают закупорку сосудов, воспаление ворот, ожирение, фокальный некроз, гранулематоэ, желчное состояние, цирроз и гиперплазию Купферовских клеток

15 в приблизительном порядке частоты. Интересно, что в одном исследовании (Schnetderman et al, Annals internal Ме4. vol.

105, р.207, 1987) интергепатический диагноз саркомы Капоши на аутопсии был наиболее

20 распространенным специфическим интергепатическим патогеном (18 ).

Желчная болезнь к настоящему времени описана у небольшого числа пациентов со СПИД. В виде единичных случаев описа25 ны склеротический холангит, интрагепатические деструктивные нехватки желчных протоков и доброкачественная экстрагепатическая закупорка желчи на пациентах со

СПИД. В этих случаях не было отмечено

ЗО специфического этиологического агента; цитомегаловирус был привлечен в качестве возможной причины, вторичной к гистопатологическим находкам на биопсии. У пациентов со СПИД с доброкачественной

35 экстрагепатической желчной закупоркой, обычно присутствуют жалобы на печень, боли в правом верхнем квадранте и умеренный подъем билирубина. На аутопсии или лапаратомии был поставлен диагноз ампул

40 с водой — структуры, вторичной к фиброзу.

В двух случаях экстрагепвтической закупорки из желчного древа были выделены криптоспоридии. В других случаях привлекали внимание тельца включения цитомегалови45 руса вблизи от ампул с водой. Как и в описанном выше случае интрагепатического холангита, специфическая этиология неизвестна и специфические патогены могут играть только нерегулярную роль в патогенезе

50 этих расстройств. поли (С) (Р)рСР синтезировали из поли (У) или поли (Ц) (319гпа) и (P)pCp (Amersham) при помощи Т4 лигазы (Bethesda Research

Laboratories). В контрольных экспериментах в отвутствие РЗА4 на фильтрах из стекловолокна задерживалось 3300 расп./мин поли(U)(Р)рСр и 11000 расп./мин поли(C) (Р)рСр, что отнесли к отсутствию (О ) деградации.

Поскольку установлено, что образование инфекционных центров, индуцированных РСВ, включает прямое распространение вируса от клетки к клетке, просто повышением внутриклеточной отРИК можно эффективно снижать распространение PCB от клетки к клетке без значимых неблагоприятных эффектов для других тканей тела. .Таким образом, болезненная патология, вызванная потенциально самолимитированными патогенами, такими как PCB (семейство парамиксовирусов) и другие

PHK-образующие вирусы, которые поражают назально (трахеально) бронхиальное древо, таких как риновирусы или вирусы гриппа, может быть эффективно сдержана по механизму заместительной терапии дтРНК. Локальные входные ворота патогена, такие как воздушные пути (не ограничиваясь ими), могут иметь присущие или преходящие низкое содержание утРНК (9тРН К здесь определяется по способу действия как любая из тех молекул, которые включают уместные иммунные (антивирусные) защитные каскады для пресечения репродукции патогена /патологии ткани).

Пример 7. Обработка гепатита, Многочисленные наблюдения болезней печени со СПИД появились в литературе в течение последних 2-3 лет. Тема, к которой неоднократно обращаются, — это широкий массив гистологических находок как в образцах биопсии, направляемых иглой,так и биопсии во время аутопсии, Во всех исследованиях, упомянутых ниже, удовлетворены критерии диагноза СПИД Центра США по борьбе с болезнями, Атланта, Джорджия, США. Обычно присутствующие симптомы и черты пациентов, у которых обнаружена обширная болезнь печени, в целом неспецифичны и включают потерю веса, лихорадку, лимфоденопатию, гепатосплиномегалию и боли в животе. У большинства пациентов со

СПИД обычно повышены сериновые трансаминазы. У повышенных щелочных фосфа- 5 тах существует склонность быть непропорционально высокими. Предполагается, что такое увеличение щелочной фосфатазы коррелирует с гистологическим диагнозом гранулемной болезни, ИсследоВведение 9тРНК rln г (CtzU)n 200 мг дважды в неделю внутривенно исправляет или существенно улучшает основные кле5 точные аномалии, ассоциированные с мультипликацией вируса гепатита в (ВНВ). Для завершения этого утверждения был использован следующий способ.

Определение уровня ВГВ-специфической ДНК в сыворотке или плазме, Присут27

2001917

28 ствие связанной с сывороткой (или плазмой)

ДНК ВГ — индикатора присутствия вируса гепатита В определяли слот-блот гибридизацией. Образцы сыворотки разводили в

NH4OAc до конечной концентрации соли 1

М. Используя 72-ячеечный аппарат для микрофильтрации (ЗсЫelcher апб Schuell, Keene, N, Н.), образцы наносили прямо на нитроцеллюлоэный фильтр, который был предварительно эамочен в течение 10 мин в

1 M NH40Ac. ДН К денатурировали щелочью

ln situ и нейтрализовали. Разведения очищенной PHK ВНВ в нормальной человеческой сыворотке были проанализированы таким же образом для количественной оценки каждой слот-блот гибридизации. Фильтры отжигали, прегибридизовали, гибридизовали и отмывали в условиях высокой жесткости и акторадиографировали при стандартных условиях (Maniatis. Т., Frltsch, Е.Р., and Sambrook, J., Molecular Cloning: А

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982). Проба

PHK ВГВ, использованная в гибридизации, была получена из рекомбинантной плэзмиды, содержащей одну копию единичной длины ДНК ВГВ (HBs AG серотип adw2), клонированную по ЕсоР1 сайту. Плазмиду расщепляли УсоВ1 и ДНК ВГВ очищали в двух циклах препаративного злектрофореза в агароэном геле и электроэлюции. Очищенную ДНК ВГВ метили P-дЦТФ до удельной активности 1-2 х 10 имп./мин х мкг, ис9 пользуя способ мечения со случайным праймером (Felnberg, А.P„and Vogelsteln. В.

Analyt. 8Iochem, 132, 6-13, 1983), Уровень чувствительности, достигнутый при помощи этого анализа, равен 1 пг ДНК ВГВ, На этом уровне чувствительности детектируется

2,9 х 10 молекул ЖНК ВГВ.

Полученные рэдиоавтографы были оценены по степени относительной интенсивности, численно ранжированы согласно наблюденной интенсивности и описаны в табл. 5. Дни терапии даны в скобках.

Благодаря предлагаемому способу можно ставить клинический диагноз нехватки дтРНК, не основываясь на обширных лабораторных данных, Может также существовать много менее очевидных состояний нехватки дтРНК. Например, поскольку IFN действует как (обратимый — ?) ингибитор пролиферативных путем (Aulllo и др., СеИ, vot.43, рр. 793, 1985) и поскольку 9тРНК-зависимые медиаторы принадлежат к этим аутям, клетки, проводящие дифференцировку с опухолегенным/метастаэным потенциалом, могут быть дтРНК-дефицинтыми.

Из указанных примеров ясно, что по связанной биологической функции (напри10

55 мер, клеточный ответ на экзогенный IFN). или биохимической функции (например, повышенная 2-5А синтетаза), или по присутствию интермедиэтов 2-5 олигоаденилатного пути легко диагностировать состояния нехватки 9тРНК и определять степень деградации различными способами, включая а), Определение концентраций эндогенного 2-5 олигоаденилата; б), Количественный анализ концентрации 2-5А молекулярного размера 2-5А из образцов пациентов посредством жидкостной хроматографии высокого давления; в). Проверка биологической функциональности 2-5А синтетаэ у пациентов, используя анализ с расщеплением рибосомной РНК;

r . Анализ связывания с 2, 5 РзА (Р)3 рСр для определения уровня свободн.й (несвязанной) РНКэзыб в образцах пациентов; д). Кор-целлюлозный анализ (аффинная хроматография) с поли(0}-(P)pCp для характеристики специфичности активации

РНКэзыб 2 — %А, синтезированной в образцах пациента; е). Анализ с расщеплением рибосомальной РНК для определения уровня активации

РНКазыб 2-5А, синтезированной в образцах пациентов; ж), Анализ с расщеплением рибосомной

PHK для определения уровня активированной РНКазыб в образцах пациентов.

Некоторые из этих способов детально описаны в патентном описании, озаглавленном "Вырэбатывание метиаторов хозяйской защиты в биологические жидкости". серийный М 029, 823, зарегистрированном 12 августа 1987 r. и "Исправление двутяжевой

PHK аберрантных метаболических путей", серийный М 074,649, зарегистрированном

17 июля 1987.

Могут существовать также состояния достатка отРНК, например CML и лейкемия (волосатых — ?) клеток (ЛВ K) часто способны к ответу нэ IFN, который дается в виде единственной терапии и отражают внутриклеточные ситуации природного достатка

9тРНК. Для подтверждения этого замечания, обн аружены сходные уровни 2-5А синтетазэ — активирующей 9тРНК в ядрах одноядерных кровяных клеток от необработанных пациентов и в ядрах обработанных

IFN клеток Неба.

Ложноспэренная 9тРНК. В то время как многие цтРНК могут индуцировать лимфокины, включая IFN, и активировать 2-5А синтетазу, не все отРНК обладают этими свойствами. Из синтетических 9тРНК поли (1): поли (С) наилучший индуктор IFN и акти29

2001917

30 ватор 2-5А синтетазы, но он также очень токсичен. Поли(1): поли(C>2 LI) также обозначаемая ложноспаренной дтРНК или

AmplIgen R (НЕМ Research, INc, Rockvllle, Maryland, USA), содержит периодические остатки урацила в полипиримидиновой цепи. Ложное спаривание вызывает быстрый распад беэ нарушения биологической функции. Например, поли(1): поли (С21, U) проявляет антивирусную, антиопухолевую и повышающую иммунитет активность и не токсична. дтРНК используется в качестве заместительной терапии в терапии широкого спектра вирусов и рака. Ложйоспаренная дтРНК может быть, в частности, очень удобна при хронических вирусных инфекциях, включая обработку ССК, поскольку она и антивирусный агент широкого спектра. и усилитель мммунности, даже в высоких дозах она в сущности свободна от токсичности продолжительного действия. Данные на 45 последовательных пациентах, обработанных внутривенно 200-250 мг поли (1) - поли (С, 0) дважды в неделю, показывали быстрое снижение концентрации вируса (ВИЧ. CML и герпес) и долговременное усилие как Т, так и В-клеточной иммуности, сопровождающейся улучшенным выполнением, с отсутствием существенных побочных эффектов, У многих пациентов клинические ответы продолжались более приблизительно 18 месяцев или столь долго, сколь они продолжали терапии дтРН К (100-400 мг дважды в неделю). В некоторых случаях могут требоваться более часто применяемые большие дозы.

Вирусные инфекции и иммунные нехватки у

СПИД пациентов могут отличаться от одного индивидуума к другому, ни от одного агента нельзя ожидаться исправления всех возможных клинических проблем. Однако дтРНК может играть ведущую роль в различных режимах обработки. Например, поскольку дтРНК проявляет синергию с АЗТ в блокировании инфекции ВИЧ в Т4 клетках (описание N. 028.823), ложноспаренная дтРНК и очень низкие дозы АЗТ могут быть важной комбинацией на ранних стадиях инфекции, включая ССК.

Как дтРНК, так и IL-2 усиливают активность Т клеток, ПК клеток и LAK клеток, отсюда в комбинации два агента демонстрировали терапевтический синергизм без добавочной токсичности. Поскольку IFN усиливают дифференцировку В клеток и моноцитов, некоторые лимфокины могут усиливать способность gTPHK проМотировать специфические нейтрализующие антилела против ВИЧ и увеличить киллерную активность моноцитов. Сходным обра. зом, поскольку ретиноиды увеличивают число Т4 клеток и промотируют дифференцировку как Т, так и В клеток IFN, комбинация дтРНК с ретиноидами может обеспечить дополнительные преимущества при CCK u

СПИД. Комбинация дтРНК с тимусными пептидами может также иметь восстанавливающее действие на Т4 клетки, особенно у пациентов с очень низким числом Т4 клеток.

10 Тот факт, что дтРНК проявляет прямую антипролиферативную активность против клеток саркомы Капоши, которая может быть усилена добавлением IFN альфа или IL-2, предполагает новый противоопухолевый

15 режим при данной болезни. Контроль параметров кровяных клеток при СПИД выявил увеличение проблемы с ЦНС. С этой стороны ложноспаренная дтРНК пересекает мышиный гематознцефалический барьер в

20 количествах, достаточных для активации 25А аденилатсинтетазы в клетках паренхимы мозга. Следовател ьно, комбинация дтРН К с другими агентами, включая лимфокины, которые пересекают гематоэнцефалический

25 барьер, должна быть полезна при вируссвяэанных сумашествиях. Здесь лимфокины включают интерфероны, предпочтительно интерферон альфа, интерлейкины, в особенности интерлейкин- 2(IL 2) и рекомбинант30 ный интерлейкин-2 (rlL 2), и фактор некроза опухоли (ФНО), Такие включены лимфокин-активированные киллеры (RAK) образованные у животных в ответ на обработку лимфокином.

35 Когда в качестве лимфокина используется интерферон (альфа), обеспечивается количество от 0,01 до 100,000 IRU на милл»литр жидкости тела пациента. Когда лимфокин IL-2, предпочтительно rlL-2, 40 применяемое количество лежит в пределах от 10 ед. IL — 2 на кг тела пациента до эначе2 ний, приближающимся к непереносимым уровням токсичности для пациента, которые могут быть столь высоки к 10 ед. IL-2. Од6

45 нако наиболее эффективные уровни с переносимыми токсическими реакциями лежат в диапазоне от примерно 10 до примерно 10 ед. IL 2 на кг веса тела, 50 Обычно применяемые количества ложноспаренной дтРНК обеспечивают уровень от 0,1 до 1,000 мг дтРНК миллилитр жидкости тела пациента. Термин жидкость тела введен для ссылки на тот раствор сыворот55 ки. солей, витаминов и т.р., который циркулирует внутри организма и омывает ткани.

Когда оба агентта (дтРНК и лимфокин) применяются, они могут быть применены в смеси, отдельно или одновременно, или последовательно, 2001917

31

Внутриклеточная концентрация 2-5 А и активность 2-5 А синтетазы и РНКазы L In vitro в экстрактах ОКПК инфицированных вирусом индивидуумов

Применение дтРНК и лимфокина в комбинации включает случаи, в которых оба агента применяются вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых эти два агента применяются раздельно, но однов ременно.

Фиг. 1 — это схема, иллюстрирующая типичную нехватку дтРНК, которая приводит к болезненности хозяина, и достаток дтРНК, который приводит к выздоровлению хозяина. Биоактивная gTPHK вырабатывается внутриклеточно или вводится некоторыми вирусами (например, ЕМС) и включает последовательность энзиматических событий, включая продукцию лимфокина и активацию медиаторов, которая приводит к антивирусному состоянию, дифференцировке иммунных клеток и выздоровлению хозяина. ОтРНК, введенная различными вирусами (например, ВИЧ) или опухолевые клетки могут разрушать этот путь, действуя как ингибиторы. Физиологические события могут ограничивать образование дтP Н К или вызывать образование аберрантной дтРНК.

Также аномалии приводят к хроническим инфекциям и болезненности хозяина. При

ВИЧ и других хронических вирусных инфекциях иммунное расстройство может также быть результатом ингибитора РН Казыб (показано как альтернативный путь), который истощается подачей экзогенной дтРНК с подходящей конфигурацией, На фиг, 2, а и б — индукция 2-5А олигоаденилатсинтетазы ложноспаренной дтРНК в ОЯК от пациентов с CML. Пациент с CML был обработан одним ITN в течение нескольких дней (фиг. 2, а), затем ложноспаренной ОтРНК и IFN (фиг. 2, б), До и в течение обработки активность синтетазы измеряли в очищенных на FicoliORK.

Фиг. 3- это фотография пластин агарозного геля после электрофореза, демонстрирующая указанное число дорожек и полосы или зоны по длине каждой дорожки, Повышенная активность РНКазы, связанная с новым продуктом расщепления в ОЯК паци5

45 ентов с CMI, иллюстрирована на этой пластине, Венгерские клетки L929, которые поставляют рРНК, но не РНКазу1., депозированы на условиях Будапештской конвенции и Американский коллектор типов культур в качестве ATCC М CRL9659, клетки

L929 депозированы в качестве CCL 1 и однроядерные клетки от пациентов с CML получали согласно Kariko u Ludwig u Silverman и др., затем измеряли РНКазу из ОЯК.

Это также фотография пластин электрофорега в полиакриламидном геле, демонстрирующая присутствие фактора, ингибирующего PHKaayL), в экстрактах

ОКПК пациента с ССК, как определено в анализе с расщеплением рРНК. Экстракты клеток L929, которые служат источником и

РНКазы рРНК, и ОЯК были приготовлены по Kariko u Ludwig u Sliverman и др, соответственно. Дорожка 1:18 мкл экстракта клеток

L929 (150 мкг тотального белка) инкубировали в присутствии 4 мкл NP<0 буфера, использованного для лизиса ОЯК плюс 5,5 мкл воды.

Дорожка 2, идентична дорожке 1 за тем исключением, что вместо воды в инкубацию было добавлено 5,5 мкл истинной РэАз, 5 х х10 M.

Дорожка 3: идентична дорожке 1 за тем исключением, что до инкубации было добавлено 5,5 мкл ТХУ-растворимого экстракта (100 мкг тотального белка) из ОЯК от пациента с ССК.

Дорожка 4: 18 мкл экстракта клеток

L929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от пациента с CCK (100 мкг тотального белка) и

5,5 мкл воды, Дорожка 5: 18 мкл экстракта клеток

L929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от здорового индивида (100 мкл тотального белка) и 5,5 мкл воды. Обозначены 28S и 16S рРНК, а также нормальные уровни продуктов специфического расщепления 2-5А активированной РНКазь1(. (56) Flsch et ai, New Eng. J, Mecl., Sulg, 1987. — Marcus et aI, Nature, 1977, ч.66, р,815.

Таблица 1

2001917

Продолжение табл. 1

П р и м е ч а н и е. нмоль АТФ, включенной в 2-5 Аlмг белка, как определено в анализе с поли /1/: поли /С/-агарозой, стандартное отклонение 9, НО не определено; б нмоль/г белка, как определено в анализе с кор-целлюлозой (в повторности), стандартное отклонение 20 ; расп./мин 50 мг белка, как определено в анализе со.связыванием радиоактивности (в повторности), стандартное отклонение 20 ; определено в анализе с расщеплением рРНК(колонки 6 и 7) в двух независимых опытах.

Количество образующегося специфического продукта расщепления (СПР) определяли, денситомвтрируя фотографии гелей, и выражали в виде соотношения образующегося СПР к 18S и

28$ рРНК х 100; —, 0; +, 10-30; ++. 31-63; 64-85; ++++, 86-100.

2001917

36

Таблица 2

Влияние отРНК на образование инфекционных центров клетками

СС 25, инфицированными распираторным синцитиальным вирусом

Примечание.

* Данные не использованы для подсчета средних количеств.

Наивысшая концентрация ложноспаренной дтРНК(25 мкг/мл) была не токсична для клеток СС 25. Счетверенные ячейки сливающихся клеток СС 25 в 24-ячеечной плате были заново снабжены 1,5 мл поддерживающей среды. содержащей дтРНК в обозначенной концентрации за 1 ч до рассева клеток, инифицированных РСВ. Контрольно обработанные клетки снабжались свободной от дтРНК средой, 6 4 х 10 клеток СС 25 в суспензии инфицировали в общем объеме

1 мл, содержащем 5 х 10 БОЕ РСВ (МО1 12), Адсорбция вируса происходила в течение 2-часовой инкубации при 37 C с прерывистым ресуспендированием клеток. 8 конце этого периода суспензию разводили 1/100 поддерживающей средой, 0,5 мл аликвоты инфицированных клеток добавляли непосредственно в каждую экспериментальную ячейку и в каждую ячейку контроля инфекционных центров, В каждую ячейку контроля клеток добавляли 0,5 мл поддерживающей среды. Все культуры инкубировали при 37 С в 5О СОт

95 воздуха в течение 72 ч, фиксировали метанолом и окрашивали по Гимза. Бляшки (инфекционные центры) подсчитывали под микроскопом.

Таблица 3

2001917

Таблица 4

Активность 2-5А и РНКазы L, выделенных иэ ОКПК людей на гомополирибонуклеотидах

Среднее из трех независимых определений; стандартное отклонение 207ь.

Таблица.5

Действие применения дтРНК на уменьшения концентрации ДНК ВГВ (вируса гепатита В) в жидкости тела

П р и м е ч а н и е. Т* - ноль (перед терапией).

+ относится к относится к относительной интенсивности рентгеновской пленки, экспонированной в течение пяти дней и содержащей P вирусной ДНК. Больше плюсов (например, 3+ по сравнению с 1+) относится к более интенсивным и большим слот-блотам на рентгеновской пленке, показывающим присутствие большего количества вирусной ДНК. Для увеличения чувствительности измерения вируса использовали различные разведения сыворотки пациента, обычны равзедения 1:40, 1:200, 1:40 и 1:1500. Завершающие результаты были основаны на денситометрировании слот-блотов. Методология была основана на реагентах, обеспеченных Schlelcher and Schuell (материалы обдоэначены М 310 2/284). Сочетающиеся результаты были получены при анализе специфического вирусного антигена (иммуноаналиэ на определение поверхностного антигена гепатита В в сыворотке или плазме), набор доступен от Abbott laboratories (обозначен технически 83-0804/В12, датирован июлем 1985), 2001911 мм биологической жидкости. opìула изобр м ла изобретения

2. Способ по п,1, отличающиися тем, СПОСО ЛЕЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕ- что ложноспаренная Qt РНК представляет

СкИх СОСТОЯНИИ, СОПРОВОЖДАЮ- собой комплекс полиинозината и толицищИ СЯ НЕкВАТКОЙ 6Т РНК, включаю- тидилата, содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 щий введение в организм человека тера- уроциловых или гуанидиновых оснований.

5 певтического агента, отличающийся тем 3. Способ по п.1, отличающийся тем. что в качестве терапевтического а ен а ис что ложноспаренная Qt PHK содержит райполвзуют ложноспаренную Qt PHK кото оны разрыва связей и соответствует форрую вводят в количестве 1 - 1000 мкг на 1 10 муле г1> r(CI1 14) и. быздоройленое хозтн0

° аквайасфь (дцфференцароака уммуннык клеток

° анва русное сООт)Ояние

° аклаЫция д пРНК-зависимого nymv

° аорозодание лим рокона

° оиоакл706наЯ дпзРНК

ИИЧ

° отситстЮи

drv РНК неадекВощньа урОВень дт РНК, могущ присуп срВоВоть ингибшпоры да РнхопосредоВонноео пути

° оорпойюе аберрантиаго лим<рокина)киспотно-лаоильный ИРЮ

1 е поВышенная синтетазас менее (функциональным конечным мнУиотарам !РНКозои Ь)

+ снОженнОя 0хтиВI носп7ь иммунньп клеток

Болезненность хозяина (хронические инц екиии) ° сниженное ооразоВпние лимдокиню

° сниженныи медиптор неанпт8ная

ЯЬг 1

2001911

60 40 м

° °

В k

Фиг.,Г

l85

3 6IOO

Р дни после начэлв IFhl (31ое U) -35 -7 20 40 60 80 ЮО l20 дни после нвчвлв F4(3.106 щ

200 И

100 р

С о

2001917

Месяцы обработки

Составитель Г. Смирнова

Редактор Т. Пилипенко Техред М. Моргентал Корректор M. Ткач

Заказ 3154

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

- о

-40

5 -80

И. о

-80

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская нэб„4/5