Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов а и в

 

Изобретение относится к области биологии , а именно к вирусологии. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в разрушении вирионов ортомиксовирусов, которое проводят в ходе их центрифугирования через раствор глицерина неионным детергентом в кислой среде с рН 6,0 - 4,5. Кислый рН обусловливает эффективную солюбилизацию матриксного белка М1. что позволяет осуществить близкий к 100% выход вирионного РНП.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕ СГ1УБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4735248/13 (22) 19.07.89 (46) 07.01.92. Бюл. М1 (71) Институт вирусологии им. Д.И.ИвановСКОГО (72) О.П.Жирное (53) 575.224.2 (088.8) (56) J,Virology. 1972, ч.10, с.680-697.

Там же, 1969. ч.39, с,250-259.

Там же, 1976, ч,73, с.327-338. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СВОБОДНОГО

РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДА ВИРУСОВ

ГРИППА ТИПОВ А И В

Изобретение относится к биологии, а именно к вирусологии, Известен способ выделения рибонуклеопротеида (РНП) вирусов гриппа путем разрушения вирионов смесью неионного и ионного детергентов с последующим седиментационным выделением вирионного

РНП, Наиболее близким к изобретению является способ выделения РНП вирусов гриппа, предусматривающий обработку вирионов HeHQHHblM детергентом (нонидет

P-40 (HP-40), тритон N-101 (ТН-101). лиэолецитин и др.) в гипертонической среде (0,25

М NaCI) с нейтральным рН в диапазоне 7,4 — 8,1 с последующим выделением РНП посредством центрифугирования.

Однако известные способы не позволяют добиться полной диссоциации вирионного РНП и матриксного белка М1, что обусловливает невысокий выход свободного (без белка М1) РНП. В указанных работах

» . Ж 1703656 А1

lsl)s С 07 H 21/02, A 61 К 35/76 (57) Изобретение относится к области биологии, а именно к вирусологии. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в разрушении вирионов ортомиксовирусов, которое проводят в ходе их центрифугирования через раствор глицерина неионным детергентом а кислой среде с рН 6,0 — 4,5.

Кислый рН обуславливает эффективную солюбилиэацию матриксного белка М1, что позволяет осуществить близкий к 100";ь выход вирионного РНП. удается получать около 20$ РНП от общего его количества в исходном вирусе — источнике выделения, Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Для этого разрушение вирионов вируса гриппа, которое происходит в ходе центрифугирования вирионов через раствор глицерина (так называемая совмещенная с центрифугированием депротенизация вирионов), осуществляют неионным детергентом в кислой среде с рН 6,0 — 4,5 в гипо- либо изотонических условиях (40 — 150 мМ NaCI или KCI). Кислый рН обусловливает эффективную солюбилиэацию белка М1, что позволяет осуществить близкий к 100 выход свободного вирионного PHIL.

Пример. 9-дневные куриные эмбрионы заражают вирусами гриппа А (WSN) 33 (H1N1)A/Aichi 2/68 (H3N2), А/FP V/Weybridge(H7N7)B/Lee/40 и СУлан-Уде/131/25/86 с множественностью

1703656 около 10 БОЕ на эмбрион и инкубируют при

33 — 36 С. Через 24 — 72 ч собирают вирусосодержащую аллантоисную жидкость (а.ж.), которую осветляют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 мин (2 раза).

Осветленную а.ж, разводят раствором Хенкса до 64 ГАЕ/мл и 8,5 мл полученной суспензии наслаивают ня двухступенчатый градиент глицерина: 3,8 мл 15 -ного раствора, приготовленного на воде (интерслой), и 4,3 мл 25 -ного раствора (базовый слой), содержащего 1 HP-40 или ТН-101, NaCI 40 мМ ингибитор протеиназ-апротинин для предотвращения деградации вирусных белков и 10 мМ трис-гидроксиметиламинометана, который доводят до значения рН = 5,0, гидро ксиэтилпиперазинзтансульфоновой кислотой (трис-ГЭПЭС-буфер), либо морфолиноэтансульфоновой кислотой (трис-МЭСбуфер). 15 -ный интерслой служит для концентрации вирионов и предотвращает соприкосновение вирусосодержащей а.ж. с содержащим детергент базовым слоем.

Сформированные градиенты центрифугируют при 22 000 об/мин в течение 2,5 ч при 11 — 12 С (ротор SW 27.1; Spinko 1 5-65).

При центрифугировании вирионы проходят интерслой и входят в базовый слой, где подвергаются воздействию детергента в среде с рН 5,0. Детергент растворяет липопротеидную оболочку вируса, что вызывает освобождение оболоченных вирусных белков, НА1, НА2, и М1, которые после растворения остаются в растворе глицерина в силе невысокой скорости седиментации, а вирусные нуклеоиды (РНП с белком М1) или свободные РНП проходят 25 глицерин и осаждаются на дно центрифужной пробирки. После центрифугирования надосадочную жидкость аккуратно удаляют. Белки осадков (нуклеокапсидная фракция) растворяют в буфере (1 додецилсульфата натрия, 0,01 М дитиотреита, 0,2 M трис-HCI, рН 6-8) в течение 1 — 2 мин в кипящей водяной бане и анализируют с помощью злектрофореза в полиакриламидном геле. По данным полипептидного анализа осадков судят о степени депротеинизации вирионов.

Электрофореэ белков проводят в пластинах (толщина 1,2 мм). Разделительный гель (10 см) — трис-НС1-буфер (рН 8.8), фокусирующий гель (1 см)-трис-HCI-буфер (рН

6,8). Система полимеризации — рибофлавин

50 (8 мкгр/мл)-1 ЕМЕД (0,04 ) при облучении

УФ-светом, После злектрофореза гели окрашивают Кумаси R-350 (Pharmacia). Для количественной оценки белков окрашенные гели сканируют в видимом свете на микроденситометре CDS-200 (Beckman).

Количественная оценка результатов, выполненная на основании сканирования гелей, показывает, что в нуклеокапсидной фракции белок М 1 сохраняется в количествах не более 5 . Сканирование также показывает, что содержание главного нуклеокапсидного белка NP во фракции, изолированной при кислых рН, было сходным с таковым в препарате исходного вируса. Такой результат говорит о практически полной изоляции РНП из вируса с помощью данного способа выделения.

Характеристику вирусных РНП, выделенных при кислых рН предлагаемым способом, проводят электронно-микроскопическим исследованием нуклеокапсидных осадков. Оно показывает, что в препаратах, выделенных при кислом рН 6,0 — 4,5, обнаруживаюттипичные спиралевидные сегменты вирусного

РНП.

Таким образом, представленные результаты демонстрируют, что разрушение вирионов вируса гриппа типов А и В с помощью неионного детергента в среде с рН

6,0 — 4,5 позволяет с высокой эффективностью диссоциировать РНП от поверхностных гликопротеидов и матриксного белка

М1. что, с свою очередь, позволяет с помощью центрифугирования добиться практически полной изоляции вирионного рибонуклеопротеида из исходного вирусного препарата, что говорит о повышении выхода целевого продукта.

Формула изобретения

Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов А и В путем разрушения наружной оболочки вирусных вирионов неионным детергентом, фракционирования в градиенте концентрации глицерина, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, разрушение наружной оболочки вирусных вирионов осуществляют непосредственно при фракционировании, а раствор глицерина готовят на 5 — 25 мМ буфере трис-ГЭПЭС или трис-МЭС, рН 4,5 — 6,0, содержащем 40 — 150 мМ NaCI.