Способ электрохимической регенерации никотинамидадениндинуклеотида или никотинамидадениндинуклеотидфосфата

 

Изобретение касается замещенных сахаров, в частности регенерации никотинамидадениндинуклеотида (НАД<SP POS="POST">+</SP>) или никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ<SP POS="POST">+</SP>), используемых для определения метаболитов, и может быть использовано в медицине. Цель - увеличение стабильности электрода в нейтральной и слабощелочной средах. Процесс ведут электролизом восстановленной формы нуклеотида на электроде (из стеклоуглерода), модифицированном сажей, обработанной П-фенилендиамином или П-аминофенолом, причем сажу предварительно диспергируют ультразвуком в суспензии ацетона, содержащей 2-5% тефлонового лака и 12-20% сажи. Электролиз ведут при 0,09-0,19 В относительно нормального водородного электрода и PH 7-8 в 0,025-0,2M фосфатном буфере. Эти условия позволяют получить селективную систему НАД<SP POS="POST">+</SP>- или НАДФ<SP POS="POST">+</SP>- электрод, которая в 4-5 раз стабильнее в среде с PH 7-8, что обеспечивает возможность дальнейшего определения метаболитов - лактата и этанола, в области PH, оптимальной для применяемых ферментов. Кроме того, достигается снижение энергозатрат за счет проведения электролиза при меньшем потенциале (0,09-0,19 против 0,24 В). 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ВСЕСОЮЗНАЯ

ПИЕЛНЗ - ТййЧ Г Я

Б Б., 3 .:.:: А.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4305521/31-04 (22) 15.09.87 (46 30.07.89. Нюл. Р 28 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) IO.IO.Êàíàïàíåíå, Н.К.Ченас, и Ю.Ю.Кулис (53) 547.857.7.07 (088.8) (56) Gorton L, Torstensson А., Jaegfeldt H., Johansson G. Electrocatalytic oxidation of reduced

nicotinamide coenzymes by graphite

electrodes modified with an adsorbed

phenoxazinium salt, meldola blue.

J.Electroanal. Chem. 1984, vol.161, р. 103-120. (54) .СНОСОВ ЭЛЕКТРОХИИИЧЕСКОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА ИЛИ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДФОСФАТА (57) Изобретение касается замещенных сахаров, в частности регенерации. иикотинамидадениидинуклеотида (H или никотинамидадениндииуклеотидфосфата (НАДФИЕ, используемых для определения метаболитов, и может быть исI

Иэобретенеие относится к усовершенствованному электрохимическому способу регенерации никотинамидадениидинуклеотида (НАД+) или никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ +), которые используются для определения метаболитов.

Цель изобретения — увеличение стабильности электрода в нейтраль„„SU„„1497186- A 1 (51)4 С 07 Н 21/02, С 01 N 27/46

2 пользовано в медицине. Цель — увели- чение стабильности электрода в нейтральной и слабощелочной средах. Процесс ведут электролизом восстановленной формы нуклеотида на электроде (из стеклоуглерода), модифицирован-, ном сажей, обработанной п-фенилендиамином или п-аминофенолом, причем сажу предварительно диспергируют ультразвуком в суспензии ацетона, содержащей 2-5% тефлонового лака и f2-20% сажи. Электролиз ведут при

0,09-0,19 В относительно нормального водородного электрода и рН 7-8 в 0,025-0,2N фосфатном буфере. Эти условия позволяют получить селективную систему НАД- или НАДФ -электрод, Ю е которая в 4-5 раз стабильнее в среде с рН 7-8, что обеспечивает возможность дальнейшего определения метаболитов - лактата и этанола, в об.ласти рН, оптимальной для приме няемых ферментов. Кроме того, достигается снижение энергозатрат за счет проведения электролиза при меньшем потенциале 0,09-0,19 против

0,24 В. 3 табл. ной и слабощелочной средах — достигается модификацией стеклоугольного электрода сажей, обработанной п-аминофенолом или и-фенилендиамином.

Пример 1. Электрохнмическая регенерация НАД(Ф)

Рабочий электрод — стеклоуглеродный стержень (СУ-1500, СУ-1200), 1497186

Таблица1

Выход, 7.

Время электролиза, ч

НАД+ НАДФ

20+3 1 4

60+5 57+5

92+5 90t7

9713 93+5

S

35

3 эпоксидированный в тефлоновом цилиндре, погружают в диспергированную в течение 0,5-1 ч ультразвуковом при частоте 44 кГц суспензию сажи и тефлонового лака (2X) на

3-5 с. Затем электрод сушат, промывают дистиллированной водой и 0,1М фосфатным буфером. Модифицированный электрод погружают в S мл 0,5 мМ раствора НАДН или НАДФН в О,1 М фосфатном буфере (рН 7,5), проводят .Ь, электролиз при 25 С и потенциале

Ф

0,19 В относительно нормального водородного электрода. Через определен-!5 ное время электролиза (табл.1) спектрофотометрическим способом в растворе определяют количество образовавшегося НАД с использованием алкогольдегидрогеназы или НАДФ+ с 20 использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Результаты электролиза по предлагаемому способу приведены в табл.1» 25

Аналогичные опыты проводят при концентрациях лака 3,4,5Х и концентрациях сажи 15; 17,5; 20Х. Во всем интервале использованных кон; центраций получены близкие данные с точностью, указанной в табл.1.

Пример 2. Окисление НАДН в буферном растворе в присутствии аскорбиновой кислоты.

Злектрохимическое окисление смеси НАДН и аскорбиновой кислоты проводят в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,5 при потенциале 0,09 В относительно нормального водородного электрода на электроде, приготовленном аналогично примеру 1. Полярографом 1Р-7е определяют величину тока (мкА) в зависимости от концентрацик

НАДН и аскорбиновой кислоты в бу- . ,ферном растворе.

Зависимость тока электрода от концентрации НАДН и аскорбиновой кислоты (0,1 М фосфатный буферный раствор рН 7,5 потенциал электрода

0,09 В отн.н.в.э ° ) приведена в табл.2.

Hs данных табл.2 видно, что в интервале концентраций НАДН 0 ° 1

0,5 мМ наблюдается прямолинейная зависимость тока от концентрации.

Добавление аскорбиновой кислоты не имеет значительного влияния на величину силы тока. Кроме того, достижение запредельной величины силы тока окисления аскорбиновой кислоты происходит при более низких по сравнению с НАДН концентрациях.

Т а б л и ц а 2

Свойства

Концентрация НАДН, мМ

Ток электрода, мкА, в отсутствии аскорбиновой кислоты

Ток электрода, мкА,в присутствии:

0,2 мМ аскорбиновой кислоты, мкА

0,4 мМ аскорбиновой кислоты

0,6 мМ аскорбиновой кислоты

1 мМ аскорбиновой кислоты

1 1 IT

0,1 0,2 0,4 0,5 0,8 1

0,5 1,05 1,85 2,5 2,8 3

0 65 1,18 1,97 2,68 2,92 3,13

Оэ75 1в26 2э07 2э74 Зэ02 Зэ25

0,81 1,37 2,13 2,80 3,13 3,34

083 139 217 285 315 335

97186

Формула изобретения

Т а б л и ц а 3

Сутки

Относительный ток, Х

2

4

77

69

68

Как следует из этих результатов, электрод сохраняет работоспособность не менее 5 сут.

Аналогичные результаты получены при электролизе с использованием

0,025 и 0,2 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0 и 8,0), Составитель Г.Коннова

Редактор М.Келемеш Техред М.Дидык Корректор Т.Колб

Заказ 4402/28

Тираж 338

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðo ;, ул. Гагарина,101

5 14

Пример 3. Определение стабильности получаемой системы НАД(Ф)— электрод.

Готовят электрод по ранее описанной методике. Электролиз 10 мл 1мМ раствора НАД(Ф)Н в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,5) проводят при 25 С в анаэробной среде при постоянном потенциале 0,09 В относительно нормального водородного электрода (полярограф 1Р-.7е) ° В течение 5 сут периодически определяют величину тбка электрода.

Результаты изменения величины силы тока электрода при продолжительном его использовании приведены в табл.3 °

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить селективную систему НАД+ или НАДФ+ -электрод по сравнению с прототипом в 4-5 раз более стабильную в нейтральной и слабощелочной среде (рН 7,0-8,0), что позволяет ее использовать для дальнейшего определения метаболитов-лактата и этанола в области рН, оптимальной для применяемых ферментов.

Кроме того, по сравнению с прототипом (0,24В) по данному способу электролиз протекает при меньшем потенциаяй (0,09-0,19 В), что позволяет уменьшить конверсию энергии.

Способ электрохимической регенерации никотинамидадениндинуклеотида или никотинамидадениндинуклеотидфосфата на модифицированном электроде, включающий электролиз восстановленной формы в 0,025-0,2 М фосфатном буфере, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности системы в нейтральной и слабощелочной средах, стеклоуглеродный электрод модифицируют сажей, обработанной п-фенилендиамином или п-аминофенолом, которую перед нанесением на электрод диспергируют ультразвуком в суспензии ацетона, содержащей

2-5/ тефлонового лака и 12-203 сажи» а электролиз проводят при 0.09 — .

0,19 В относительно нормального водородного электрода при рН 7,0-8,0.