Способ расщепления полирибонуклеотидов

 

Саюз Советскик

Сециапкстическик республик

К АВТОРСКОМУ СВИЛЕТЕЛЬСТВУ (61) Лополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 31,12.75(2!) 2300302/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) ПриоритетОпубликовано 1502.79 Бюллетень №,6

Лата опубликования описания 1502,79 (51) М. Кл.

С 07 Н 21/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 547.963..32(088 ° 8j (72) Авторы изобретения

А.N Ìàýî, Л.Л.Киселев, Т.А.Авдонина и Т.Д,Машкова

Институт молекулярной биологии AII СССР (73) Заявитель (54) спОсОБ РАсЩеплениЯ пОлиРиБОнуклеОтиДОе

Изобретение относится к усовершенствованному способу расщепления полирибонуклеотидов с целью расширения набора способов, необходимых при анализе первичной структуры рибонукле-о иновой кислоты (РНК).

Известен способ расщепления полирибонуклеотидов с применением пиримидиловой рибонуклеазы с последующим разделением продуктов реакции иэвест- 10 ными методами.

До стадии расщепления полирибонуклеотидов рибонуклеазой (РНКаза) предварительно вводят водорастворимый карбодиимид, что позволяет блокировать расщепление пиримидил .РНКазой по уридиновым остаткам и по- зволяет специфически расщеплять модифицированный полимер лишь по цитидиловым остаткам.

Для установления кервичной структуры полирибонуклеотидов и РНК во многих случаях необходимо избирательное расщепление только по уридиновым звеньям, которое невозможно по известному способу.

Целью изобретения является избирательное расщепление полирибонуклеотидов по уридиновым звеньям.

Поставленная цель достигается предварительной обработкой полирибонуклеотидов смесью метоксиамина и метабисульфита натрия при рН 5-0,1 и температуре 37-40 С и инкубацией при рН 8-9.

Предварительная обработка полирибонуклеотидов приводит к устойчивости фосфодиэфирной связи между цитидиновыми основаниями,. модифицированными совокугным действием метоксиамина и метабисульфита натрия и соседним в 3-положении нуклеотидом при гидролизе пиримидил-РНКаэой.

В результате при действии на любые модифицированные полирибонуклеотиды пиримидил-РНКазой образуются олнгорибонуклеотиды, содержащие уридиновые остатки лишь в 3-положении, т.е. расщепление ферментом цепи происходит лишь по уридиновым звеньямм.

Способ состоит в предварительной обработке полирибонуклеотида смесью метоксиамина и метабисульфита натрия при рН 5-0,1 при температуре

37-40 С и инкубации при рН 8-9, в расщеплении полирибонуклеотида пиримидиловой рибонуклеазой с последующим разделением продуктов реакции.

647305

»»0

Формула изобретения

40 йСоставитель Л.НИ(<улина

Редактор Л.Новожилова Техред(0.Ниймет Корректор g„Мельниченко

Заказ "-43/21

Тираж 512 Подписное т111 И И П Н 1 ос уд H p c T B e H H o 1" 0 I< o v» H T e T H C C C P по делам изобретений и открытий.

11 303 5 „Мосина, )(-3 5 „Раушская наб, д. 4/5 филиал ППП "Патент, г.ужгород, ул«Проектная,4

Пример„;0,5 мг РНК иэ 50 5 рибосомных субчастиц 1- .Co8 инкубируют В течение 4 ч при 37-40 "С н 0,1 мл раствора, coäepæàùåão 125 г/л метоксиамина и 380 г/л метабисульфита натрия при рН 5-0,1, После окончания реакции РНК наносят на колонку

Об «не мОм 5 мл напОлнен и утс с Mo Ji o %".

Сефадексом Г-25. Смола зз колонке ураннонешеHB ВОДОЙ при рН 8 СкорОсть протока жидкости через колонку

5 мл/ч. С 1,7 до 3 мл собирают раствор содержащий РНК, освобожденную

От модифш<аторов. Раствор упаринают до 0,5 мл, добавляют ать»-=к до рН 89 и Выдержи(тзатст B течение 2-» <»1 при комнатной температуре для демодифтикации остаткон урйдина.

0,5 мл тсастнора РНК добанлякт (jHI<ðp(1oI .B 1; @ oHHH до рН 8 H 0, 00 2 пирим»иди«1-РНКазы и ныдержитза1ст B oH

3 i -38 С н те1ение 24 ч.

Затем раствор наносят на колонку об»немом 2,5 ил,- заполненную смолой ,Ц1 .АК-Сефадексом й-25. Смола н колонке ураннонешепа буфером Р», содержащим, г/л ;, 2<42 оксиметиламинометанатр 1с и 420 Mo»le"зины, ОН 7 5.,0 1.

На колон1< j подаютт раствор иэ,((н» х

ПОСЛЕДОНа ГЕзт»Ь НО CoeP H IeHHIi .(СОСУДОН, н перно..-. сосуде буферный раствор »1,, во втором "- буферный раствор Б

p=.»створ ФОсфОмонОзстеразы (О,. 6 Г/л1 при рН 8-"0 1 и 37=40 С.

Полу ;енный образец у гаривают и на=locH Ha пластинку 16х16 см,:гакрыт»"т (» . О H lt».I ст1оем (тезтлюлозы (3 Зг ), П»ласт11н;.;. „:. помеш ют н T eQ1»leтпHнь1и резервуар, "-1а дно которого наливают

100 мл раствора нормального бутанола, насыщенного водой.

НОСХО»тящуЮ Х12ОМатОГраф11Ю Н ЗтОй системе (цсоводят при комнатной температуре н Te".IeH=le 3-5 ч, — îêà r pàПИЦа ПОД1П11та(СЩЕГОСЯ РаСТВОРа НЕ

ДОСТИГаЕТ НтзрХНЕГO Края П»ЛаСТИНКИ, По Данным хрОматОграфии еДинствен

НЫМ 7(н»иж Ь»ИМСЯ НУКЛЕО ЭНДОМ Н (1»таЛИЗИ р Jeмой сМе»сН ян,ля»е ll «»<зи11и(1 „Остав111и ся на старте 1<атериал элюирую-. с пластины и гидролизуют до нуклеотидов 18-часовой инкубацией н 0,3 М

КОН при 37-38 С. Раствор нейтралиЭУ(СТ HC804, Удалнют КСОО, центрифугированием при 3000 об/мин и наносят на кнарцевукт пластину (16х16), покрыту:а тонким слоем целлюлозы.

Восходящую хроматографию проводят н системе — нормальный бутанол, насыщенный водой 1 которой движутся лишь нуклеозиды. II результате дефосфорилиронания и щелочного гидролиза смсси олигонуклеотидов нуклеозидным является лишь З.-концевой остаток, соотнетстнуюший уридину.

Остальной материал выскребают с плас-.ины, злтоируют полой, дефосфор лируют. Хрома -.CI;афин н тонком слое обнаруживает,что материал состоит лишь из Остатков .« "-МетОксицитиДина т аденОзиlта и гУанОзина, В процессе ан (лиза абнаружено, что

5 6 -.-(Ит идро-6-с»»л «+»"» 1» -метОксиЦити1 дин I!p("вращается B > — метОксицити ди1-1 при обр» . (1от

37-38" С -! а 3 ч. аким образом, исходные Олигон)уклеотиды содержат уридин лишь на 3 кс::,.»,: — Т,е. описанное расщепление поли. ;,ера проходит лишь »1о остаткам уридина. Снециф:;--.несть расщепления дост:.Точно высока, так как не обнаруж -:o при а;.ализе c...тана олигонуклеотидон никаки:. продуктов, кроме у, < а анных,.

Способ рас(т(еп1.ения полирибонуклеотидон с применением пиримидиловой рибонуклеазы с последующим разделеННеМ прОдуктов peакции О т л и ч ю шийся тем, что „c целыс избирательного расщепления по уридиновым звеньямтполирибонуклеотид предварительно обрабатывают смесью метокс1<ам11на и метабисульфита натри:1 при plI 5 О, 1 и те1»-;пературе 3740 С» а затем инкубируют при рН 8-9.