Способ получения рестриктазы в @ ai

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных и молекулярно-генетических работах. Изобретение заключается в том, что продуцент B.brevis ВКМ В-677 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B.brevis ВКМ- 677 со^^ержит новую рестриктазу BbvAl, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5'..,G.AANN' NNTTC...3' В количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvAl составляет 1800-2200 ед активно.сти на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции ВbvAf не содержит примесей фосфатаз, зкзонуклеаз и неспецифических зндонуклеаа. Учитывая особенности локализации участка узнавания рестриктазы BbvAl на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован в биотехнологичеСких и молекулярно-генетических работах.(Лс

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. (si)s С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

-ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4828105/13 (22) 24.05,90 (46) 15.02.92. Бюл. ¹ 6 (71) Институт биологической и медицинской химии AMH СССР (72) Н.Н.Соколов, А.Б.Фицнер, Н.В.Аникейчева, Э.Б.Хорошутина, О.Т.Самко, А.А,Калугин и Г.И,Либрик (53) 577.15 (088.8) (56) Nucl. Acids Res, 1989, v. 16, р, 271-313.

А.Sitespecific endonuclease (Xmnl) from

Xanthomonas manlhotis,.1980, v. 8, р. 61896198. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ

-BbvAI (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных и молекулярно-генетических работах. Изобретение заключается в том, что продуцент В.brevis BKM В-677 выращивают на питательной среде, содержащей исИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных и молекулярно-генетических работах.

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы И класса) широко применяются в структурных исследованиях ДНК, конструировании рекомбинантных молекул ДНК !и.

vitro, идентификации генетических..аномалий у человека и разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний, во многих областях молекулярной биологии, биохимии, вирусологии и микробиологии;

Обладая высокой специфичностью к узнаваемой и расщепляемой нуклеотидной после Ж 1712415 А1 точники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В.brevis ВКМ677 содержит новую рестриктазу BbvAI, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5 ...G.AANN NNTTC...З в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах.

Выход очищенного препарата рестриктазы

BbvAi составляет 1800 — 2200 ед активности на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции BbvAI не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз,. Учитывая особенности локализации участка узнавания рестриктазы ВЬчА! на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован в биотехнологических и молекулярно-генетических работах.

Ъ

ЬЗ довательности ДНК, рестриктазы представ-; д ляют удобную модель для изучения проблемы нуклеиново-белкового узнавания.

Рестриктааа, вйделенная ив Хаптоотопав

manlhotls 7AS1, расщепляет ДНК. фага 2 в 24 участках, ДН К Асг в пяти, ДН К1вх124 в трех, плазмиду pBR 322 в двух и не гидролизует з

ДНК обезьянего вируса SV40.

Согласно предлагаемому способу продуцент ВасИЬз brevis BKM-677 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода,- азота и минеральные соли в условиях аэрации. целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

1712415

Рестриктаза BbvAI — изошизомер Xmnl, узнает и расщепляет участок нуклеотидной последовательности ДНК 5 „,GAANN

NNTTC...3 . Фермент гидролизует ДНК фагаА по 24 участкам, ДНКАбг по пяти, ДНК р х 174 по трем, плазмиду pBR 322 по двум и не имеет сайтов узнавания на ДНК обезьянего вируса SV40.

Поиск штамма-продуцента осуществляют с помощью разработанного экспресс-метода тестирования рестриктазной активности в. толуольных экстрактах из клеток микроорганизмов с последующим электрофоретическим анализом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле.

Штамм Bacillus brevis 677 получен из

Всесоюзной Коллекции микроорганизмов АН СССР; где хранится:под М ВКМ

В-677 CIB 8146 = ATCC 10068 (каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов) и не является идентичным описанным в литературе продуцентам рестриктаз Bbvl, ВЬчП и BbvSI.

Характеристика штамма.

Морфологические особенности: подвижные палочки, грам-положительны (признак варьирует Грам Грам ).

Культурально-биохимические свойства: на скошенном агаре рост по штриху нежный, мелкие, блестящие, гладкие колонии; на чашке Петри с мясо-пептонным агаром мелкие, блестящие, гладкие колонии; на мясо-пептонном бульоне и бульоне Хоттингера осадок, Отношение к кислороду — аэроб.

Утилизация углеводов: на глюкозе, манните К вЂ”.

Индол и сероводород не образует.

Желатина уколом — Разжижение.

Чувствительность к антибиотикам: культура обладает множественной устойчивостью к антибиотикам; резистентна к пенициллину, канамицину, хлорамфениколу, оксациллину; чувствительна к стрептомицину, тетрациклину, неомицину, линкомицину, гентамицину,метициклину, нистатину.

Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.

Культура В.brevis ВКМ-677 хорошо растет в условиях аэрации при 37 С на бульоне

Хоттингера с добавлением 2 глюкозы, а также на среде, содержащей в 1 л, г: дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5;

МагНРО 12 НгО 2,2; NaCI 3; Mg 804 0,5;

СаС!г 0,25, рН 7,2-7,5. Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.

Рабочие культуры пересевают на бульон Хоттингера один раз в 7-10 дней. Хранят культуру в полужидком arape под вазелиновым маслом или в лиофилизированном виде

5 в ампулах, Культура непатогенна для мышей.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы В bvAI .объемом 40—

50 мкл содержит 0,05 М трис-HCI, рН 7,5, 10 0,01 M MgClz,0,001 М, дитиотреитола,0,1 М

NaCI,2мкгДНКфагаАи 0,5-10мкл фермента, Инкубацию проводят при 37 С в течение

60 мин. Продукты расщепления ДНК фага Арестриктазой BbvAI определяют

15 зле ктрофоретически в 1,5 -ном а га розном геле с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. За единицу активности фермента принимают то минимальное количество его (в мкл), которое необходимо для

20 полного расщепления 1 мкг ДНК фага А при

37 С за 1 ч инкубации в стандартных условиях инкубационной смеси.

Пример 1. Культуру Bacillus brevis

BKM-677 предварительно адаптируют в те25 чение ночи при 37 С в условиях аэрации на основной питательной среде, содержащей в

1 л, r: дрожжевой экстракт 5; пептон 10; глюкоза 5; йагНРО4.12Нг0 2,2; NaCI 3;

MgS04 0,5; СаС1г 0,25, рН среды 7,2 — 7,5.

30, Инокулят для ферментации готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из.расчета 1;10 и размножают в условиях аэрации..

Ферментацию культуры проводят после

35 добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при

37 С с аэрацией, рН 7,2.— 7,5, Во время ферм ентации р Н кул ьтурал ьной жидкости поддерживают в пределах 7.,3 — 7,6.

40 Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.

Выход сырой биомассы составляет 79 г/л культуральной жидкости, Содержание рестриктазы BbvAI в био45 массе оценить не возможно, поскольку культура В.brevis ВКМ-677 продуцирует еще две эндонуклеазы рестрикции BbvAII и ВЬчИ! со специфичностью соответственно рестриктаз Clal u BspMII.

50 Выделение,рестриктазы BbvAI.

10 r биомассы Bacillus brevis BKM-677 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуковой дезинтеграцией при 2-4 С, После удаления остатков

55 клеточных оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрацентрифугирования бесклеточный экстракт обрабатывают полиэтиленимином, фракционируют сернокислым аммонием, сульфатаммониевую.

1 712415

Составитель И. Привалова

Редактор Л. Пчолинская Техред М.Моргентал Корректор С. Шевкун

Заказ 510 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета Ао изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

5 6 фракцию диализуют и ведут последователь-. Биомасса штамма Bacillus brevis BKMно хроматографию на колонках с ДЭАЭ-цел- . 677 содержит зндонуклеазу рестрикции люлозой (ДЕ-52. "Ватман" ) и голубой . BbvAI, узнающую и расщепляющую нуклеосефарозой (фирмы "Фармация" ) и рехрома- тидную последовательность ДНК 5 6ААЙЙ

° тографию на ДЭАЭ-целлюлозе. 5 NNTTC...З" в-количествах, достаточных для

Получают 22000 ед рестриктазы в 20 мл получения рестриктазы в препаративных глицеринового буфера. Выход очищенного масштабах, препарата фермента 2200 ед на 1 г сырого Выход очищенного фермента BbvAI совеса биомассы. Рестриктаза BbvAI стабиль- ставляет 1800 — 2200 ед на 1 r сырой биомас-, но сохраняет активность в течение не менее 10 сы, 6-8 мес при хранении при -20 C. Фер-: Эндонуклеаза рестрикции BbyAI не сомент не содержит примесей фосфатаз, держит примесей неспецйфическихнуклеаз -- неспецифических эндонуклеаз и экзонукле; и фосфатаз. аз, пригоден для картирования ДНК и всех Уйитывая особенности локализацииучавидов генно-инженерных работ. 15 стка узнавания рестриктазы Bbvl на векторПример 2. Культивирование штамма ных молекулах ДНК, новый фермент может

Bacillus brevis ВКМ-677 проводят аналогич- быть использован в биотехнологических и но примеру 1, за исключением того, что в молекулярно-генетических работах.. качестве питательной среды используют мя- .

Ъ со-пептонный бульон c2% глюкозы. 20 Фо рмул а и зоб рете н и я

Выход биомассы 6 — 7 г/л культуральной Способ получения рестриктазы жидкости. BbvAI, заключающийся в культивироваПосле очистки фермента выход рестрик- . нии продуцирующего микроорганизма тазы составляет 1800 ед/r биомассы. Bacillus brevis ВКМ-677 на питательной

Таким образом; по предлагаемому спо- 25 среде,.содержащей источники углерода. собу получают новую рестриктазу BbvAI, . азота и минеральные соли, в условиях

Поиск новой рестриктазы проведен пу- . аэрации с последующим выделением фертем скрининга у 70 штаммов бактерий рода мента и очисткой его хроматографией.

Bacillus.