Способ ингибирования активности вируса иммунодефицита человека

 

(в) КЦ (и) 2 (51) 5 А 61 K 39 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

Ф (21) 5039670/14 (22) 03.06.92 (46) 1512.93 Бюл. Ъ 45-46 (76) Кожемякин Леонид Андреевич; Бондаренко

Игорь Георгиевич (54} СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ

ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным заболеваниям, и может быть использовано для профилактики и лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Целью изобетения является повышение эффективности ингибирования ВИЧ и удешевление способа

его ингибирования. Цель достигается тем, что в качестве препарата для ингибирования активности

ВИЧ используют дезоксирибонуклеиновую кислоту из лимфоцитов крови человека, облученную ультрафиолетом или используют антитела к облученной ультрафиолетом дезоксирибонуклеиновой кислоте из лимфоцитов крови человека. 4 табл.

2004249

Изобретение относится к медицине, в протеазы. эндонуклеазы) невозможно предчастности к инфекционным заболеваниям, и отвратить, либо существенно уменьшить может. быть использовано для профилакти- встраивание генетического материала ВИЧ ки и лечения синдрома приобретенного им- в генетические структуры лимфоцитов, помунодефицита (СПИД), ражаемых вирусом. Установлено, что именИзвестен способ ингибирования актив- но облученная ультрафиолетом ДНК иэ ности вируса иммунодефицита человека с лимфоцитевчеловекаиантителакнейоблапомощью химических препаратов естест- дают способностью ингибировать один из венного происхождения. ферментов, наиболее значимых для взаимоНедостаткамиданногоспособа являют- 10 действия ВИЧ с лимфоцитами — УФ-эндося низкая подавляющая способность препа- нуклеазу лимфоидных клеток. ратов в отношении ВИЧ и вмсокая их Способ реализуется следующим обрастоимость. зом. Из периферической крови здоровых доЦель изобретения заключается в повы- норов, стабилизированной гепарином, с шении эффективности ингибирования ак- 15 помощью иэопикнического центрифугиротивности ВИЧ и удешевлении способа ее вания в градиенте плотности фиколл-изопак ийгибирования. (d 1.077) выделяют лимфоциты. Клетки стиЦель достигается тем, что в качестве мулируют фитогемагглютинином P (Dlfco) в препарата для ингибирования активности течение 72 ч и поддерживают в среде RPMIВИЧ используют дезоксирибонуклеиновую 20 1640 с добавлением 10 -ной эмбриональкислоту из лимфоцитов крови человека, об- ной телячьей сыворотки, 100 ед/мл лученную ультрафиолетом, или используют . пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и антитела к дезоксирибонуклеиновой кисло- 10 -ного интерлейкина-2 (Biotest). Культуте из лимфоцитов крови человека, облучен- ры клеток инкубируют в лунках 24-луночноной ультрафиолетом. го планшета (2 мл/лунку) при 37 С в

Обработка дезоксирибонуклеиновой С02-инкубаторе, кислоты (ДНК) ультрафиолетом известна. Лимфоциты крови человека центрифуОднако при этом ДНК выделяют не из лим- гируют 15 мин при 1300g, осадок помещают фоцитов крови человека, а из бактериофа- в экстрагирующий буфер (10 мм трис-НС1, гов или бактерий, при этом облученную 30 рН 8,0; 100 мМ ЭДТА; 20 мкг/мл панкреатиультрафиолетом ДНК используют только ческой РНКазы; 0,5 додецилсульфа а накак исходный субстрат для определения ак- трия) и инкубируют 1 ч при 37 С. После тивности некоторых ферментов. инкубации добавляют протеиназу К (до 100

Получение антител к ДНК, облученной мкг/мл). Суспензию нагревают до 50 С, ультрафиолетом, также известно. охлаждают, добавляют равный объем феОднако антитела к облученной ультра- нола, насыщенного 0,5 М трис-HCI-буфефиолетом ДНК из лимфоцитов крови чело- ром, рН 8,0 и диализируют водную фазу века до сих riop не были получены и против 0,05 М трис-HCI-буфера, рН 8,0, соописаны. Известные антитела к облученной держащего 0,01 M ЭДТА, Из полученного ультрафиолетом ДНК используют только 40 раствора готовят раствор ДНК концентрадля связывания с облученной ДНК в анэли- ции 100 мкг/мл. тических целях, Полученный раствор облучают ультраСовременные препараты, используе- фиолетом с помощью бактерицидной лампы мые для ингибирования активности ВИЧ, (длина волны 254 нм).в дозе 500 J/м мин. направлены либо на прямое блокирование 45 Антитела к ДНК из лимфоцитов человевирусного генетического материала (так на- ка, облученной ультрафиолетом, получают зываемые "антисмысловые" РНК), либо на путем трехкратной иммунизации кроликов в угнетение активности вирусных ферментов, дозе 50 мкг на один этап иммунизации на необходимых для обеспечения жизненного одно животное. Кровь забирают из краевой цикла ВИЧ (азидотимидин, производные 50 вены уха, отделяют сыворотку центрифугидезоксинуклеотидов, рибавирин, интерфе- рованием при 1300g, получают фракцию имроны и др.). муноглобулинов осаждением сульфата

Ни один из способов ингибирования ак- аммония, диализируют против 0,1 М фостивности ВИЧ, непредусматриваетвлияния фатного буфера, рН 7,5 и выделяют необхона ферментные системы лимфоидных кле- 55 димые антитела с помощью аффинной ток, необходимые для ранних этапов взаи-, хроматографии на сефарозе 4В, связанной модействия генетического аппарата ВИЧ и с окисленной перманганатом калия (1,5 генетического материала лимфоцитов-ми- ммоль, 4 С, 30 мин) ДНК аз лимфоцитов . шеней БИЧ. Без воздействия на эти фер- крови человека. Элюцию антител с ДНК-сементные системы (внутриядерные фарозы осуществляют 0,1 M ацегатным бу2004249 фером, рН 5,0. Из полученного элюата гото- параметра. отражающего жизнеспособность вят рабочий раствор антител в концентра- клеток,выбираютотношениеОП540висследуции 10 мкгlмл. емой пробе к ОП 540 в пробе клеток. не инфиВ лунку 24-луночного планшета вносят цированных ВИЧ, выраженное в процентах.

1 мл суспензии активированных лймфоци- 5 Результаты исследования приведены е тов крови человека (5 10 клеток/мл) и су- табл. 1, 2, 3.

4 пернатант культуральной жидкости, Приведенные данные свидетельствуют содержащий ВИЧ (10 частиц/мл). После 1 ч о повышении жизнеспособности клеток и инкубации(37 С. постоянное встряхивание} следовательно об ингибировании активноклетки отмывают, доводят их концентрацию 10 сти ВИЧ под влиянием интерферона. до 5 10 в 1 мл и далее к 1 мл такой Сравнивая данные табл. 1 и 2, можно

4 суспензии добавляют 1 мл раствора ДНК видеть,чтоиспользованиеДНКизлимфоцииз лимфоцитов человека, облученной ульт- - тов человека, облученной ультрафиолетом, рафиолетом (10 мкг/мл) или 1 мл раствора достоверно интенсивнее(р < 0,05) ингибируантител к ДНК иэ лимфоцитов человека, об- 15 ет активность ВИЧ, чем применение а-ин- лученной ультрафиолетом (1 мкг/мл); терферона, .особенно на поздних стадиях .

Зффективность ингибирования активно- инфекционного процесса. сти ВИЧ оценивают по изменению уровня Сравнивая данные табл. 1. 2 и 3, можно жизнеспособности клеток, инфицированных сделать вывод, что применение антител к

ВИЧ, которое развивается под влиянием ан- 20 ДНК из лимфоцитов человека, облученной тивирусных воздействий f1o способу-прото- ультрафиолетом, достоверно (р < 0,001) интипу и заявляемому способу. тенсивнее ингибирует активность ВИЧ, чем

Параметром жизнеспособности клеток применение а-интерферона, и даже интенслужит их способность восстанавливать 3- сивкее, чем использование самой ДНК из (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетра- 25 лимфоцитов человека, облученной ультразолий бромид(МТТ) с образованием водоне- фиолетом. растворимого темно-синего формазана, Есть основания полагать, что такой эфимеющего максимум поглощения света при фект заявляемого способа связан с установ540 нм. Данный метод является быстрым ленным сильным инги >ирующим влиянием скрининговым тестом, удобным для оценки 30 ДН К из лимфоцитов человека, облученной как патогенного действия ВИЧ, так и токси- ультрафиолетом, и антител к ней на активческого влияния противовирусных препара- ность лимфоцитарного фермента УФ-эндотов на лимфоциты. нуклеазы, необходимой для ранних этапов

В соответствии со способом-прототи-.. взаимодействия ВИЧ и лимфоцитов-мишепом к клеточной культуре, содержащей 35 ней(см. табл.4), ВИЧ, добавляют 1 мл раствора а-интерфе- Из данных табл. 4, следует, то воздейрона(100 ед./мл) в среде RPM-1640. Каждый ствие по способу-прототипу не сопровождаопыт ставят в трех параллельных пробах. ется каким-либо влиянием на активность

В соответствии с заявляемым способом . УФ-эндонуклеазы, . к клеточной культуре, содержащей ВИЧ, до- 40 Весьма важным представляется тот бавляют 1 мл раствора ДНК из лимфоцитов факт,.что антитела к ДНК иэ лимфоцитов человека, облученной ультрафиолетом (10 человека, облученной ультрафиолетом, еще мкг/мл) или 1 мл раствора антител к ДНК из интенсивнее ингибируют активност ВИЧ, лимфоцитов человека, облученной ультра- чем сама ДНК из лимфоцитов, облученная фиолетом (1 мкг/мл). Каждый опыт ставят в 45 ультрафиолетом, Это дает основания полатрех параллельных пробах, гать, что при MclloRúýoâàíèè облучен ной ДНК

Каждые двое суток на протяжении 20дн из лимфоцитов человека в организме больноиэ каждой пробы отбирают 100 мкл суспен- го будут образовываться антитела, обладаю- . зииклеток, помещают влунку96-луночного щие тем же (и даже более выраженным) плоскодонного планшета и добавляют 10 50 антивирусным действием, что и исходный мкл 0,5 -ного раствора МТТ. Планшет ин- препарат(ДНК, облученная ультрафиолетом), кубируют в С02-i нкубаторе 4 ч при 37ОС. т.е. названный исходный препарат может

После этого супернатант отсасывают, вно- рассматриваться как потенциальная вакцина сят 150 мкл 0,04 н. раствора HCI в изопро- против ВИЧ. Сказанноетем более важно, что паноле, который экстрагирует из клеток 55 антитела, образующиеся при введении в орформазан, и определяют оптическую плот- ганизм больного а-интерферона, обладают ность экстракта при длине волны 540 нм (ОП действием. противоположным эффектам са540) на спектрофотометре с вертикальным мого интерферона. пучком света (Multlskan Plus). B качестве (56) Jama 1985, jol. 254: N. 18, р. 2521,2529.

t аблица 1

Жизнеспособность клеток, инфицированных ВИЧ, на фоне применения а-интерферона

Таблица 2

)Кизнеспособность клеток, инфицированных ВИЧ, на фоне применения

ДНК из лимфоцитов человека, облученной ультрафиолетом

Таблица 3

Жизнеспособность клеток, инфицированных ВИЧ, на фоне применения антител к ДНК иэ лимфоцитов челов@са, облученной ультрафиолетом

2004249

Таблица 4

Активность УФ-зндонуклеазы в лимфоцитах прови человека при воздействии по способу-прототипу и заявляемому способу

СоставитеЪь И. Бондаренко

Редактор Г. Мельникова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор M. Петрова

Заказ 3362

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Рэушская наб., 4/6

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

1. СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА

ЧЕЛОВЕКА путем обработки клеток химическим препаратом, отличающийся тем, что в качестве химического препарата используют дезоксирибонуклеиновую кислоту иэ лимфоцитов крови человека, облученную ультрафиолетовым светом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве химического препарата используют антитела к облучен ной ультрафиолетовым светом дезоксирибонуклеиновой кислоте из лимфоцитов крови человека,