Полипептид, фрагмент днк hc 256 и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида нс 80, слитого с бета-галактозизадой e.coli

 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Сущность изобретения состоит в том, что получен полипептид HC80 со свойствами NS3 белка вируса гепатита C, обладающий способностью связывать антитела к продукту гена NS4 ВГС. Полипептид получают в штамме бактерий Escherichia coli, трансформированном рекомбинантной плазмидой pHC 256, содержащей нуклеотидную последовательность фрагмента гена NS 3, слитую с геном бета-галактозидазы E. coli, или в штамме E. coli, трансформированном плазмидой pHC 256 F. 3 с. п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и иммунологии и может быть использовано для серодиагностики гепатита С.

Гепатит С возникает в результате заражения вирусом гепатита С и отличается от других форм вирусассоциированных заболеваний печени, включая уже известные гепатит А, гепатит В, гепатит D, а также от гепатитов, вызванных вирусом Эпштейн-Барра или цитомегаловирусом. Заражение ВГС, как правило, осуществляется при переливании крови. ВГС при попадании в организм поражает клетки печени. Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В. Однако показано, что почти у пятидесяти процентов пациентов болезнь принимает хроническое течение с периодическим обострением процесса и у двадцати процентов хронических больных гепатитом С заболевание приводит к циррозу печени. Кроме того, имеются данные о том, что заражение вирусом гепатита С имеет прямое отношение к возникновению первичного рака печени. Поэтому для проведения противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного выявления ВГС-инфекции крайне актуальна разработка диагностических препаратов, позволяющих выявлять инфицированных ВГС.

Многочисленные исследования ВГС позволили определить его структуру, организацию генома, выяснить механизм экспрессии и функции отдельных вирусных белков. ВГС имеет позитивный РНК-геном, состоящий примерно из 9400 нуклеотидов. Данная последовательность нуклеотидов содержит единственную большую открытую рамку считывания, которая перекрывает большую часть вирусного генома и может кодировать большой вирусспецифический полипептид, состоящий из 3010 3011 аминокислотных остатков, который является предшественником индивидуальных вирусных структурных и неструктурных белков. Белок-предшественник процессируется под действием клеточных и вирусспецифической протеаз. К структурным белкам ВГС относятся кор(ядерный)антиген размером 19 кДа. Корантиген обладает способностью связывать РНК и образует нуклеокапсид ВГС. Два других структурных белка представлены гликопротеинами размером около 32 и 72 кДа, которые процессируются, как и корантиген, с N-концевой области вирусспецифического полипротеина. Белок размером 32 кДа предположительно является матриксным или поверхностным белком вириона ВГС, а белок размером 72 кДа является либо поверхностным белком вириона, либо первым неструктурным белком ВГС (NS1). Белок NS2 ВГС размером 23 кДа ассоциирован с мембранами зараженных вирусом клеток, однако его функциональная роль неизвестна. Белок NS3 размером 60 кДа обладает нуклеотид трифосфат-связывающей, геликазной активностью и, по-видимому, участвует в репликации генома ВГС; он обладает также ферментативной активностью сериновой протеазы, которая, по-видимому, обеспечивает процессирование неструктурных белков. Продукты экспрессии генов NS4 и NS5 еще не охарактеризованы, однако известно, что они могут кодировать белки размером 52 и 116 кДа соответственно. Как и белок NS2, NS4 очень гидрофобен и, вероятно, является мембраносвязывающим белком с неизвестной функцией. Продукт экспрессии гена NS5, по-видимому, многофункционален, данный белок обладает, в частности, РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, которая используется при репликации вирусного генома.

Большинство методов диагностики ВГС-инфекции основано на определении антител к белкам ВГС в сыворотках крови (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяются принципы иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунологического анализа (РИА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлуоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации. Одним из наиболее перспективных путей совершенствования всех этих диагностических тест-систем является использование в качестве антителосвязывающего субстрата рекомбинантных белков ВГС, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты ВГС вместо вирусных антигенов, не только увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем, но и делает их безопасными в работе. Существует значительное число разработок, направленных на создание рекомбинантных белков-продуктов генов ВГС, и, в частности, гена белка NS3 ВГС [1-3] В настоящее время ведется поиск полипептидов, наиболее перспективных для диагностики, лечения и профилактики гепатита С. Исследования ведутся как в направлении выбора клеток-продуцентов [1] так и в направлении выбора наиболее антигенноактивных детерминант и создания рекомбинантных полипептидов продуктов генов ВГС.

Сущность данного изобретения состоит в том, что предложен оригинальный гибридный полипептид НС80, состоящий из продукта экспрессии фрагмента генома ВГС (80 аминокислотных остатков белка NS3 ВГС, аминокислотные остатки 1171-1250) свободный или слитный с бета-галактозидазой E.coli, связывающий антитела к продукту гена белка NS3 ВГС, отличающийся от известных: 1) размером (полипептид 33с соответствует 1192 1457 аминокислотным остаткам белка NS3 ВГС, а полипептид р1192 соответствует 1192-1240 аминокислотным остаткам белка NS3 ВГС; 2) наличием аминокислотных замен (например, V-1 в 1196-м положении, S-N в 1200-м положении, M-L в 1201-м положении и др.).

Сущность изобретения состоит также в том, что предложен фрагмент ДНК, кодирующий полипептид НС80 и входящий в состав рекомбинантной плазмиды рНС256, и штамм E. coli ВКПМ, трансформированный рекомбинантной плазмидой рНС256, включающий фрагмент ДНК НС256, и экспрессирующий белок НС80.

Штамм E.coli продуцент белка НС80 характеризуется следующими признаками: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные. Клетки растут на среде LB и других питательных средах, используемых для культивирования Escherichia coli и простых питательных средах, содержащих 10 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина. При выращивании на питательных агаризованных средах при 37^оС колонии клеток гладкие, круглые, блестящие, бледно-желтые, прозрачные, края ровные. При росте на тех же средах, но при 30-32^оС колонии клеток имеют "слизистый" фенотип, характерный для колоний клеток с lon мутациями, растущими при пониженной температуре. При росте на жидких средах клетки образуют ровную интенсивную муть. Клетки хорошо растут при температуре от 4 до 37^оС при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота клетки используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде пептона и аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Мальтозу не сбраживают. Уреазная активность не образуется. Трансформацию клеток плазмидами с промоторами бактериофага проводят по стандартным методикам. Полученные клоны клеток с плазмидами выращивают на среде LB при температуре 30-32^оС. Препаративную ферментацию для наработки рекомбинантного белка проводят при температуре 39-42^оС. Продуктивность штамма при использовании плазмидных векторов экспрессии с промоторами бактериофага лямбда составляет около 500 мкг рекомбинантного белка на 1 мл клеточной суспензии при плотности культуры 1 х 10 кл/мл. Белок стабилен при температуре 4^оС в течение 3-4 месяцев.

Рекомбинантный полипептид НС80, выделенный и очищенный из штамма продуцента, иммобилизованный на твердом носителе (полихлорвиниловые или полистироловые планшеты, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты и др.), связывает антитела к продуктам гена NS3 белка ВГС в сыворотках крови и др. биологических жидкостях. Штамм депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

П р и м е р 1. Получение фрагмента ДНК НС256.

Для получения фрагмента ДНК были использованы олигонуклеотиды: cr1 5' GGGGATCCTGCCCCTTCGGGCACGCTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGTAT 3' cr2 5' GCACCCGGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTGCCCGTAGAGTCCATGG AAACTAC 3' cr3 5' TATGCGGTCTCCGGTCTTCACGGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTAC 3' cr4 5' CGCAGTCATTTCAAGTGGCCCACCTACACGCTCCCACTGGCAGC 3' cr5 5' GGCAAGAGTACTAAAGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGCTGCAGGG 3'
rc1 5' ATGCCCACAGCGTGCCCGAAGGGGCAGGATCCCC 3'
rc3 5' CCGTGAAGACCGGAAGACCGCATAGTAGTTTCCATGGACTCTACGGGCACAAAGTC
CACCGCCTTCGCAACCCCCGGGTGCATACGGCAGCCCGGAAG 3'
rc3 5' TGGGCCACTTGAAATGACTGCGGTACGGCCGGGGGGGATGAGTTGT 3
rc4 5' CCCTGCAGCTTGTACCCTTGGGCTGCATATGCAGCCGGCACTTTAGTAC
TCTTGCCGCTGCCAGTGGGAGCGTGTAGG 3'
Олигонуклеотиды cr 1, 2, 3, 4, 5 и rc 1, 2, 3, 4 смешивают и кинируют с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Для этого в эппендорфовскую пробирку на 1,5 мл вносят по 50 пмолей каждого из олигонуклеотидов, 50 мкл десятикратного буфера для киназы (0,5 М трис НСl, рН 7,6, 0,1 М MgCl, 50 мМ дитиотрейтол, 1 мМ спермидина и 1 мМ ЭДТА), 250 пмоль (150 мкКИ) [гамма-Р] АТФ (удельная активность 3000 Ки/ммоль), 150 единицами активности полинуклеотидкиназы фага Т4 и бидистиллированной воды до объема 500 мкл и инкубируют 30-60 мин при 37^оС. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 98^оС, охлаждают до 16^оС и сшивают ДНК-лигазой. Для этого 100 мкл смеси обработанных киназой олигонуклеотидов смешивают с 12 мкл десятикратного буфера для лигирования (0,66М трис-НСl, рН 7,6, 50 мМ MgCl, 50 мМ дитиотрейтол и 10 мМ АТФ), 8 мкл (50 единиц активности) ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 4^оС в течение 5 ч. Затем реакционную смесь нагревают до температуры 65^оС в течение 15 мин для инактивации фермента. 10 мкл раствора обработанных киназой и лигазой олигонуклеотидов используют для анализа ДНК в 12% полиакриламидном геле (после авторадиографии виден фрагмент размером около 256 п.н.). 100 мкл раствора полученного фрагмента ДНК гидролизуют рестриктазами BamHI и PstI в буферном растворе для рестрикции (конечная концентрация 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl, 1 мМ дитиотрейтол) в течение 5 ч при температуре 37^оС. Ферменты инактивируют нагреванием при 70^оС. 10 мкл раствора фрагментов ДНК, гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами, используют для анализа ДНК в 12% полиакриламидном геле (после авторадиографии виден фрагмент размером около 256 п.н.).

ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 20 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестрикционными эндонуклеазами фрагмента ДНК лигируют ДНК векторной плазмиды pUC18, обработанной рестриктазами BamHI и PstI. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамма DH5альфа по обычной методике (Molecular cloning, New Jork, CSHL, 1982). Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют и выделяют плазмидную ДНК, как описано (Nature, 1981, 145, 1365). Выделенную плазмидную ДНК обрабатывают рестриктазами Bam HI и PstI и гидролизат исследуют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле. Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма HCNS3 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 2686 и 256 п.н. что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС256.

Методом Сэнгера (PNAS, 1977, 74, 5463) определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК НС256:
GGGGATCCTGCCCCTTCGGGCACGCTGTGGGCATCTTCCGGGCTGCCGCCGTATGCACC
CGGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTGCCCGTAGAGTCCATGGAAACTACTAT
GCGGTCTCCGGTCTTCACGGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTACCGCAGTCATTTC
AAGTGGCCCACCTACACGCTCCCACTGGCAGCGGCAAGAGTACTAAAGTGCCGGCT
GCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGCTGCAGGG
Данный фрагмент ДНК НС256 также был получен путем известного метода цепной реакции полимеризации с использованием олигонуклеотидов cr1 и rc4.

П р и м е р 2. Получение плазмиды рНС256.

Синтезированный фрагмент ДНК НС256 гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI, ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 50 мкл дистиллированной воды. 10 мкл обработанного рестриктазами фрагмента ДНК лигируют с ДНК векторной плазмиды pEL5А, обработанной рестриктазами PstI и BamHI. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli штамм PLT90. Трансформированные клетки высевают на чашки с 1,2% LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Выросшие колонии проверяют на наличие рекомбинантных плазмид. Для этого бактериальные клетки лизируют, выделяют плазмидную ДНК, которую гидролизуют рестриктазами PstI и BamHI.

Гидролизат плазмидной ДНК из отобранного рекомбинантного штамма НС86 имеет на электрофореграмме 2 полосы ДНК размерами 6400 и 256 нуклеотидов, что соответствует размерам вектора и синтезированного фрагмента ДНК НС256. При определении нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК установлено, что синтезированный фрагмент ДНК в плазмиде рНС256 через BamHI сайт присоединен к С-концевому участку бета-галактозидазы E.coli. Таким образом, плазмида рНС256 кодирует рекомбинантный белок, содержащий аминокислотные последовательности NS3 белка ВГС, слитые с последовательностью бета-галактозидазы E.coli.

Аналогичным образом получена плазмида рНС256F, в которой фрагмент ДНК НС256 находится непосредственно под контролем промотора бактериофага лямбда croLacZ. Данная плазмидная ДНК обеспечивает синтез NS3 белка ВГС, свободного от аминокислотных последовательностей бега-галактозидазы E.coli.

П р и м е р 3. Штамм E.coli НС80, содержащий плазмиду рНС256, выращивают в 100 мл среды LB при 30^оС до плотности 8х10 кл/мл. После этого температуру повышают до 39^оС и растят клетки еще в течение 2 ч. Клетки собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин. Клетки лизируют ультразвуком и выделяют белки по описанному методу (EMBO J. 1984, 3, 1429).

Выделенные белки анализируют в 10% ПААГ по стандартному методу Лэммли (Nature, 227, 680-685, 1970). В качестве маркеров молекулярных масс белков используют набор фирмы "Pharmacia", содержащий маркеры молекулярных масс от 10 до 160 кД. В качестве контроля используют полученный аналогичным образом лизат клеток штамма E.coli PLT90, содержащий векторную плазмиду pEL5A и не содержащий полученную нами плазмиду pHC256. Сравнительный анализ белкового состава показывает, что штамм E. coli НС256, содержащий плазмиду рНС256, экспрессирует гибридный полипептид с молекулярной массой 120-130 кД. Этот полипептид назван НС80. Аминокислотная последовательность гибридного полипептида (последовательность бета-галактозидазы не представлена), определенная на основании нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента ДНК, кодирующего участок гена NS3 следующая:
C P F G H A V G I F R A A V C T R G V A K A V D F V
P V E S M E T T M R S P V F T D N S S P P A V P Q S
F Q V A H L H A P T G S G K S T K V P A A Y A A Q G
Y K
П р и м е р 4. Контроль антигенной активности.

Контроль антигенной активности препаратов осуществляют методом иммуноблотинга. Для этого проводят пpоцедуру электрофореза (как описано в примере 3), затем осуществляют перенос электрофоретически разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны ВН85 с помощью аппарата для электроблотинга в режиме 24В, 400 мА в течение 1 ч. Качество переноса проверяют окрашиванием мембран раствором 0,2 Понсо S в 3%-ной ТХУ в течение 5 мин при комнатной температуре. Краску дважды отмывают в течение 30 мин буфером TBS (0,15 M NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,4) с 0,05%-ным Твина-20 при комнатной температуре. На следующем этапе проводят блокирование нитроцеллюлозных мембран с иммобилизованными белками раствором 5%-ного обезжиренного сухого молока, приготовленном на 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, в течение 30 мин при комнатной температуре. После блокирования мембраны в течение 1 ч при 37^оС обрабатывают сыворотками, содержащими антитела к NS3 белку ВГС, в разведении 1:100. Затем проводят трехкратную отмывку мембран ТBS с 0,05%-ным Твином-20 в течение 30 мин при комнатной температуре. Выявление специфических антител осуществляют инкубацией фильтра с антивидовым пероксидазным конъюгатом при 37^оС в течение часа. Далее повторяют процедуру трехкратной отмывки. Реакцию проверяют добавлением 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и 50 мл раствора 4-хлор-1-нафтола (20 мг в 0,1 М трис-НСl, рН 8,0). Анализ показывает, что полипептид С80 связывается с антителами к NS3 белку ВГС.

Таким образом, данное изобретение представляет собой полипептид, обладающий свойствами белка NS3 ВГС, взаимодействующий с антителами к белку NS3 ВГС, позволяющий определять антитела к ВГС.

Формула изобретения

1. Полипептид, полученный в штамме бактерий Escherichia coli, трансформированном рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК нуклеотидной последовательностью R и аминокислотной последовательностью R₁, приведенными в описании, где R и R₁ = 0 или R - последовательность нуклеотидов, кодирующая бетагалактозидазу, а R₁ - аминокислотная последовательность бета-галактозидазы,
обладающий способностью связывать антитела к белку NS 3 вируса гепатита C.

2. Фрагмент ДНК HC 256, полученный с помощью химического синтеза или цепной полимеразной реакции с нуклеотидной последовательностью приведенной в описании.

3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ N - В-6255 - продуцент полипептида HC 80, слитого с бета-галактозидазой E. coli.