Способ определения функциональной полноценности фибриногена

 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и касается способа определения функциональной полноценности фибриногена. Целью изобретения является повышение специфичности способа. Способ осуществляют посредством забора крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования , добавления в полученную плазму смеси 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10с и 0,1 мл 3%-ного раствора хлористого кальция , в контрольную плазму ту же смесь без протаминсульфата, взвешивания образовавшегося сгустка и в случае увеличения его веса по сравнению с контролем делают заключение об обратимом нарушении его функциональной полноценности в случае уменьшения его веса - о частичном нарушении , а в случае образования хлопьев - о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена. Положительный эффект заключается в возможности количественного измерения, в то время как в прототипе проводилась качественная оценка. 3 табл. СО с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (я)з G 01 N 33/48; ЗЗ/86

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,4 ( ф». (21) 4848014/14 (22) 31.07.90 (46) 07.10.92. Бюл. N. 37 (71) Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов (72) Н.К,Зимин, Т.И,Таранова, Г.Н,Будякова, Е.К.Гинтер и M.Н,Петухова (56) Lipinski B„Worowski К., Thombos

Diathes Haemorst, 1968, М 2, рр. 42 — 49, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ eÈÁÐÈHOГЕНА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и касается способа определения функциональной пол ноценности фибриногена. Целью изобретения является повышение специфичности способа.

Способ осуществляют посредством забора

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и касается способов диагностики нарушений свертывающей системы крови в клинике и эксперименте.

Известен способ определения функциональной полноценности фибриногена методом количественного его определения в сгустке плазмы, путем инкубэции стабилизированной плазмы при добавлении CaClz u тромбина (Рутберг P.À., Лабораторное дело, 1961, М 5, с.6), Однако, этот способ недостаточно специфичен, т.к. при наличии эндоили экзогенного гепарина в плазме, а также при патологических состояниях, связанных с развитием ДВС-синдрома (например, активация фибринолиза) дает искаженные результаты, либо вообще не дает фиксированного результата, крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования, добавления в полученную плазму смеси 0,1 — 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10 с и 0,1 мл 3%-ного раствора хлористого кальция, в контрольную плазму ту же смесь без протаминсульфата, взвешивания эбразовавшегося сгустка и в случае увеличения его веса по сравнению с контролем делают заключение об обратимом нарушении его функциональной полноценности в случае уменьшения его веса — о частичном нарушении, а в случае образования хлопьев — о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена. Положительный эффект заключается в возможности количественного измерения, в то время кэк в прототипе проводилась качественная оценка. 3 табл, Известен также способ определения гиперфибриногенолитической активности крови, путем количествеййого определения фибриногена в цитратной плазме в присутствии ингибитора фибринолиза — раствора

ЭАКК= который при сравнении с контрольной пробой дает возможность определить степень диссоциации фибриногена в условиях резкой активации фибриногенолиза (А.С, N 1469468, 1988), Однако, указанный способ не дает возможности количественного определения функциональной полноценности фибриногена в условиях гепаринизации плазмы крови различной этиологии, что является непременным условием проведения экспериментов по имплантации искусственного сердца с применением аппарата искусственного кровообращения, а также при лечении больных

1767425 с различной патологией н ей, находящихся в кли- зом: в контрольную и об 0 5 ническом состоянии. про ирку к, мл цитИз ратной плазмы добавляют 0,1 мл 3 -ного з известных, наиболее близким явля- хлорист О, ется способ определения функциональной б хло истого кальция и,1 мл раство а т ина, активностью 10 с. В опытн ю и об р р ром полноценности фибриногена, путем опре- 5 т, —, мг протакои же смеси добавляют 0,1 — 0,6 мг проделения фибриногена В с использованием таминсульф ( протаминсульфатного теста Lipinski В., и минсуль ата (количество о ав (tpl0s I ., протаминсульфата зависит от активност

orows i ., rombos. 0iathes, Haemorrh., гепа ин и гепарина в плазме крови и колеблется от 0,1

П ин и: до 0,6 мг на мл, из расчета 0,1 мг протаминринцип: Появление в плазме сгустка 10 сульфата на 1 ЕД активности гепа ина . при добавлении к ней протаминсульфата б активности гепарина). Обе говорит о наличии в этой плазм про ирки ставят на во ян ю б ме неполя- 5 — 10 мин для свертывания фиб ин г ризующихся (заблокированных) фиб и рин- Получаемые с стки фиб и р фибриногена, мономерных комплексов. Возм ж озможность циональны исходному количеств и и образования этих комплексов после забора 15 гена, Сле в е тву фибринок овип а гена, ледовательно, для получения р редупреждается добавлением к цит- количества фиб рату натрия ЭАКК. ва фи риногена и выражения его в г/л получаемые сгустки фибрина быстро выпосо принят нами в качестве прото- сушиваю ф р типа. Однако этот способ недостаточно спевают на ильтровальной б ваю р умаге, взвешивают на торсионных весах. Вес сгустка цифичен, т,к, позволяет лишь качественно 20 умножаетс "2", ф ц определить наличие деградированного делят на100. П ово ятс ав тся на, на коэффициент 22 2 ,2 и фибриногена при развитии ДВС-синд ома т в

-синдрома трации фибриногена в контрольной и в среднеи степени тяжести, крайние проявле- опытно б ния (легкие и тяжелые) этого синдрома, в сульфата, пытной про е с добавлением и от б р аминчастности обратимые и необратимые нару- 25 П и н шения ф нк ри нормальной функциональной поля функциональной полноценности ноценности ф б фибриногена тест не улавливает, а также не ф б и риногена кон ент а и риногена в конт ольной и ц р ции работает в условиях гепаринизации. б р опытнои проах одинаковы. При увеличении концент аЦелью изобретения является повыше- ции ф б рание специфичности способа. 3 и риногена в опыт опытной пробе с

0 добавлением протаминсульфата от 0

Поставленная цельдостигаетсятем,что 7,1 г/лделаетвыво оч до б б а оре осуществ- блокаде фибриногена гепарином, т,е. обляют, /-ным раствором цитрата натрия, ратимом нарушении его ф нк и н в опытную пробу с протаминсульфа ь атолл полноценности. При меньшении добавляют смесь тромбина и СаС!, а в 35 т э ии и а 2, а в трэции фибриногена в опытной пробе с ольную — ту же смесь без протамин- протаминс ль атом ульфатомот 0,2 / до по рав ление функциональной нению с контролем — о чаСтичном на полноценности фибриногена осуществляют ф нарушепутем взвешивания сгустка фибриногена и ф б нии ункциональной полно енн т ц ости в случае увеличения его веса по сравнению 40 ф б фи риногена, а при рассыпании сг устка с контролем делают заключение об об атифи риногена на хлопья с

Ф, оответственно, о чение о о рати- необратимом нарушении его ф нк ионал— .мом нарушении его функциональной полно- нои полноценности, ценности, связанной с гепаринизацией, в О случае уменьшения веса сгустка — о ч - 20 существление способа з — частич- мин от момента взятия к ови, а занимает ном его нарушении, а в случае полного р - 45 пада его на хлопья — о полном нар ас- предлагаемому способ и сп у особу-протоего функционально рушении типу прове ено 3 и и полноценности, эксперимента, Сравнительная и р р д 33 исследования в условиях

Способ осуществляется следующи бравнительная диагностичеразом: кровь у экспериментального им о - ская информативность и п ог р гностическая тного или больного забирают из вены, не 50 нию со, г живо- ценность предлагаемого сп особа по сравнесдавливая мягких тканей, силиконирован- выше. Способ-и ототип не из вены, не 0 нию со, способом-прототипом значительно ной иглой в силиконированную и обие. посо -прототип не позволяет дать

8/ к в,,-ный раствор цитрата натрия фибриногена вслучаяхк айнихна в соотношении 9:1, Центрифугируют при а также при условии гепа иниз

1500 об/мин. в течение 7 мин для получения 55 тного, плазмы, Плазму отсасывают и через i0 мин П от момента взятия крови из сосудистого р и м е р 1. Теленок, 3-х ме сячного русла проводят определение количест возраста, весом 86 кг. Экспе им р мент по импфибриногена в двух параллельных проб тва лантации искусственного се рдца с испольФибриноген определяют следующим обра- к овооб о ах, зованием аппарата иск с у ственного м о ра- кровообращения. Исследования проводи1767425

10

30

40

50

55 лись на наркотизированном животном каждые 30 мин на фоне работы аппарата искусственного кровообращения, и через каждый час после отключения аппарата и нейтрализации гепарина протаминсульфатом. Способ осуществляется путем забора крови из вены, не сдавливая мягких тканей, силиконированной иглой в пластмассовую пробирку: 4,5 мл крови и 0,5 мл 3,8 -ного цитрата натрия. Точно фиксируется время взятия крови: тот час пробирку центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 мин для получения плазмы. Затем в две пробирки помещают по 0,5 мл плазмы, в контрольную пробу добавляют 0,1 мл 3 -ного раствора хлористого кальция и 0,1 мл тромбина 10 с активности; в опытную пробу — ту же смесь и 0,01 мл 1 -ного раствора протаминсульфата (0,1 мг), Обе пробирки ставят в водяную баню при 37 С на 5 — 10 мин. для свертывания фибриногена. После визуальной оценки полученные сгустки фибрина быстро высушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на торсионных весах.

Вес сгустка умножают на "2", на коэффициент 22,2, согласно способу Рутберг, и делят на 100. Проводят сравнительную оценку концентрации фибриногена в контрольной и опытной пробах, Параллельно проводится определение растворимых фибрин мономеров flo способу-прототипу. Дополнительноо проводят определение спонтанного времени свертывания крови, определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) для выявления активности гепарина. При осуществлении заявляемого способа на фоне гепаринизации использовались различные концентрации протаминсульфата от 0,1 до

0,6 мг на 1 мл плазмы, в зависимости от активности гепарина из расчета 0,1 мг протаминсульфата на 1 ЕД активности гепарина в 1 мл плазмы.

Результаты эксперимента представлены в табл.1, Заключение: Таким образом, использование заявляемого способа позволило на протяжении всего эксперимента проследить за кОличественным содержанием, сохранностыб функциональной полноценности фибриногена на фоне гепаринизации, а также за адекватной нейтрализацией гепарина протаминсупьфатом, Пример 2. Теленок 3 5 месяцев, весом

83 кг. Клинически здоров. Эксперимент по имплантации искусственного желудочка сердца с использованием АИКа. Исследования в процессе эксперимента проводились на тех же этапах и с использованием способа-прототипа и заявляемого способа по методйке, описайной в предыдущем примере.

Результаты исследований приведены в табл.2.

Животное погибло через 2 ч после отключения АИКа и нейтрализации гепарина протаминсульфатом от кровотечения, связанного с резким нарушением свертывающей системы крови. Эти нарушения не представлялось возможным скорригировать.

В этом случае использование заявляемого способа дало возможность выявить нарушения функциональной полноценности фибриногена у интактного животного, а именно резко выраженную диссоциацию фибриногена с 6,6 г/л до 2,2 г/л при добавлении протаминсульфата. Никакой клинически выраженной патологии у теленка не выявилось, В процессе эксперимента проявилось полное нарушение функциональной полноценности фибриногена, которое выявилось заявляемым способом при добавлении протаминсульфата "ин витро", а затем было спровоцировано "ин витра" при введении протаминсульфата для нейтрализации гепарина в организме теленка посйе отключенйя аппарата искусственного кровообращения.

При проведении исследований способом-прототипом были получены отрицательные результаты.

Заключение: Таким образом, заявляемый способ может служить прогностическим тестом при серьезных ойератйвньгх вмешательствах, в частнбсТи, при операциях по трансплантации сердца и имплантации искусственного сердца, которые требуют использования аппаратов искусственного кровообращения, гепаринизации с последующей нейтрализацией протаминсульфатом.

Нарушения функциональной полноценности фибриногена, выявленные по заявляемому способу следует использовать как прогностический тест при отборе животных на эксперименты, включающие использование аппарата искусственного кровообращения."

Пример 3. Предлагаемый способ определения функциональной полноценности фибриногена был использован акже в клинике у больных реанимационного профиля.

Больная Е., 37 лет, история болезни

N. 3378, поступила в реанимационное отделение с диагнозом сахарный диабет 1 типа.

Гиперосмолярный некротический гипергликемический синдром, сепсис, Состояние больной крайне тяжелое, требующее интенсивной терапии. Для опре1767425

Таблица 1

АЧТВ . (сек.) Кол ичество добавляемого протаминсульфата (мг) Фиб иноген

Этапы исследований

Время свертывания крови, мин

¹¹ пlп

Активность гепарина контрольная пр оба, г/л опытная проба, г/л

49,0

На фоне наркоза

Подключение АИКа

30 мин работы

АИКа

4,0

4,0

0,1

130,0

0,3

Не свернется

То же

3,1

135,0

0,3

3,1 деления функциональной полноценности фибриногена плазмы крови у больной не реже одного раза в сутки проводили исследование плазмы крови в соответствии с вышеописанным способом, параллельно — по способу-прототипу. Наиболее информативные показатели в данном клиническом примере выявлены на 3, 10, 15 и 20 сутки наблюдений, Сравнение результатов, полученных при использовании описываемого способа и способа-прототипа, представлены в табл;3.

Определение функциональной полноценности фибриногена по предложенному способу соответствовало клинической картине заболевания. Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) соответствовало крайне тяжелому состоянию больной, частичное нарушение функциональной полноценности фибриногена (10 сутки) и/или выявление фибриногена, заблокированного гепарином (15 сутки), демонстрируют тенденцию к восстановлению функциональной полноценности фибриногена, как прогностически полоЖительный признак в течении заболевания. При восстановлении функциональной полноценности фибриногена (20 сутки) состояние больной оценивалось как средней степени тяжести при отсутствии рефрактерности к проводимой корригирующей терапии, Определение комплексов растворимых фибрин-мономеров по способу-прототипу в случае грубых нарушений функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) дало отрицательный результат, Аналогичная картина наблюдалась на фоне гепаринизации больной.

Заключение; Таким образом, предлага-емый способ позволил выявить функциональную полноценность фибриногена в условиях ее грубых нарушений, а также в случае проведения гепаринизации у больной. Повышение специфичности определения функциональной полноценности фибриногена с помощью предлагаемого способа позволило подобрать адекватйую корргирующую терапию и ойределить прогноз заболевания как перспективный, Использование предлагаемого способа определения функциональной полноценности фибриногена позволяет оптимизировать условия эксперимента, проводимого с использованием искусственного кровообращения, а в условиях клинического применения выявить наличие ДВС-синдрома на ранних стадиях его развития, провести адекватную коррекцию, которая позволит предотвратить грубую полиорганную недостаточность и сократить время пребывания больного в реанимационном отделении, Формула изобретения

Способ определения функциональной полноценности фибриногена путем взятия крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования, добавления в полученную плазму протаминсульфата, инкубации и регистрации образовавшегося сгустка, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности, в плазму добавляют смесь

0,1 — 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10 с и 0,1 мл 3 g,-ного раствора хлористого кальция, в контрольную — ту же смесь без протаминсульфата, после инкубации взвешивают образовавшийся сгусток и в случае увеличения его веса по сравнению с кОнтрольной пробой делают заключение об обратимом нарушении его функциональной полноценности, в случае уменьшении его веса -"о частичйом нарушении, а в случае образования хлопьев — о полном нарушенйй функциональной полноценности фибриногена.

1767425

10. Продолжение табл. 1

АЧТВ (се к.) Количество добавляемого п ротаминсульфата (мг) М1Ф и/и

Активность гепарина

Этапы исследований

Фиб иноген

Время свертывания крови, мин опытная проба, г/л контрольная проба, г/л (ЕД) 127,0

2,5

0,3

3,1

1 ч работы АИКа

1,5 ч работы АИКа

АИК отключен, введен

П,С, для нейтрализации гепарина, Через 1 ч после откл.

АИКа

Через 2 ч после откл, АИКа

Не свернется

То же

0,3

3,0

142

3,5

0,75

73,4

0,1

1,3

93,9

0,8

0,1

4,0

3,0

65,4

0,1

4,0

4,0

АКИ вЂ” аппарат искуственного кровообращения;

П,С. — протаминсульфат.

По способу — прототипу результаты всех параллельных исследований были отрицательными.

Таблица 2

Этапы исследований

Время свер" тывания кро" ви, мин

Vh"" пlп

АЧТВ, с

Фибриноген

Количество добавляемого

П. С„мг

Активность гепарина в ЕД. конт« опытная роль, проба, проба

49,5 0

130,0 2,5

180,0 3,8

298,0 5i0

500,0 6,0

187,0 3,8

6,6

2,2

1 На Фоне наркоза

2 Подключение АИКа

0,1

0,3

0,4

Не свернется

То же

Хлопья

То же

«1 I »

3 30 мин работы АИКа

4 1 ч работы АИКа

« I 1»

0,5

0,6

0,4

«1 I»

1,5 ч работы АИКа

«I 1»

«1 I »

Отключение от АИКа, введение. П.С.

0,6

«I1»

«1 I»

Через 1 ч после отключения АИКа

Не определяется

8 Через 2 ч после отключения АИКа

То же

0,4 б!

1767425

Таблица3

Определение фибриногена по заявляемому способу в г/л

Определение фибриногена 8

Сутки наблюдения резуль- заключение тат контр. опыт. заключение проба проба

6,2 хлопья

Отсутствие комплек" сов растворимых фибрин-мономеров

Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена, требуется корригирующая те рапия

4,0 2,2

Выявляется наличие растворимых комплексов фибрин-мономеров

Частичное нарушение функциональной полноценности фибриногена, необходимо продолжать специальную корригирующую терапию.

1,78 3,5

Выявляется фибриноген, частично заблокированный гепарином (гепаринотерапия) Отсутствие комплексов растворимых фибринмономеров

Отсутствие комплексов растворимых Фибринмономеров

4,4 4,4

Функциональная полноценность фибриногена восстановлена

Составитель Т.Таранова

Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь

Редактор С.Кулакова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, l01

Заказ 3545 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5