Способ исследования свертывания крови

 

Использование: медицинская биохимия , клинико-лабораторная практика, тест для диагностики и лечения заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза, Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: в плазму, разбавленную вероналовым буфером в соотношении 1:(10-80), вводят коагулянт тромбин в соотношении к сгрептокиназе (1.25-2,5):(1-25) при рН 7,4, ионной силе 0,1-0,15, температуре 22-37°С и регистрируют спектрофотометрически изменения светорассеивания при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентрацию фибриногена, скорость фибринолиза, время полулизиса и полного лизиса фибринового сгустка по полученному спектру. Фиг. 2, табл. 3. сл с XI XJ VI о 00 ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/86

ГОСУДАР СТ ВЕННОЕ ПАТЕНТНСЕ

ВЕДОМСТВО СССP (ГОСПАТЕНТ CCCP) I

ОП И САН И Е И ЗО БР ЕТЕ Н И Я,"!

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4837619/14 (22) 08,06.90 (46) 23.11.92. Бюл. N. 43 (71) Институт биохимии им, А.В. Палладина и Киевский медицинский институт им. А,A.

Богомольца (72) Т.И. Лежен, Е.M. Макогоненко, Л.А. Колесник, С.А. Крамарев. Т,В. Мартынюк, С.И.Андрианов и С,А. Кудинов (56) Баскова И,П. Практикум по физиологической химии, М, МГУ, 1976 r, с. 5-8.

Физиология человека, т.3 Кровь, кровообращение, дыхание под ред. Р, Шмидта и

Г. Тевса, М. Мир, 1986 г. с. 25.

Балуда В.П. и др. Лабораторные методь1 исследования системы гемостаза, Томск, 1980.

Слобожан кина И.К„Федорова З.Д., Использование стрептазы в методах лабораторной диагностики. Лабораторное дело, 1973, йг 9. с. 515.

Молекулярная биология, 1986, т, 20, вып. 2, с. 461-470.

Авторское свидетельство М 978862, кл. А 61 К 35/16, опубл. 1982 г.

Proc. Natt Acad. Sci. USA, 1986, ч. 86, N 8, р. 2568-2571.

Папаян А.В., Цыбулькин Э.К, Острые токсикозы в раннем детском возрасте, М.

Медицина, 1984 г. с. 98, Кост Е.А. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования, М, Медицина, 1975 г. с. 57.

Дранник Н.Г.,Ена Я.М., Варецкая Т.B.

Продукты расщепления фибрина/фибриногена при патологических процессах. Киев, Здоровье — 1987 г.,с. 51 — 57.

Бокарев И.Н., Щепотин Б.M., Ена Я.М.

Внутрисосудистое свертывание крови. Киев, Здоровье, 1989 г. с. 77. с, 81, Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-лабораторной практике в качест, 5U„„1777089 Al (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ (57) Использование: медицинская биохимия, клинико-лабораторная практика, тест для диагностики и лечения заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза, Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: в плазму, разбавленную вероналовым буфером в соотношении 1:(10 — 80), вводят коагулянт тромбин в соотношении к стрептокиназе (1.25 — 2,5):(1 — 25) при рН 7,4, ионной силе 0,1 — 0,15, температуре 22 — 37 С и регистрируют спектрофотометрически изменения светорассеивания при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентрацию фибриногена, ско- Я рость фибринолиза, время полулизиса и полного лизиса фибринового сгустка по полученному спектру, Фиг. 2, табл, 3, ве теста для диагHocl ики и лечения заболеваний, связанных с патологией системы, 1777089

Для объективного исследования заболеваний системы гемостаэа осуществляют тестирование несколькими способами, определяя основные параметры свертывания и фибринолиэа, например: скорость свертывания, содержание фибриногена в плазме и время лиэиса сгустка.

Известны в клинико-лабораторной практике следующие способы определения: — количест венное определение содержания фибриногена в плазме крови путем введения в HGe смеси монойодуксусной кислоты с фосфатным буфером, инкубирования с тромбинсм, содержащим ионы кальция, растворение отмытого сгустка в 1,5%-ной уксусной кислоте в соотношении к плазме (20-25):1, общее время — около 40 — 50 мин, — определение времени лизиса сгустка в разведенной (1:10) крови без коагулянта в течение 7-8 ч, — определение времени лизиса эуглобулинового сгустка с добавлением во фракцию тромбина и раствора хлористого кальция при температуре 37 С, общее время 3 — 4 ч в норме, — определение времени эуглобулинового лиэиса на фибриновых пластинах, общее время 18-24 ч, — определение времени лизиса эуглобулинового сгустка при введении во фракцию стрептокиназы.

Из числа известных аналогов прототипом заявляемого способа является способ определения времени лиэиса эуглобулинового сгустка, который включает осуществление следующих операций: — получение зуглобулиновой фракции путем введения 0,016% уксусной кислоты в плазму, выдерживание в течение 20 мин, в холодильнике, центрифугирование, отделение и высушивание осадка, — введение фосфатного буфера, тщательное перемешивание, — добавление смеси стрептокиназы (фирма Стрепта за, Ш вей цари я и 0,277% раствора хлористого кальция при легком покачивании; — после образования сгустка следят с помощью секундомера за временем лизиса, норма которого составляет 10й0,5 мин.

Общая продолжительность способа—

40 — 60 мин.

Однако все известные способы обладают существенными недостатками: они требуют значительного времени и определяют только один параметр сложной системы гемостаза, причем, в основном, визуально полуколичественно, Целью изобретения является ускорение и, упрощение способа.

Цель достигается тем, что в способе определения параметров свертывания и фибринолиза крови, включающем последовательное введение коагулянта и стрептокиназы во фракцию крови, перемешивание смеси определение параметров путем регистрации изменения светорассеяния, о качестве сырья используют плазму, разбавленную в вероналовом буфере в соотношении 1:(10-80), в которую вводят коагулянт тромбин в соотношении к стрептокиназе (1,25 — 2,5):(1 — 25) при рН 7,4, ионной силе 0,1 — 0,15 и температуре 2237 С и регистрируют спектрофотомет10

15 рически изменения . светорассеяния при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентра цию фибриногена, скорость фибринолиза время полулиэиса и полного лиэиса фибри

20 нового сгустка

Благодаря указанному диапазону соотношений тромбина к стрептокиназе (1,252,5):(1.-25), определенным показаниям, характеризующим кислотно-щелочное со25 стояние, ионную силу температуру, достигается сначала свертывание фибриногена под действием тромбина, а затем лизис фибринового сгустка под действием стрептокинаэы во времени, достаточном для

30 одновременного спектрофотометрического определения шести параметров свертывания и фибринолиэа на одном образце плазмы, Общая продолжительностьспособа-не более 10 мин в норме, что значительно меньше времени, которое затрачивают при осуществлении известн ых аналогов.

На фиг.1 .представлена стандартная кривая изменения светорассеяния при свертывании илизисе фибрина в разбавленной плазме крови; на фиг.2 — калибровочная кривая для определения концентрации фибриногена в донорской плазме по максимальному светорассеянию.

Левая часть кривой на фиг.1 характеризует процесс свертывания фибриногена, сопровождающийся увеличением поглощения вплоть, до максимального значения (E a c.LU), Эта величина прямо пропорциональна плазмы, что позволяет определить er0 точную концентрацию по калибровочной кривой, приведенной на фиг.2. Скорость увеличения светорассеяния, определяемая по тангенсу угла наклона касательной, проведенной к точке максимального увеличения светорассеяния (tg а на фиг.1), характеризует скорость образования фибрина в плазме (1). Такая характеристика об55

50 концентрации свертываемого фибриногена

1777089 щепринята при изучении полимеризации фибрина.

Время достижения максимального светорассеяния (t>) представляет собой время свертывания плазмы (11). После этого, как весь фибриноген плазмы превратится в фибрин и формируется сгусток, начинается

его лизис под действием стрептокиназы, сопровождающийся уменьшением светорассеяния до исходного уровня. Скорость уменьшения светорассеяния (tg P) характеризуетскорость фибринолиза(И), Время, за которое максимальное светорассеяние уменьшается в 2 раза (д) представляет собой время полулизиса сгустка (V), а время, эа которое Езю возвращается к исходному нулевому уровню (tz) — время полного лизиса — (И). Эти параметры (время полулиэиса и время полного лиэиса сгустка) характеризуют фибринолитический потенциал плазмы и используются для оценки фибринолитической активности (7). Уменьшение времени полулизиса/лизиса сгустка свидетельствует об ускорении, а увеличение — об угнетении фибринолиза. Определение оптимальных условий способа, заявленных в формуле изобретения, проводят экспериментально. При концентрации тромбина до 1,0 N1H ед/мл скорость свертывания растет, а затем остается постоянной. Скорость и время лизиса не зависят от концентрации тромбина в диапазоне 0-5

N1H ед/мл.

При увеличении концентрации стрептокиназы до 0 — 25 ед/мл параметры свертывания не изменяются. в то время как скорость лизиса растет, а время лизиса уменьшается в интервале концентрации стрептокиназы

0-4 ед/мл, а затем зти параметры не меняются в пределах от 4 — 25 едlмл, Оптимальными концентрациями тромбина и стрептокиназы для обеспечения высокой воспроизводимости и стандартизации являются концентрации тромбина (1,25-2,5) N1H ед/мл и стрептокиназы 1-25 ед/мл, Степень разбавления плазмы вероналовым буфером лимитируется чувствительностью спектрофотометра (СФ-46).

Влияние содержания фибриногена в плазме .на параметры свертывания и фибринолиза изучают следующим образом: к

0,1 мл донорской плазмы с известным содержанием фибриногена добавляют возрастающие количества фибриногена или используют различные разбавления плазмы. Тромбин (2,5 N1H/мл) вводят при постоянном количестве стрептокиназы (1 или

5 ед/мл). Как видно. на фиг.2 увеличение концентрации фибриногена сопровождается возрастанием величины E»«(ill), причем зависимость ее от концентрации фибриногена носит линейный характер. Увеличение количества вносимой в пробу плазмы в 2

5 раза также приводит к 2-кратному увеличению Е а с, поэтому для построения калибровочной кривой можно использовать различные разведения донорской плазмы.

Полученная линейная корреляция EMaKc. u

10 концентрации фибриногена дает возможность быстро определять концентрацию фибриногена в плазме.

Все исследования следует проводить в определенном диапазоне температур 22 в .

15 37 С. Понижение температуры снижает скорость свертывания и фибринолиза.

Для ускорения этих процессов при температуре 22 С следует увеличить количество стрептокиназы (пример 5). Повышение

20 ионной силы выше 0,15 тормозит свертывание фибриногена плазмь!, а при понижении ионной силы менее 0,1 увеличивается EMavc. светорассеяния.

Способ проводят при строгом соблюде25 нии физиологического значения рН вЂ” 7,4,т.к. при подкислении среды до рН 5,4 скорость свертывания (tg а-1) уменьшается в 3 раза, скорость. фибринолиза (щ )3-lV) — в 2 раза.

При подщелачивании до рН 8,0 увеличива30 ется активность плаэмина, что вызывает быструю деградацию фибриногена, Пример 1. В термостатированную кювету спектрофотометра с автоматической регистрацией светорассеяния (Л 350 нм)

35 вносят последовательно 0,1 мл бедной тромбоцитами цитратной плазмы крови человека (здорового донора), 1,84 мл 0,02 М вероналового буфера, содержащего 0,13 M

NaCl и 0,001 М CaCI2, т.е. соотношение плаз40 мы к вероналовому буферу 1:20 (при рН 7,4 ионной силе 0,15) 0,01 мл раствора стрептокиназы (1000 ед/мл) до конечной концентра». ции 5 ед/мл и 0,05 мл раствора тромбина (100 N1H ед/Mn) до конечной концентрации

45 2,5 N1H ед/мл a том же буфере. Смесь тщательно перемешивают, фотометрируют при температуре 37 С и проводят анализ кривой изменения светорассеяния, полученной с помощью самописца (фиг. 1) для определе50 ния времени свертывания (t, мин.), скорости свертывания фибриногена (tga), .величины максимального светорассеяния (Емакс). по которой, находят концентрацию фибриногена в плазме(фиг.2), скорость фиб55 ринолиэа (tgф, время полулизиса (таад, мин) и время полного лизиса (tz, мин) фибринового сгустка. Результаты расчета приведены в табл.1, Примеры 2 — 5, 1777089

Все операции, проводимые с донорской плазмой, регистрацию светорассеяния и определение шести параметров свертывания и фибринолиза осуществля|от согласно описанию примера 1. 5

Условия, режимы Ll результаты для ка>кдого примера представлены в табл.1, Пример 6, Бсе операции, проводимые с плазмой крови больного гастроэнтероколитом (ГЭ!(), 10 регистрацию светорассеяния, а затем определение шести параметров свертывания и фибринолиза осуществляют согласно описанию примера 1.

Условия, режимы и результаты пред- 15 ставлены в табл,1, Пример 7.

Бсе операции, проводимые с плазмой крови больного ишемической болезнью сердца (ИБС) перед операцией (артериокоро- 20 нарное шунтирование), регистрацию светорассеяния и определение шести параметров свертывания и фибринолиза осуществляют согласно описанию примера 1.

Условия, режимы и результаты пред- 25 ставлены в табл,1, Доказательство точности нового способа проводят по двум схемам сравнения, 1, Сопоставляют результаты определения параметров свертывания и фибриноли- 30 за на плазме 10 здоровых доноров при постоянной t 37 С, ионной силе 0,15 рН 7,4 разбавлении плазмы в вероналовом буфере

1, 20, концентрации тромбина 2,5 И1Н ед/мл, стрептокиназы 5 ед/мл. 35

Результаты, представленные в табл,2, показывают тождественность параметров, ll, Сопоставляют результаты определения концентрации фибриногена по новому способу и способу-аналогу. Новый метод по- 40 зволяет получить те же самые результаты в пределах ошибки сравниваемых методов.

Способ по точности не ус».упает известным аналогам.

Полученные результаты по способу пол- 45 ностью совпадают с результатами общепринятых коагулологических методов оценки состояния гемостаэа, в частности, определение времени свертывания количества тромбоцитов, содержания продуктов p30" 50 щепления фибриногена (фибрина-ПРФ) и растворимых комплексов фибрина — РКФ антитромбина !1, протромбинового индекса.

Преимущества нового способа в сравнении с известными аналогами заключаются в следующем: — сокращение времени до 10 мин в отличие от известных способов: 40-60 мин или

3 — 24 ч, — многоаспектность диагностических исследований за счет расширения диапазона определяемых параметров,вместо одного параметра одновременно определяют 6 параметров свертывания и фибринолиза> — упрощение методологических приемов за счет исключения сложного получепия эуглобулиновой фракции; —. условия и схема проведения нового способа позволяют осуществить компьютеризацию процесса диагностических исследований плазмы крови.

Формула изобретения

Способ исследования свертывания крови, включающий определение показателей свертывающей и фибринолитической систем крови, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, в кювету спектрофотометра вводят бедную тромбоцитами плазму и вероналсвый буфер в соотношении Ч!Ч1: l0-80 при ионной силе

0,1-0,15 рН вЂ” 7,4, затем добавляют растворы стрептокиназы и тромбина в соотношении (1,25 — 2,5):(1 — 15) и регистрируют кинетику светорассеяния при 350 нм, а показатели систем крови рассчитывают из характеристик полученной кривой соответствующих калибровочных кривых, при этом о содержании фибриногена судят по максимальному светорассеянию, о скорости свертывания фибриногена — по тангенсу угла, образуемого касательной к точке максимального увеличения светорассеяния, о времени свертывания фибриногена — по времени достижения максимального светорассеяния, о скорости фибринолиза — по тангенсу угла наклона касательной к точке максимального уменьшения светорассеяния, а о времени полулизиса и полного лизиса — соответственно по времени уменьшения максимального светорассеяния в два раза и по времени возвращения светорассеяния к исходному уровню.

1777089

I

I

1

I

1

1 Э н а

I D C(3 о

e x

ovz

Xza

С Ф(О

ozz с се

C(( х

» о

«ъ 63

l 3.3 о

° 1

6 м

3 (Ч

Ю

» (»

Ю м м

Ф м ( м

CD

«ф

СО

» (Ч (»»

О\

Ъ(2

Ю

Ю (Ч

f»3

6 6 (("с

3 (3.3 I

1 (Ч (Ч

ЮЭ

Ю

»

° 4

LA

1О

CD л

»

Ю

Ю (Ч

Ю

Ю л

С»3 (Ч

GO

CD

», Ю л

СЧ

С»3

СО

CD

CD л

Ю

Ю (Ч

Ю

»

Ч2

С( (Ч м (Ч

CD б З

3 ф l (С е э х

w a c(3 c(3

Н(33 V !

2l а

ccI л

Ф ч X

2 ..

LA

СЧ м (Ч

Ю (Ч (3« (Ч (Ч

1 О I Е

I-аФ

o g e c(( (-!u ао с

С3С3

ЪО

О Ъ

LA

I

I1,,Щ ! I- z ! Z X

1 e (f Q (Z =Г 03(3 .

O c(3 a (-(cX (ыа(-ке

LA ъЧ

О Ъ

» (Ч

» (Ч

A (Ч

I 1 2I

I I- (1(Е I ((3

e(fczy

l =(Х Э Х х a à33

3 О а 1 О С

3ыао(-е

CD

О\

Ю

О \

Ю

ОЪ

LA

1 о !

«в я (о

Й еое

m ((3e

1 1.е e z

В Ф

zх2

:1 1 Ф

o e (o

ozc

I cJ X C

Ю (Ч

Ю (Ч

CD (Ч

1 °

1 О В

1 Ol

1 I Ф

LsA (Ч

Ю

CD (Ч

С Фс Се.

4 с

Ю

Ю

3 O

1 6 ! C1

I 6 и

I (Ч (Ч л м (» м

1 ИС а

1

1 Ф ! C((° X (. о z

3 X V

I

1

I

1

3»» I .о а. а е о

I Z Z

z o

1 а (е

I C

»

С(ОЪ

LA

О Ъ

Cl

ОЪ

Ю

LA

Ю, о

L о

X со

О О(lO X

LA I о а а е о

X О а (е! о а а е о

X О а (е

К Щ

C(3 х с («

CcI (f i(3

C(3 C х с е е

If, ((3

Ф с х с

Э Л

C(3 е с а с с

3 ф (C(3 I

1 й(1

Z I

I с !

1 (о 1!

Ф 1!

3 и

1

I и н (и

X 1 °

2«c((ax с z e есо(ос

aozz o

63 C f(e Z

М 1

1- О.

Z л а. а Ф "

O (O 33 6(3

О ЕС ((3 х г»

l» C4 I

«ъ» X I

v 2

I (Ч 1 о аa Ф э о е

Е Е Ф

ZO(f C(3 акса с с= хс

М I

v аа е

Э Î Е

zoa;m асХе С сх с о о

Э Ь аz о

em z

4l »

z с с ас o(6

С(О 31

I

1

l (I

1 !

I

1

1

1

I.

I

1

1

1

l (1 (!

3

I (I

1

I

3

3

t !

l (1

1

I

I

1

1

3

l

1 (l

I (1

1

I

1

1

1

I

I . 1

1 б б

1

I !

3

3

1

I

1

I !

1 !

l (3

1

I

3

l

I

1

1

12

1777089

Таблица2

Таблица 3

Определение концентрации фибриногена в плазме крови человека г 3 4 S ианс

0.15 о,cs а 4 ... 6 в m

Концентрация фибриногена, r/ë плазмы

Фиг. 2

Составитель А, Агуреевс»

Техред М.Моргентал Корректор R ревская

Редактор

Производственно-издательский комбййат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4120 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5