Стэкингспирализованный полио-о-фенилен, гидроксилированный в положении 3,5,6 и способ его получения

 

Использование: новое биологически активное химическое соединение спиральной структуры. Сущность изобретения: стэкингспирализованный поли-о-фенилен, гидроксилированный в положения 3, 5, 6 со степенью полимеризации 3-10 в качестве вещества, повышающего противовирусную резистентность. Получают его путем полимеризации n-бензохинона на воздухе в присутствии щелочи 10-35% от массы бензохинона с последующей обработкой щелочью в инертной среде в количестве 90-110% от массы бензохинона. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно к биологически активным полимерам спиральной структуры общей формулы (см. в конце текста) и способу их получения, где Х 1-3.3 витка спирали.

Указанные полимеры являются фармакологически активными соединениями и могут быть использованы в экспериментальной и клинической медицине, биохимии, ветеринарии и других областях народного хозяйства.

Полимеры, обладающие спиральной структурой, играют важную роль в жизнедеятельности организма (ДНК, РНК, белки и т.п.). При этом их биологическое воздействие на организм определяется не только их первичной, но и вторичной (пространственной) структурой. В частности, не обладающие заметной биологической активностью полирибонуклеотиды начинают проявлять противовирусные, противоопухолевые и иные свойства при образовании комплексов спиральной структуры. Для комплексов полирибонуклеотидов так же, как для ДНК и РНК характерна спиральная структура со стэкинг-взаимодействием (упаковкой нуклеиновых оснований, являющихся хромофорами), основанном на неполярном взаимодействии между параллельно уложенными основаниями. Силы стэкинг-взаимодействия обуславливают высокую степень стабилизации спирали.

Эти комплексы, характеризующиеся наличием стэкингспирализованной вторичной структуры в сочетании с гомогенной первичной структурой, являются прототипом по структуре заявляемого изобретения. Прототипом по эффективности является широко применяемый в медицинской практике препарат ремантадин-метил-1-адамантил-метиламина гидрохлорид.

Недостатками ремантадина являются узкий спектр действия, недостаточное воздействие на противовирусную резистентность, значительное количество противопоказаний (заболевания почек и печени).

Спирализованные полифениленовые структуры и способы их получения в литературе не описаны. Для неспирализованных полифениленов явление повышения противовирусной резистентности неизвестно.

Целью изобретения является синтез стэкингспирализованных поли-о-фениленов, гидроксилированных в положения 3, 5, 6 (СПФ), которые могут быть использованы в качестве соединений, повышающих противовирусную резистентность.

Стэкингспирализованные полимеры формулы (1) получают полимеризацией на воздухе n-бензохинона в присутствии щелочи 10-35% от массы бензохинона в качестве инициатора с последующим введением в инертной среде до 90-110 мас. щелочи. После окончания реакции выделяют полимер традиционными методами, например, центрифугированием или фильтрованием предварительно нейтрализованного раствора.

Степень полимеризации определяется соотношением щелочи и мономера. Наибольшей эффективностью обладает препарат со средней степенью полимеризации n 10/X 3.3.

Содержание целевого полимера с заданным числом витков спирали в конечном продукте составляет в зависимости от степени полимеризации от 95 до 98% Как показали проведенные эксперименты, полимеры СПФ характеризуются сочетанием противовирусных и иных позитивных свойств с низкой токсичностью (LД₅₀) при внутрибрюшинном введении составляет не менее 1350 мг/кг веса, при пероральном не менее 760-920 мг/кг веса в зависимости от вида животных и взятого полимера.

При более высоких степенях полимеризации эффективность полимера снижается при одновременном усложнении технологии выделения конечного продукта; при уменьшении степени полимеризации стэкинг-спираль не образуется.

Пример 1. 1000 г n-бензохинона помещают в реактор емкостью 20 л, снабженный мешалкой и тубусами ввода реагентов, растворяют в 7 л дистиллированной воды и добавляют 100 г едкого натра в 300 мл воды (10% от массы мономера). Смесь перемешивают в течение двух часов пока цвет жидкости не станет темно-коричневым, после чего реактор продувают аргоном и вводят дополнительно 970 г едкого натра в 2 л воды (97% от массы мономера) и перемешивают без доступа воздуха в течение 2 ч. Избыток щелочи нейтрализуют соляной кислотой до рН 3-4, отделяют выпавший осадок фильтрованием, промывают водой и сушат. Выход продукта 945 г. Анализ его структуры показал, что он является полимером общей формулы (1) со средней степенью полимеризации 9.9, Х 3.3. В дальнейшем полимер испытывался под шифром СПФ-10.

Пример 2. Процесс осуществлялся в условиях примера 1 при первоначальном введении в раствор 166 г едкого натра в виде 300 мл водного раствора (16,6 мас. от мономера) и введением после полимеризации раствора, содержащего 1100 г едкого натра (110 мас.). Выход конечного полимера 850,2 г, n 6.1, Х 2. Шифр СПФ-6.

Пример 3. Процесс проводился в условиях примера 1 при введении в мономер раствора, содержащего 350 г едкого натра, а в полимер 900 г едкого натра (соответственно 35 и 90 мас. от массы мономера). Выход 750,6 г, n 3.3, Х 1. Шифр СПФ-1.

Пример 4. Анализ структуры полимеров.

Полученные в примерах 1-3 образцы анализировались методами ПМР, инфракрасной и ультрафиолетовой спектроскопии. Для сопоставления анализировались аналогично спектры триоксибензола (ТОБ).

Сняты спектры ПМР образцов СПФ в ДСМО-α₆. На спектрах наблюдаются три полосы, соответствующие трем типам протонов, присутствующих в полимерах: широкая полоса 6.66 m.g, которая может быть отнесена к атомам Н, связанным с С_ap, узкая полоса 6.56 m.g, характерная для Н-С_ap, и полоса при 3.5 m.g, относящаяся к Н-связи в О-Н. На основании синглетной природы сигнала при 6.56 m. g. и узкого характера полосы можно предположить, что данный сигнал соответствует концевому, наиболее подвижному протону связи Н-С_ap. Из соотношения интенсивностей суммарного пика атомов водорода связи Н-С_ap к пику концевого атома водорода была определена степень полимеризации, которая для образцов, полученных по примерам 1-3, равна порядка 10.6 и 3 соответственно.

Наличие спиральной структуры подтвердилось электронными и дифференциальными спектрами в УФ области при различных рН и в присутствии 7 М мочевины (табл. 1).

Анализ спектров показал, что при переходе от спектров триоксибензола к СПФ с Х=1, 2, 3.3 наблюдается гипохромный эффект Н 20-27% вместо ожидаемого гиперхромного эффекта более 50% что подтверждает наличие перекрывания хромофоров. Кроме того, при развернутой сопряженной системе введение фениленого радикала должно давать батохромный сдвиг Δλ_max= 70 нм, в то время как для СПФ сдвиг отсутствует и λ_max и 1,2,4 ТОБ = λ_max СПФ при рН 7. Наличие батохромного сдвига при λ_max в 7 М мочевине (Δλ = 34 нм) указывает на существенность вклада водородных связей в систему стэкинга. При переходе от рН 7 к рН 9 для 1, 2, 4 ТОБ характерен батохромный сдвиг Δλ = 10-12 нм, а для СПФ гипохромный сдвиг Δλ = 5-6 нм, что также подтверждает наличие сильно сопряженной спиральной структуры. В области рН 5 спектр 1, 2, 4 ТОБ характеризуется одним пиком с λ_max= 290 нм, в то время как спектры СПФ имеют батохромный сдвиг, пропорциональный степени полимеризации, что позволяет проверять или уточнять степень полимеризации отдельных образцов СПФ, ранее установленную другими методами.

Анализ полученных ИК спектров показывает следующие характеристические полосы: 875 см^-1 внеплоскостные деформационные колебания атома водорода в пентазамещенном бензольном кольце; 1188 см^-1 валентные колебания гидроксила в бензольном кольце; 1450, 1495, 1610 см^-1 - плоскостные колебания бензольного кольца; 3400 см^-1 валентные колебания группы ОН; связанной водородными связями, что также подтверждает соответствие анализируемого вещества формуле (1).

Методология получения спектральных характеристик включала в себя: а) определение молекулярных экстинкций для каждого из 4 продуктов по двум независимым навескам (точность до 5 знака после запятой) с последующим разведением в дистиллированной воде до концентрации с учетом соблюдения закона Ламберта-Бэра (Σ = 0,3-0,5 o.e.). Молекулярная экстинкция считалась определенной при сходимости результатов; б) были приготовлены из равных по массе навесок исходные растворы, содержащие продукты СПФ-10, СПФ-6, СПФ-3, ТОБ с концентрацией 10^-3 М; в) из каждого раствора брали аликвоту и разводили соответственно заранее приготовленным раствором: I трис буфер 0,001 М, II НСl с рН 5, III NaOH с рН 9 и IV буфер с 7 М мочевиной. Разброс рН максимально возможный, так как при рН < 5 и рН > 9 продукт не растворяется; г) для каждого продукта были сняты спектры (абсолютно одинаковые концентрации 3·10^-5 М) с тем, чтобы облегчить обработку и сравнение полученных результатов.

Пример 5. Сопоставление противовирусной активности СПФ, интерферона и ремантадина. Сопоставление активности противовирусных препаратов проводилось в соответствии с известной методикой. 8 мл венозной крови больного отбирались в пробирку, содержащую 1 мл среды 199 и 0,08 мл гепарина, центрифугировали в течение 5 мин при 800 об/мин, отделяли лейкоцитарный слой и суспендировали его в 1-2 мл среды 199. 0,25 мл суспензии и 0,75 мл среды 199 вносили в чашки Петри и добавляли 0,1 мл физиологического раствора, содержащего анализируемый препарат. Чашку инкубировали при 37^oС в течение 1 ч. Неприлипшую фракцию удаляли, промывали осадок физиологическим раствором, фиксировали в течение 20 мин литиевым кармином Орта и заливали на 18 ч раствором орсеина, после чего вновь промывали и высушивали. Под микроскопом подсчитывали количество вирусных включений на 100 моноцитов и определяли долю моноцитов, содержащих вирусные включения, и процент поражения моноцитов. Результаты сопоставления эффективности препаратов, а также дозозависимый эффект приведены в табл. 2-4. Для сравнения приведены данные на введение в чашку Петри чистого физиологического раствора.

Пример 6. Использование препарата СПФ для понижения падежа птиц от инфекционных агентов.

Испытания препарата проводились на Костинской птицефабрике (г. Киров) с использованием 8 тысяч цыплят породы "Бройлер-6". Препарат СПФ-10 использовался в дозе 25,50 и 100 г на тонну корма. Испытания проводили на 4 группах по 1600 цыплят, пятая группа была контрольной. Препарат давали с 10 до 20 и с 30 по 40 день откорма (группы 2 и 4) и постоянно (группы 1 и 3).

В результате испытаний выяснилось, что введение 25 г/т корма приводит к падежу и отбраковке 600 цыплят при постоянном кормлении; при дозе 50 г/т эта величина составила: 630 при постоянном кормлении и 631 при периодическом; при дозе 100 г/т и периодическом кормлении она составила 642 цыпленка. В контрольной партии потери составили 908 цыплят. При этом падеж составил соответственно: 201, 194, 201, 185 цыплят при использовании СПФ, при падеже 323 цыплят в контрольной группе.

Все параметры цыплят, потреблявших СПФ (упитанность, прирост, качество мяса и т. п. ) как минимум не уступали аналогичным показателям контроля. Повторные испытания, проведенные на 80 тыс. цыплят, привели к аналогичным результатам.

Формула изобретения

1. Стэкингспирализованный поли-о-фенилен, гидроксилированный в положении 3, 5, 6
со степенью полимеризации 3 10, где х 1 3,3 витка спирали, в качестве вещества, повышающего противовирусную резистентность.

2. Способ получения стэкингспирализованного поли-о-фенилена по п.1, заключающийся в том, что проводят полимеризацию п-бензохинона в присутствии 10 35 щелочи от массы п-бензохинона с последующей обработкой щелочью в инертной среде в количестве 90 110 от массы п-бензохинона.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3