Способ изготовления коллагеновых покрытий для использования в офтальмологии

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изготовления крллагеновых покрытий, используемых в офтальмологии. Цель изобретения - повыше-, нйе выхода и чистоты целевого продукта. Для этого 4/13 склеры глаз выделяют строму. Из нее получают раствор коллагена, который фильтруют через стеклянный фильтр. Затем проводят изозлектрическое осаждение коллагена. Полученную смесь диспергируют, а целевой продукт отделяют от низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией дисперсии. ,,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.(я)5 А 61 К 37/12//А 61 F 9/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР э

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ рацией дисперсии., °:

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4304216/14 (22) 02.09.87 (46) 15.02.92. Бюл. N 6 (71) Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургии глаза" (72) С.Н.Федоров, С.Н.Багров, Т.С.Амстиславская, С.В.Масленков и А.В.Осипов (53) 617.7(088.8)

: (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1321420, кл. А 61 F 9/00, 1985. (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНОВЫХ ПОКРЫТИЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ОФТАЛЬМОЛОГИИ. Изобретение относится к офтальмоло: гии, а именно к коллагенопластике, и может быть использовано для повышения качества хирургического лечения врожденной и при.обретенной патологии зрения.

Цель изобретения — повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом, Склеру глаз сельскохозяйственных животных..тщательно очищает от внутренних оболочек, остатков коньюнктивы, мышц и проч. и выделяют строму. которую нарезают небольшими кусочками. Навеску ткани промывают дистиллированной водой до полного удаления механических примесей и крови, переносят в колбу и заливают 10$ным раствором едкого натра в насыщенном растворе сернокислого натрия (из расчета

500 мл раствор на 10 г ткани) на 48 ч при

18 С. Раствор сливают и проводят нейтрализацию ткани до рН 6,0 — 7,0, перемешивая ее в 2%-ном растворе борной кислоты и

5U 1711897 А1 (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изготовления коллагеновых покрытий, используемых в офтальмологии. Цель изобретения — повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Для этого из склеры глаз выделяют строму

Из нее получают раствор коллагена, который фильтруют через стеклянный фильтр.

Затем проводят изоэлектрическое осаждение коллагена. Полученную смесь диспергируют, а целевой продукт отделяют от низкомолекулярных примесей ультрафильтнеоднократно меняя раствор. Ткань промывают дистиллированной водой до полного удаления иона сульфата в промывной жидкости и заливают 1 M раствором уксусной кислотй из такого расчета, чтобы конечная концентрация белка в растворе составляла.

Ц . Массу перемешивают и оставляют в холодильнике на 1-3 сут при 4 С. Массу гомо-. генизируют, центрифугируют-30 мин при

2000 об/мин и оставляют на 1 сут при 40С.

Йолученный раствор фильтруют через стеклянный фильтр. Для изменения конформации макрочастиц в полидисперсной системе и снижения величин вязкости раствора кол:,. .лагена проводят изоэлектрическое осаждейие коллагена в пределах рН 4,2-8,6, что значительно облегчает дальнейшую очистку коллагена от низкомолекулярных примесей

Для этого к раствору коллагена в 0,25 M уксусной кислоте добавляют эквивалентное количество едкого натра в форме 1-1 0 (,-ного раствора едкого натра. С помощью диспергатора при скорости вращения ротора

1711897,10000-20000 об/мин. в течение 6-3 мин получают гомогенную дисперсную систему с размером частиц коллагена в дисперсной фазе 5-25 мкм.

Данная операция необходима, так как улучшает условия очистки и повышает степень очистки эа счет того, что все частицы

- дисперсной фазы имеют одинаковую поверхность и равномерно распределяются в объеме дисперсной среды, Полученную дисперсию коллагена разбавляют солевыми растворами или буферными смесями с низкой ионной иглой (0,002

M) до концентрации, 0,1-0,2 вес.7ь, снижая, таким образом, возможность ассоциации макрочастиц и повышая эффективность очистки. Разбавленную дисперсию подают под давлением для циркуляции в замкнутую си,стему, включающую трубки диаметром 2-3 мм, стенки которых представляют собой полупроницаемую мембрану, Все. молекулы, мол. масса которых меньше 10000 дальтон, проходят через стенки и удаляются с потоком фильтрата.

Непрерывная циркуляция дисперсии в системе обеспечивает постоянное перемешивание дисперсии вдоль рабочей поверх. ности ультрафильтрационной мембраны.

Очистка и концентрирование дисперсии коллагена идут эа счет ультрафильтрации. через полупроницаемую мембрану (стенка трубы). Циркуляцию и перепад давления по разные стороны мембраны обеспечивает перистальтический насос. Давление на внутреннюю .(рабочую) поверхность мембраны составляет 0,7 кг/см в начале цикла и г

1,8 кг/см в конце цикла. Скорость циркуляции 1.8 n/ìèí в начале и 0.3 я/мин в конце цикла. Очистку и концентрирование завершают при концентрации коллагена в дисперсии 0,65-0,75 вес. .

Пример 1, 20 г очищенной и нарезанной стромы склеры заливают 1 л 10%-ного раствора едкого натра в насыщенном растворе сернокислого натра и оставляют на 48 ч при 15 — 18 C. Раствор сливают и проводят нейтрализацию ткани до рН 6,0 — 7,0, непрерывно перемешивая на магнитной мешалке в 20 -ном растворе борной кислоты.(время нейтрализации около 2 ч, общий обьем 2 ного раствора борной кислоты около 4 л).

Ткань тщательйо промывают дистиллированной водой при осторожном непрерывном перемешивании до полного удаления сульфатиона из промывной жидкости (время промывки около 2 ч, общий обьем дистиллированной. воды ок.оло 5 л). К полученному объему обводненной ткани добавляют равный обьем 0,5 М уксусной кислоты, перемешивают и оставляют на 1 сут при 4 С. Массу гомогениэируют, центрифугируют 30 мин при 2000 об/мин, и оставляют на 3 сут при 4 С. Готовят 1 -ный раствор коллагена в.0,25 М уксусной кислоте. Пол5 ученный раствор фильтруют через стеклянный фильтр.

К 200 мл полученного раствора добавляют 1 r.åäêoãî натра в форме 1 — 10%-ного раствора едкого натра, интенсивно переме10 шивая раствор коллагена после добавления каждой порции раствора щелочи. С помощью диспергатора при скорости вращения ротора 20000 об/мин в течение 3 мин получают гомогенную дисперсную систему

15 рН 4,2 с размером частиц коллагена в дисперсной фазе 5 мкм, Полученную дисперсию разбавляют 0,002 М буферной смесью рН 5,4-5.6 до 0 .1-0,2 вес; (, коллаге-. на, еще раз диспергируют 3 мин при 20000

20 об/мин и подают для циркуляции в систему, выключающую сосуд, перистальтический насос. систему трубок диаметром 2-3 мм,. стенки которых являются полупроницаемой мембраной, Перистальтический насос обес25 печивает начальную скорость циркуляции дисперсии коллагена в системе 1,8 л/мин при начальном давлении на внутреннюю (рабочую) поверхность полупроницаемых трубок в 0,7 кг/смг. По мере концентрирова30 ния дисперсии скорость ее циркуляции снижается до 0,3 л/мин, а давление на рабочую поверхность полупроницаемых трубок возрастает до 1,8 кг/см .

Ультрафильтрацию заканчивают при

35 концентрации коллагена в дисперсии 0,75 вес. .

Далее процесс идет в соответствии с прототипом: полученную дисперсию центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин, 40 разливают на матрицы, повторяющие,сферический контур переднего отрезка глаза, проводят воздушную сушку в пылезащитном шкафу 48 ч при 15 С и относительной влажности воздуха 40-507ь. Готовые изде45 лия подвергают радиационной стерилизации в у-лучах при дозе 25 кГрей и мощности

5 кГрей/ч. Стерильность материала под-. тверждают контрольным бактериологическим исследованием готовых изделий.

50 Кислотно-щелочное состояние готовых иэделий определяют контрольной рН-метрией водной вытяжки навески готовых иэделий, Значение рН изделий из данного варианта

5,4. Количество низкомолекулярных приме55 сей определяют по формуле - - ° 100, где

ЛМ

h, М вЂ” изменение массы готовых изделий относительно их первоначальной массы М1 . после промывки их в сверхчистой воде. Со1711897

Составитель Сг Быков

Редактор И.Касандрг .Техред М.Моргентал Корректор С.Шевкун

Заказ 485 Тираж .. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35;, Раушская наб., 4/5 ь

Произеодстеенно-издательский комбинат Патент.", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 держание низкомолекулярных примесей в готовом изделии для данного варианта составляет 0,9 .

Пример 2. Аналогичен примеру 1, за исключением- того, что к 200 мл 1 -ного раствора коллагена в 0,25 М уксусной кислоте добавляют 1,5 г едкого натра в форме

1-10 -ного раствора едкого натра. С помощью диспергатора при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 6 мин получают гомогенную дисперсную систему рН 5 с размером частиц коллагена в дисперсной фазе 25 мкм. Полученную дисперсию разбавляют 0,002 М раствором ацетата натрия рН 7,2 до концентрации коллагена 0,10.2 вес., еще раз диспергируют при тех же условиях (6 мин, 10000 об/мин) подвергают ультрафильтрации до концентрации коллагена в дисперсии не менее 0,65 вес, Я„далее аналогично примеру 1..

Контрольная рН-метрия водной вытяжки навески готовых изделий показывает значение рН 6;8. Содержание низкомолекулярных примесей в готовых изделиях составляют 1-1,5 .

Пример 3; Аналогичен примеру 1, за исключением того, что к 200 мл 1%-ного раствора коллагена в 0.25 М уксусной кислоте добавляют 2,5 r едкого натрия в форме

1-10 -ного раствора едкого натра. С по-. мощью диспергатора при скорости вращения ротора 20000 об/мин в течение 3 мин получают гомогенную дисперсную систему рН 8,6 с размером частиц в дисперсной фазе

5-10 мкм. Полученную дисперсию разбавляют дистиллированной водой до концентрации коллагена 0,1-0..2 вес,%, еще раз диспергируют при тех же условиях (3 мин, 20000 об/мин). Ультрафильтрацию проводят аналогично примеру 1 до концентрации коллагенаа дисперсии 0,65-0,75 вес. 7ь. Далее к очищенной дисперсии коллагена до-. бавляют дексаэон из расчета 0,5 мг на . каждое изделие.-При формовании и сушке применяют вибрационное воздействие.. Ра, диационную стерилизацию готовых изделий проводят при -198 C при дозе у-излучения 25 кГрей и мощности 5 кГр/ч. Сохранность дексазона после стерилизации определяется на приборе изотахофор фир5 мы LKB и составляет 98 от исходного ко- . личества. Контрольная рН-метрия водной вытяжки навески. готовых изделий показывает значение рН 7,6..

Использование предлагаемого способа

10 изготовления коллагеновых покрытий для офтальмологии позволяет существенно повысить как выход целевого продукта. так и . степень очистки коллагена от низкомолекулярных примесей за счет последовательно15 ro использования в предлагаемом способе у изоэлектрического осаждения коллагена, диспергирования, 8-10 кратного разбавления дисперсии коллагена, циркуляции и концентрирования.дисперсии посредством

20 ультрафильтрации, Скорость очистки возрастает в 5-6 раз, а эффективность очистки— в 5 раз по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

25 Способ изготовления коллагеновых покрытий для использования в офтальмологии, заключающийся в том, что иэ склеры глаз животных выделяют строму, промывают, обрабатывают щелочно-солевым рас30 твором, нейтрализуют, промывают, обрабатывают уксусной кислотой, гомогениэируют, центрифугируют, полученный раствор коллагена фильтруют через стеклянный фильтр, удаляют низкомолекуляр35.:ные примеси, повторно центрифугируют, раствор коллагена помещают в форму, высушивают, формуют и стерилизуют, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, после

40 получения фильтрации раствора коллагена и .фильтрации через стеклянный фильтр производят изоэлектрическое осаждение коллагена и диспергируют полученную смесь, а удаление низкомолекулярных примесей иэ дисперсии

45 производят путем ультрафильтрации.