Лабораторный способ получения биологически активного препарата

 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно, к производству бифидогенной добавки, используемой для ускорения роста заквасочных культур, содержащих бифидобактерии, а также восстановления нормальной микрофлоры кишечника человека при включении препарата в продукты питания в виде пищевой добавки. Предлагаемый способ принципиально состоит из двух основных этапов: разрушение клеток печени и активизация дрожжей в поле действия ультразвука, расщепление белковых компонентов клеток печени и дрожжей ферментами этих микроорганизмов, выделяющимися в окружающий раствор в процессе автолиза. Способ обеспечивает повышение эффективности выделения биологически активных компонентов из ткани печени. 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству бифидогенной добавки, используемой для ускорения роста заквасочных культур, содержащих бифидобактерии, при производстве продуктов питания (питательные среды для получения заквасочных культур, производственных заквасок, продукты питания, получаемые ферментацией), а также восстановления нормальной микрофлоры кишечника человека при включении препарата в продукты питания в виде пищевой добавки.

Известен способ получения дрожжевого автолизата [1]. Для приготовления автолизата прессованные пекарские дрожжи помещают в стеклянные бутыли и заливают нагретой до 55-60^oC дистиллированной водой из расчета на 1 кг дрожжей 5 дм³ воды (соотношение белковое сырье: вода составляет 2:10). Взвесь тщательно перемешивают до получения однородной массы и термостатируют при 50-55^oC в течение 18-24 ч. Затем автолизат автоклавируют 15 мин при 121^oC. Через сутки автолизат расслаивается на прозрачный слой жидкости и осадок из "недопереваренных" клеток. Для практических целей используют только прозрачную часть автолизата. Концентрация аминного азота автолизата (без осадка) составляет 280-300 мг%.

Недостатками описанного способа получения автолизата дрожжей являются: отсутствие этапа активирования ("оживления") дрожжей, способствующего повышению их ферментативной активности; отсутствие этапа фильтрации, способствующего удалению "недопереваренных" дрожжевых клеток; применение автоклавирования (стерилизации) для консервации препарата, что приводит к его дополнительной термообработке непосредственно в процессе приготовления питательной среды или продукта питания (стерилизация, пастеризация) и соответственно к дополнительной потере биологически активных веществ (термолабильные аминокислоты и витамины).

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения печеночного экстракта [2]. Для приготовления экстракта измельчают 454 г печени крупного рогатого скота (кусочки размером 1-2 см³ или фарш) и помещают в стеклянную бутыль вместимостью 5 дм³, добавляют 2,0 дм³ дистиллированной воды (соотношение белковое сырье: вода составляет примерно 2,2: 10) и обрабатывают текучим паром в автоклаве в течение 40-60 мин. Затем отвар фильтруют через грубый бумажный фильтр, разливают в горячем виде по 300 см³, охлаждают до комнатной температуры и хранят при минус 15-20^oC. Концентрация аминного азота в готовом препарате составляет 180-200 мг%.

Недостатками этого способа являются: отсутствие тонкого измельчения ткани печени и использование принципа отваривания печени, что препятствует эффективной экстракции необходимых веществ, например аминокислот, так как при тепловой обработке белок коагулирует, а не распадается до аминокислот; наличие достаточно жесткого режима экстракции (длительная обработка в автоклаве, включающая нагрев до 100^oC, выдержку при этой температуре 40-60 мин и охлаждение до температуры примерно 40^oC), что приводит к частичной инактивации биологически активных веществ, при этом необходимо учитывать и дополнительную термообработку печеночного экстракта при его применении; энергоемкий способ хранения препарата при отрицательной температуре, требующий специального оборудования.

В практической работе печеночный экстракт и дрожжевой автолизат зачастую используют совместно, например, в качестве биостимулирующих компонентов питательной среды МРС-1, предназначенной для выращивания бифидобактерий [3]. При этом экстракт печени и автолизат дрожжей по своим химическим и биогенным свойствам не являются равноценными взаимозаменяемыми препаратами.

Целью изобретения является повышение эффективности выделения биологически активных компонентов из ткани печени.

Поставленная цель достигается тем, что в лабораторном способе получения биологически активного препарата, предусматривающем измельчение тканей печени с последующим разрушением ее клеток, извлечением биологически активных веществ и их консервацией, измельченную ткань печени суспендируют в дистиллированной воде при весовом соотношении печень : дистиллированная вода 1:10 или 2: 10, в полученную суспензию добавляют сухие пекарские дрожжи при весовом соотношении печень : сухие дрожжи 5:2 или 5:0,5 соответственно, перемешивают, дезинтегрируют ультразвуком клетки печени, после чего полученный дезинтеграт выдерживают при температуре 50-52^oC в течение 19-20 ч, затем подвергают кипячению в течение 1-2 мин, фильтруют и полученный препарат консервируют хлороформом при объемном соотношении хлороформ : препарат 0,01: 2,0; причем при весовом соотношении печень : дистиллированная вода 1:10 в суспензию добавляют брикетированные пекарские дрожжи при весовом соотношении печень : брикетированные дрожжи 1:1, а дезинтеграцию клеток печени ультразвуком проводят в течение 4-5 ч при температуре 20-400^oC.

Физический смысл этого применительно к выделению, например, аминокислот заключается в использовании интенсивных, но мягких по сравнению с автоклавированием технологических приемов, а именно ультразвуковой дезинтеграции клеток печени с одновременной активизацией клеток пекарских дрожжей, находящихся среди разрушенных печеночных клеток, из которых в окружающий раствор выделились углеводные соединения. То есть происходит ферментация дрожжами "печеночных" углеводов и соответственно активизация у дрожжей различных ферментных систем. При ультразвуковой обработке печеночно-дрожжевой суспензии разрушаются преимущественно печеночные клетки, дрожжи претерпевают незначительные деструктивные изменения. При разрушении клеток печени в окружающий раствор выделяются и белковые компоненты, которые по завершении ультразвуковой обработки расщепляются протеолитическими ферментами дрожжей, высвобождающимися при автолизе этих микроорганизмов, имеющем место при термостатировании дезинтеграта, то есть происходит ферментация "печеночных" белков.

Белковые компоненты дрожжей также подвергаются "самоперевариванию" и обогащают данную биотехнологическую систему аминокислотами и другими веществами, что приводит к получению, с одной стороны, более концентрированного раствора, а с другой, - комплексного биологически активного печеночно-дрожжевого препарата.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Предварительно взвешенный образец, например, говяжьей печени тонко измельчают в фарфоровой ступке в течение 10-20 мин, в зависимости от массы образца. Полученный гомогенат смывают из фарфоровой чашки дистиллированной водой в промежуточную емкость, куда в случае необходимости добавляют еще порцию дистиллированной воды для получения соответствующей концентрации ткани печени в суспензии (соотношение печень : дистиллированная вода 1:10 или 2:10). Затем туда же в определенной пропорции вносят сухие (соотношение печень : сухие дрожжи 5:2 или 5:0,5 соответственно) или раскрошенные брикетированные пекарские дрожжи (соотношение печень : брикетированные дрожжи 1:1). Суспензию хорошо перемешивают и фасуют в стеклянные флаконы, которые закрывают резиновыми или ватно-марлевыми пробками и помещают в ультразвуковое устройство.

Для ультразвуковой обработки печеночно-дрожжевой суспензии используют ультразвуковое устройство с низкой интенсивностью ультразвукового воздействия, например ультразвуковую ванну UM-4 фирмы Unitra (емкость ванны 4 дм³ частота 25 кГц, подаваемая на излучатели мощность - 40 Вт). К ультразвуковым устройствам с высокой интенсивностью ультразвукового воздействия относится, например, лабораторное устройство для ультразвуковой дезинтеграции дрожжей [4] (емкость ванны 0,3 дм³ резонансная частота 20 кГц, подаваемая на излучатель мощность - 120 Вт), с помощью которого дрожжи разрушаются практически полностью за 10 мин. Но в данном случае перед ультразвуком стоит другая задача - нужно разрушить клетки печени, а клетки дрожжей активизировать.

Ультразвуковую ванну предварительно заполняют дистиллированной водой (промежуточной средой), в которую и помещают флаконы с суспензией. Такой прием (закупоренные флаконы с суспензией находятся в промежуточной среде) исключает контакт суспензии с металлическими частями ванны и кислородом воздуха, предотвращает аэрозолирование самой суспензии и загрязнение окружающей среды [4] . Ультразвуковую дезинтеграцию ведут в течение 4-5 ч (чистое время) при температуре 20-40^oC, что приводит к разрушению 70-80% печеночных и 0,5% дрожжевых клеток, что регистрируется прямым подсчетом клеток при микроскопировании образцов в камере Горяева. При разрушении клеток печени в окружающий раствор выходят внутриклеточные белоксодержащие компоненты, а также происходит активизация клеток дрожжей за счет ферментации глюкозы и гликогена, содержавшихся в клетках печени, о чем свидетельствует появление слабо выраженного запаха спирта. Необходимо подчеркнуть, что устойчивость животных клеток к ультразвуку существенно ниже, чем у микроорганизмов.

Флаконы с дезинтегратом помещают в термостат при температуре 50-52^oC на 19-20 ч. При этом происходит автолиз (лизис) клеток дрожжей, под действием внутриклеточных ферментов происходит разрыв клеточных оболочек и содержимое клеток выходит в окружающий раствор. Ферменты дрожжевых клеток, в частности протеолитические, расщепляют белковые компоненты печеночных и дрожжевых клеток до низкомолекулярных пептидов и аминокислот, что регистрируется по величине аминного азота. В результате ферментации белков высвобождаются витамины и минеральные элементы, которые в совокупности и определяют биологическую активность препарата.

Полученный полуфабрикат кипятят в течение 1-2 мин для инактивации остаточных физиологически активных дрожжевых клеток и коагуляции нерасщепленного белка. Эффективность инактивации дрожжей определяют при бактериологическом контроле. В данном случае содержание дрожжей в препарате составляет 1-5 КОЕ/г, что ниже допустимых норм, например, для молочных продуктов детского питания, в которых допускается содержание дрожжей 10-50 КОЕ/г [5]. После выпадения осадка и естественного охлаждения до комнатной температуры препарат фильтруют, например, через бумажный фильтр, отбирают пробу для определения аминного азота. Затем фильтрат переносят в стеклянную бутыль и консервируют хлороформом из расчета 10 см³ на 1 дм³ препарата, бутыль тщательно укупоривают. Данный способ консервации является достаточно надежным (препарат может храниться в течение месяца при комнатной температуре) и в то же время более мягким по отношению к биологически активным веществам, чем стерилизация. Хлороформ легко испаряется при термообработке (стерилизация, пастеризация) питательной среды и продукта питания, в состав которых введен данный биологически активный препарат.

Величина аминного азота в готовом препарате составляет 300-350 мг%.

Содержание аминного азота является основным качественным показателем препарата применительно к накоплению аминокислот и пептидов, другие же характеристики, в частности, количество разрушенных клеток печени и появление запаха спирта после ультразвуковой обработки суспензии ткани печени и дрожжей, а также остаточное количество клеток дрожжей после кипячения и фильтрации препарата являются сугубо вспомогательными, они необходимы только для отработки технологии или масштабирования процесса.

В примерах конкретного выполнения процесса использованы весовые соотношения печень : дистиллированная вода меньшее (1:10) и характерное (2:10) для прототипа, чтобы убедительно показать повышение эффективности извлечения, например, белковых компонентов.

Пример 1.

Измельчают в течение 10 мин 100 г говяжьей печени в фарфоровой ступке, смывают полученный гомогенат 1 дм³ дистиллированной воды в бутыль вместимостью 2,0 дм³ и добавляют 20 г сухих пекарских дрожжей (20 г сухих дрожжей по своему гликолитическому действию примерно соответствуют 100 г брикетированных дрожжей). Суспензию хорошо перемешивают и разливают в стеклянные флаконы вместимостью 200 см³, которые закрывают пробками и погружают в ультразвуковую ванну UM-4 фирмы Unitra, предварительно заполненную дистиллированной водой.

Ультразвуковую обработку суспензии ведут в течение 5 ч при температуре 20-40^oC. Затем флаконы с дезинтегратом помещают в термостат при температуре 50-52^oC на 19 ч. Полученный полуфабрикат кипятят в течение 1 мин и после выпадения осадка и охлаждения до комнатной температуры фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат собирают в бутыль вместимостью 1,0 дм³, отбирают пробу для определения аминного азота и консервируют полученный препарат хлороформом из расчета 0,01 дм³ на 1 дм³ продукта.

Величина аминного азота составляет 215 мг%.

В данном примере соотношение печень : вода составляет 1:10, а соотношение печень : сухие дрожжи 5:1. Величина аминного азота у прототипа 180-200 мг%, поэтому препарат, полученный в данном случае, не является "зачетным".

Пример 2.

Измельчают в течение 20 мин 200 г говяжьей печени в фарфоровой ступке, смывают полученный гомогенат 1 дм³ дистиллированной воды в бутыль вместимостью 2,0 дм³ и добавляют 20 г сухих пекарских дрожжей.

Суспензию хорошо перемешивают и разливают в стеклянные флаконы вместимостью 200 см³, которые закрывают пробками и погружают в ультразвуковую ванну UM-4 фирмы Unitra, предварительно заполненную дистиллированной водой. Ультразвуковую обработку ведут в течение 4 ч. при температуре 20-40^oC. Затем флаконы с дезинтегратом помещают в термостат при температуре 50-52^oC на 20 ч. Полученный полуфабрикат кипятят в течение 2 мин и после выпадения осадка и охлаждения до комнатной температуры фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат собирают в бутыль вместимостью 1,0 дм³, отбирают пробу для определения аминного азота и консервируют полученный препарат хлороформом из расчета 0,01 дм³ на 1 дм³ продукта.

Величина аминного азота составляет 354 мг%.

В данном случае соотношение печень : вода составляет 2:10, а соотношение печень : сухие дрожжи 5:0,5. Величина аминного азота у полученного образца препарата примерно в 1,5-2 раза превышает таковую у прототипа.

Пример 3.

Измельчают в течение 10 мин 100 г говяжьей печени в фарфоровой ступке, смывают полученный гомогенат 1 дм³ дистиллированной воды в бутыль вместимостью 2,0 дм³ и добавляют 40 г сухих пекарских дрожжей. Суспензию хорошо перемешивают и разливают в стеклянные флаконы вместимостью 200 см³, которые закрывают пробками и погружают в ультразвуковую ванну UM-4 фирмы Unitra, предварительно заполненную дистиллированной водой. Ультразвуковую обработку ведут в течение 5 ч при температуре 20-40^oC. Затем флаконы с дезинтегратом помещают в термостат при температуре 50-52^oC на 19 ч. Полученный полуфабрикат кипятят в течение 2 мин и после выпадения осадка и охлаждения до комнатной температуры фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат собирают в бутыль вместимостью 1 дм³, отбирают пробу для определения аминного азота и консервируют полученный препарат хлороформом из расчета 0,01 дм³ на 1 дм³ продукта.

Величина аминного азота составляет 308 мг%.

В данном случае соотношение печень : вода составляет 1:10, а соотношение печень : сухие дрожжи 5:2. Величина аминного азота у полученного образца препарата в 1,5 раза превышает таковую у прототипа.

Пример 4.

Измельчают в течение 10 мин. 100 г говяжьей печени в фарфоровой ступке, смывают полученный гомогенат 1 дм³ дистиллированной воды в бутыль вместимостью 2,0 дм³ и добавляют 100 г раскрошенных брикетированных пекарских дрожжей. Суспензию хорошо перемешивают и разливают в стеклянные флаконы вместимостью 200 см³, которые закрывают пробками и погружают в ультразвуковую ванну UM-4 фирмы Unitra, предварительно заполненную дистиллированной водой. Ультразвуковую обработку ведут в течение 4 ч при температуре 20-40^oC. Затем флаконы с дезинтегратом помещают в термостат при температуре 50-52^oC на 20 ч. Полученный полуфабрикат кипятят в течение 1 мин и после выпадения осадка и охлаждения до комнатной температуры фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат собирают в бутыль вместимостью 1 дм³, отбирают пробу для определения аминного азота и консервируют полученный препарат хлороформом из расчета 0,01 дм³ на 1 дм³ продукта.

Величина аминного азота составляет 316 мг%.

В данном случае соотношение печень : вода составляет 1:10, а соотношение печень : брикетированные дрожжи 1:1. Величина аминного азота у полученного образца препарата в 1,6 раза превышает таковую у прототипа.

Несоответствие величин аминного азота у препарата в данном примере и примере 1 объясняется более низкой ферментативной активностью сухих дрожжей по сравнению с брикетированными (факт известный), но с сухими дрожжами гораздо удобнее работать (хранение, взвешивание и т.п.).

Использование белкового сырья (печень совместно с дрожжами) в количестве, превышающем 200-250 г, в лабораторных условиях затруднено из-за плохой фильтруемости полуфабриката через бумажный фильтр.

Образцы препарата, описанные в примерах 2, 3, 4, имеют величину аминного азота, в 1,5-2 раза большую, чем у печеночного экстракта-прототипа, что свидетельствует о выполнении поставленной в изобретении задачи.

Комплексный биологически активный печеночно-дрожжевой препарат представляет собой аминокислотно-витамино-минеральный комплекс, получаемый по комбинированной технологии. Благодаря широкому спектру содержащихся в нем биогенных веществ он может быть использован не только как биостимулятор молочнокислых бактерий [6] или бифидогенный фактор [7], так и в качестве самостоятельного продукта по типу биокорректоров "Александрины", "Нагипола" и "Риалама" (при условии выпуска препарата в производственных условиях в сухом или таблетированном виде).

Для получения биологически активных препаратов предлагаемым способом вместо печени могут быть использованы кровь, селезенка, почки, легкие, мозг и мышечная ткань животных.

Применение пекарских дрожжей при получении подобных препаратов целесообразно в тех случаях, когда препарат должен содержать минимальное количество свободных углеводов (некоторые питательные среды, диетические и диабетические продукты), в частности, в описанных в изобретении образцах отношение концентрации углеводов к содержанию аминного азота составляет 0,6-1,0, а при использовании индивидуальных протеолитических ферментов (пепсин, трипсин и т.п.), которые не расщепляют углеводов - 2,0-6,0 [8].

Источники информации 1. С.М.Семенов. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: Агропромиздат. 1990, с.107.

2. То же, стр.155.

3. Н. С.Королева, М.С.Кондратенко. Симбиотические закваски термофильных бактерий в производстве кисломолочных продуктов. Пищевая промышленность. М., 1978, с.146.

4. В. К. Фирсов Лабораторное устройство для ультразвуковой интеграции дрожжей. Заявка на патент РФ N 97116900/13 от 03.10.97.

5. МУК 4.2. 577-96. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов. Минздрав России. М., 1998, с. 71.

6. И.В.Ветрова, А.В.Гудков. Усиление молочнокислого брожжения / Молочная промышленность, 1975, N 6, с.18.

7. Б. А. Шендерев, М.А.Манвелова. Функциональное питание. Микроэкологические аспекты. М., 1994, с.25.

8. С. М.Семенов. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М., Агропромиздат, 1990, с.114.

Формула изобретения

1. Лабораторный способ получения биологически активного препарата, предусматривающий измельчение ткани печени с последующим разрушением ее клеток, извлечением биологически активных веществ и их консервацией, отличающийся тем, что измельченную ткань печени суспендируют в дистиллированной воде при весовом соотношении печень : дистиллированная вода = 1 : 10 или 2 : 10, в полученную суспензию добавляют брикетированные или сухие пекарские дрожжи при весовом соотношении печень : сухие дрожжи 5 : 2 или 5 : 0,5 соответственно, перемешивают, дезинтегрируют ультразвуком клетки печени, после чего полученный дезинтеграт выдерживают при температуре 50 - 52^oC в течение 19 - 20 ч, затем подвергают кипячению в течение 1 - 2 мин, фильтруют и полученный препарат консервируют хлороформом при объемном соотношении хлороформ : препарат 0,01 : 1,0.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при весовом соотношении печень : дистиллированная вода 1 : 10 в суспензию добавляют брикетированные пекарские дрожжи при весовом соотношении печень : брикетированные дрожжи 1 : 1.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дезинтеграцию клеток печени ультразвуком проводят в течение 4 - 5 ч при температуре 20 - 40^oC.