Производные простого диалкилового эфира, фармацевтическая композиция, проявляющая активность в отношении снижения в плазме уровня липопротеина (a), аполипопротеина в, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности и в отношении повышения в плазме уровня аполипопротеина а-i или е, комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности, способ снижения в плазме уровня липопротеина (a), аполипопротеина в, триглециридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, способ профилактики или лечения заболеваний сосудов, связанных со снижением в плазме уровня липопротеина (a), аполипопротеина в, триглециридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, а также с повышением в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина а-i или е, или инсулиннезависимого сахарного диабета, способ повышения в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина a-i или e

 

Описываются новые производные простого диалкилового эфира общей формулы (I), где n и m независимо друг от друга означают целые числа 2 - 6, R¹, R², R³ и R⁴ независимо друг от друга означают алкил с числом атомов углерода от одного до шести, Y¹ и Y² независимо друг от друга означают карбоксильную группу или группу COOR⁵, где R⁵ означает алкил с числом атомов углерода от одного до шести. Указанные соединения используются в фармацевтической композиции, проявляющей активность в отношении снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности и в отношении повышения в плазме уровня аполипопротеина А-I или Е, комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности. Описываются также способ снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности путем введения эффективного количества соединения формулы (I) в качестве активного вещества и способ повышения в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I и Е путем введения эффективного количества соединения формулы (I) в качестве активного вещества. Описываются способ профилактики или лечения заболевания сосудов и способ профилактики или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета путем введения соединения общей формулы (I) в качестве активного вещества. 6 с. и 17 з.п. ф-лы, 40 ил.

Настоящее изобретение относится к профилактике или лечению заболеваний сосудов или диабета, более конкретно к производным диалкилового эфира фармацевтической композиции, проявляющей активность в отношении снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности и в отношении повышения в плазме уровня аполипопротеина А-I или Е, комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности, способу снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, способу профилактики или лечения заболеваний сосудов, связанных со снижением в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комлекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, а также с повышением в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I или Е, или инсулиннезависимого сахарного диабета, способу повышения в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I или Е.

Известен ряд химических соединений для профилактики или лечения заболеваний сосудов или диабета, например производные тиазолидинона, пригодные, в частности, для профилактики или лечения инсулиннезависимого диабета (см. заявку ЕР 0277836, кл. С 07 D 417/12, опубл. 10.08.1988г.).

Задачей изобретения является расширить арсенал высокоэффективных химических соединений, пригодных для профилактики или лечения заболеваний сосудов или инсулиннезависимого диабета.

Поставленная задача решается предлагаемыми производными простого диалкилового эфира общей формулы (I) где n и m независимо друг от друга означают целые числа от 2 до 6; R¹, R², R³ и R⁴ независимо друг от друга означают алкил с числом атомов углерода от одного до шести, Y¹ и Y² независимо друг от друга означают карбоксильную группу или группу COOR⁵, где R⁵ означает алкил с числом атомов углерода от одного до шести.

В первую группу предпочтительных производных простого диалкилового эфира вышеприведенной общей формулы (I) входят соединения, у которых каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает алкил с числом атомов углерода от одного до шести.

Во вторую группу предпочтительных производных простого диалкилового эфира вышеприведенной общей формулы (I) входят соединения, у которых каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает одинаковые алкильные группы и оба радикала Y¹ и Y² означают карбоксильную группу.

В третью группу предпочтительных производных простого диалкилового эфира вышеприведенной общей формулы (I) входят соединения, у которых каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает метильную группу, при этом m и n означают одно и то же целое число, в частности 2, 3, 4 или 5.

В четвертую группу предпочтительных производных простого диалкилового эфира вышеприведенной общей формулы (I) входят соединения, у которых оба радикала Y¹ и Y² означают группу COOR⁵, в которой R⁵ предпочтительно означает метил или этил, a m и n означают одно и то же целое число.

В частности, предпочитаются соединения, выбранные из группы, включающей 6,6'-окси-бис-(2,2-диметил-гексановую кислоту) 4,4'-окси-бис-(2,2-диметилбутановую кислоту), 5,5'-окси-бис-(2,2-диметилпентановую кислоту), 7,7'-окси-бис-(2,2-диметилгептановую кислоту), 2,2-диметил-8-(7-метил-7-метоксикарбонилоктилокси)-октановую кислоту,
2,2-диметил-5-(4-метил-4-этоксикарбонилпентилокси)-пентановую кислоту.

Производные простого диалкилового эфира общей формулы (I) получают с помощью хорошо известных в области органической химии способов. В типичном синтезе проводят взаимодействие замещенного карбоксильной группой алкилгалогенида с замещенным карбоксильной группой алканолом в присутствии основания и в результате конденсации получают целевое соединение. Обычно при этом в качестве исходных используют сложные эфиры соответствующих карбоновых кислот и тогда получают соответствующие изобретению соединения, у которых обе группы Y¹ и Y² означают COOR⁵. При необходимости простым омылением одну или обе сложноэфирные группы переводят в свободную кислоту. Такая реакция конденсации изображается следующей схемой:

в которой Hal означает атом брома, хлора, иода или аналогичную по реакционной способности группу, а группы Y¹ и Y² предпочтительно означают COOR⁵. В общем случае указанная реакция проводится таким образом, чтобы на первой стадии протекало взаимодействие соответствующего алканола с примерно эквивалентным количеством такого основания, как гидрид натрия или металлический натрий, обычно для этого используется инертный органический растворитель, например бензол, толуол, ксилол, тетрагидрофуран или подобные им растворители. Таким образом получают производное по атому кислорода спиртовой группы алканола, которое далее легко реагирует с эквимолярным количеством алкилгалогенида с образованием соответствующего изобретению соединения. В общем случае реакция практически полностью заканчивается за время от двух до примерно десяти часов, если ее проводят при повышенных температурах в интервале от примерно 50^oС до примерно 120^oС. Целевой продукт легко выделяют простым удалением растворителя реакции, например, с помощью упаривания. При необходимости продукт реакции может быть очищен обычными способами, например кристаллизацией, из таких растворителей, как этилацетат, бензол, гексан и подобные им, или хроматографированием, например, с использованием в качестве неподвижной фазы силикагеля.

Альтернативный способ заключается в реакции галогензамещенных диалкиловых простых эфиров с α,α-дизамещенной уксусной кислотой или с ее эфиром или же с соответствующим уксусным альдегидом. Такая реакция изображается следующей схемой:



Представленный процесс используют предпочтительно для получения соединений, у которых R¹ и R² имеют то же самое значение, что и соответствующие R³ и R⁴, и у которых Y¹ имеет то же самое значение, что и Y². В таком случае галогензамещенный диалкиловый эфир реагирует с двумя или более эквивалентами производного уксусной кислоты.

Реакцию проводят обычно в растворителе, в котором растворяются все реагирующие вещества, например в тетрагидрофуране, диоксане, серном эфире или в другом аналогичном растворителе, в присутствии такого основания, как гидрид натрия, металлический натрий, бутиллитий или подобные им соединения. В общем случае реакция завершается за время от двух до примерно десяти часов, если ее проводят в температурном интервале от 0^oС до примерно 50^oС. Продукт реакции легко выделяют после удаления растворителя и проводят затем очистку, если она необходима, используемыми обычно способами, включающими хроматографию, кристаллизацию и подобные приемы.

В некоторых случаях во избежание нежелательных побочных реакций появляется необходимость в защите функциональных групп с помощью удаляемых затем органических радикалов. Так, например, можно получить производные по свободным карбоксильным группам введением в них радикалов, которые исключают их превращения в проводящихся химических реакциях, а после этого такой радикал при желании может быть легко удален с получением свободной карбоксильной группы. Защитные группы для карбоксильных функций широко известны. Так, например, карбоксильные группы можно переводить в сложные эфиры, например в п-нитробензиловые эфиры или в 2,2,2-трихлорэтиловые эфиры. Такие сложноэфирные группы при желании легко гидролизуются и освобождают карбоксильную группу.

Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, проявляющая активность в отношении снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности и в отношении повышения в плазме уровня аполипопротеина А-I или Е, комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности, которая включает эффективное количество соединения вышеприведенной общей формулы (I), а также фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.

Дальнейшим объектом изобретения являются способ снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, который заключается в том, что вводят эффективное количество соединения вышеприведенной общей формулы (I) в качестве активного вещества, а также способ повышения в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I или Е, который заключается в том, что вводят эффективное количество соединения вышеприведенной общей формулы (I) в качестве активного вещества.

Кроме того, объектом изобретения является способ профилактики или лечения заболеваний сосудов, связанных со снижением в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комлекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, а также с повышением в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I или Е, который заключается в том, что вводят эффективное количество соединения вышеприведенной общей формулы (I) в качестве активного вещества.

Еще одним объектом изобретения является способ профилактики или лечения инсулиннезависимого сахарного диабета путем введения активного вещества, который заключается в том, что в качестве активного вещества вводят соединения вышеприведенной общей формулы (I) в эффективном количестве.

Получение соединений вышеприведенной общей формулы (I) поясняется следующими примерами.

Пример 1
6,6'-окси-бис-(2,2-диметилгексановая кислота)
К перемешиваемому раствору 28 г 60%-ной суспензии в минеральном масле (700 ммолей) гидрида натрия и 61 г (600 ммолей) диизопропиламина в 600 мл сухого тетрагидрофурана прибавляют 52,9 г (600 ммолей) изомасляной кислоты. Реакционную массу в течение 30 минут перемешивают при 24^oС, затем охлаждают до 0^oС в бане из льда с ацетоном, прибавляют к холодному раствору 286 мл 2,1 М раствора (600 ммолей) н-бутиллития и перемешивают в течение 1 часа при 0^oС. К холодной реакционной массе в течение 15 минут при перемешивании прибавляют по каплям 59,7 г (297 ммолей) 4,4'-дихлордибутилового эфира, нагревают смесь до 24^oС и продолжают перемешивание в течение 48 часов. Реакционную массу разбавляют прибавлением 600 мл воды, водный слой отделяют, промывают 200 мл серного эфира и подкисляют его до рН 5,0 (по Конго красному), прибавляя около 150 мл 6 н. соляной кислоты. Кислый водный раствор экстрагируют тремя порциями по 300 мл серного эфира. Эфирные вытяжки объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, отделяют растворитель упариванием при пониженном давлении и получают продукт реакции в виде масла. Это масло перегоняют при 160^oС в вакууме 3 мм рт. ст. и получают 66,7 г 6,6'-окси-бис-(2,2-диметилгексановой кислоты), т.пл. 49-51^oС.

Анализ: вычислено в% С 63,47, Н 9,88. С₁₆Н₃₀О₅. Найдено % С 63,75. Н 10,00.

По аналогии с общей методикой, приведенной в примере 1, получены следующие далее соединения.

Пример 2
7,7'-окси-бис-(2,2-диметилгептановая кислота)
М.вес.: 330,46
Белое твердое вещество
Т.пл.: 44-46^oС
Пример 3
5,5'-окси-бис-(2,2-диметилпентановая кислота)
М.вес.: 274,36
Белое твердое вещество с растворимостью в 0,1 N КОН, равной 10-100 мг/мл.

Пример 4
4,4'-окси-бис-(2,2-диметилбутановая кислота)
М.вес.: 246,3
Белое твердое вещество с растворимостью в воде, равной 10-100 мг/мл.

Пример 5
Этиловый эфир 2,2-диметил-5-(4-метил-4-этоксикарбонилпентилокси)-пентановой кислоты
М.вес.: 330,46
Прозрачная бесцветная жидкость
Пример 6
Этиловый эфир 2,2-диметил-6-(5-метил-5-этоксикарбонилгексилокси)-гексановой кислоты
М.вес.: 358,52
Прозрачная бесцветная жидкость
Пример 7
Метиловый эфир 2,2-диметил-8-(7-метил-7-метоксикарбонилоктилокси)-октановой кислоты,
М.вес.: 386,57
Т.к._0,08:160-163^oС
Пример 8
2,2-диметил-7-(4-метил-4-гидроксикарбонилпентилокси)-гептановая кислота
М.вес.: 302,41
Т.пл.:41-42^oС.

Как указывалось выше, простые диалкиловые эфиры формулы (I) применимы для лечения и профилактики заболеваний сосудов, таких как болезнь коронарных сосудов сердца, приступы острой сердечной недостаточности, рестеноз и подобные заболевания, благодаря их способности снижать в плазме уровень холестерина с таким обогащенным триглицеридами липопротеином, как липопротеин низкой плотности, и повышать уровень холестерина в комплексе с липопротеинами высокой плотности. Эти соединения особенно эффективны для снижения уровня липопротеина (а), равно как и для повышения уровня холестерина в липопротеинах высокой плотности.

Способность производных диалкиловых простых эфиров формулы I снижать уровень липопротеинов (а) и повышать уровень комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности была определена в опытах in vivo, которые обычно используются специалистами в этой области. Опыты на крысах проводились в соответствии со следующим далее протоколом.

Самцы крыс линии Спраг-Даули весом 100-200 г, поставлявшиеся лабораторией Чарльз Ривер, помещались по 3-6 животных в одну клетку со свободным доступом к корму для крыс фирмы Пурина и к воде. Температура в помещении контролировалась, устанавливался двенадцатичасовой цикл смены света и темноты с включением света в 6 часов утра. Ежедневно от 6 до 9 часов утра крысы получали пероральную дозу исследуемых соединений в виде раствора или суспензии в воде с добавлением 0,2% Твина-20 и 1,5% карбоксиметилцеллюлозы, контрольные животные получали только носитель лекарственного средства. Объем носителя составлял 0,25% от веса животного, в качестве препарата сравнения во всех опытах использовался гемфиброзил в количестве 100 мг/кг в день. Исследуемые соединения вводились в дозе до 100 мг/кг в день в течение срока от семи до четырнадцати дней. Сытых крыс усыпляли за счет вдыхания паров эфира, взвешивали, отводили кровь через сердце и отправляли на извлечение печени для определения ее веса. Кровь переносили в вакуумные контейнеры-пробирки с этилендиаминтетраацетатом для выделения плазмы. Кровь подопытных обезьян отводили непосредственно в вакуумные контейнеры-пробирки для выделения плазмы и сыворотки.

Самцы подопытных обезьян (mасаса fascicularis) поступали из лаборатории Чарльз Ривер (Вилмингтон, МА). Их помещали в отдельные клетки и каждый день кормили диетой, состоявшей из 20 нормальных кормовых бисквитов для обезьян (Ралстон Пурина, Сент-Луис, МО) и фруктов (один банан и 12 виноградин). Свобода движения прошедших предварительную дрессуру обезьян ограничивалась стандартным оборудованием для приматов (фирма Праймит Продактс, Вудсайд, СА), для отбора проб крови на кровеносных сосудах обезьян устанавливались приспособления фирмы Норфолк Медикал Продактс, Скоки, ИЛ. Эффективность соединения по примеру 1 изучалась в опытах с нарастанием дозы. Для предварительного изучения в течение трех недель из кровеносных сосудов, закрепленных на стульчиках обезьян, через приспособления для отбора крови было получено три базовых образца крови. Для изучения вещества по примеру 1 обезьян фиксировали на стульчиках и каждый день во время от 5 до 7 часов утра вводили им через рот дозы в 3 мг/кг (первая неделя), 10 мг/кг (вторая неделя) и 30 мг/кг (третья неделя) суспензии вещества по примеру 1 в носителе, содержавшем 0,2% Твина-20 и 1,5% карбоксиметилцеллюлозы. Во время этого опыта пробы крови отбирались натощак еженедельно через 24 часа после введения дозы. Дополнительные образцы крови были взяты натощак через одну неделю после прекращения введения вещества по примеру 1. В течение всего времени проведения опыта потребление пищи и поведение обезьян были в пределах нормы.

Образы плазмы крови обезьян хранили на льду, отбирали из них аликвотные пробы в несколько микропробирок, быстро замораживали и хранили при температуре -70^oС. Образцы сыворотки хранили при температуре 4^oС, прежде чем отправить их на описываемый далее анализ на содержание специфических сывороточных ферментов и альбуминов.

Анализ образцов.

Триглицериды определяют с использованием поступающих в продажу стандартных наборов (Trigli-cinct 2, Sclavo, Сиена, Италия, или Triglyceride G, Waco Pure Chemical Industries, Ltd, Осака, Япония). Общее содержание холестерина в плазме определяют ферментативно по известной методике Оллейна и др. , Clin. Chem., 20:470-474 (1974). Распределение общего холестерина в липопротеинах определяют методом высокоэффективной гельхроматографии на проточной колонке с носителем Сефароза 6 на приборе Rainin HPLC (см. Кифт и др. , J. Lipid Res., 32:859-866 (1991)). Определяют долю холестерина в липопротеинах по отношению к общему холестерину и процентный состав распределения холестерина на основании данных, полученных с помощью высокоэффективной гельхроматографии.

Количественное определение аполипопротеинов A-I и Е в цельной плазме проводят иммуноэлектрофоретически по методу Лоурел и др., Methods Enzymol, 73:339-369 (1981), с использованием антител, образующихся в организме кроликов в ответ на введение аполипопротеина A-I крыс и в организме коз в ответ на введение аполипопротеина Е крыс (получено от Др Патрик Тсо, медицинский центр LSU, Шривпорт, ЛА). Образцы плазмы разбавляют 4 М раствором мочевины, содержащим 1% тритона Х-100, 12 ммоль/л трицина, 40 ммоль/л Трис, 0,6 ммоль/л лактата кальция и 0,01% азида натрия с рН 8,2 и инкубируют в течение 60 мин при температуре 52^oС перед началом иммуноэлектрофореза. Подходящую степень разбавления плазмы крови крыс подбирают таким образом, чтобы определяемые в опыте значения содержания аполипопротеинов давали линейную зависимость. Иммуноэлектрофорез проводят в пленке GelBond (Cat 53748, FMC Bioproducts, Рокленд, ME), содержащей обычно 4% кроличьих антител на крысиный аполипопротеин A-I или 2% козьих антител на крысиный аполипопротеин Е, а также 1% агарозы, 2% полиэтиленгликоля 6000 с 24 ммоль/л трицина, 80 ммоль/л Трис и 1,2 ммоль/л лактата кальция. Высоту подъема определяют на окрашенных амидным черным гелях. Для количественной оценки результатов анализов уровень аполипопротеинов в плазме животных контрольных групп принимался равным 100.

Оценка уровня крысиного аполипопротеина В проводилась на минимально модифицированных микротитр-пластинках, описанных Рифай и др., Clin. Chem., 32, стр. 957-961 (1986), то есть иммунотурбидиметрическим методом с использованием антител, образующихся в организмах овец в ответ на введение мышиного аполипопротеина В; эти антитела перекрестно реагируют и с крысиным аполипопротеином В. Образцы плазмы участвующих в эксперименте животных объемом 5, 10, 20 и 30 мкл или объединенные образцы стандартной плазмы крыс (0-50 мкл) смешивают с раствором 2 М мочевины, 10% сыворотки с антителами на мышиный аполипопротеин В и 1,6% полиэтиленгликоля 8000 (конечная концентрация в растворе) в суммарном объеме 200 мкл рассола с фосфатным буфером. Помутнение (на длине волны 340 нм) определяют в начале опыта и затем еще раз после инкубации при комнатной температуре в течение ночи с помощью 96-ти канального спектрофотометра поглощения Titertek Multiscan MCC/340MK II (Flow Laboratories). Оптимальное разбавление плазмы крыс (обычно 10 мкл) подбирают для определения аполипопротеина В в области линейной концентрационной зависимости. Для анализа результатов экспериментов уровень аполипопротеина В в плазме получавших лекарство животных сравнивают с данными, полученными на контрольной группе, которые произвольно принимают за 100 для каждого опыта.

Уровни липопротеина (а) у обезьян определяют с помощью имеющегося в продаже стандартного набора Lp (a) ELISA (Apo-Tek Lp (a) Elisa Test System, Organon Teknika, Biotechnology Research Institute), разработанного для определения липопротеина (а) человека. Количественная оценка уровня липопротеина (а) проводится по сэндвич-способу, в котором аполипопротеин (а), захваченный антиаполипопротеином (а) (в покрытии микротитр-пластинки), определяют по его ассоциации с аполипопротеином В при действии растворимого ферментативно связанного антитела. Стандартные кривые, полученные на плазме человека и использовавшихся в опытах обезьян, проходят параллельно, и это предполагает, что данные этих опытов могут использоваться для количественного определения липопротеина (а) обезьян. Измерения уровня липопротеина (а) во всех образцах плазмы использовавшихся в опытах обезьян проводили в один прием по трем измерениям на образцах, которые оттаивали только один раз. На получавших стандартное питание крысах гемфиброзил сравнивают с веществом по примеру 1 по их способности влиять на различные параметры липидов. Полученные данные представляют собой усредненные результаты нескольких отдельных экспериментов, проводившихся в течение одной недели, и одного эксперимента двухнедельной продолжительности на группе из восьми крыс. Данные по каждому эксперименту приводят к результатам, полученным в каждом из экспериментов на крысах, которым вводился только носитель лекарственного средства. Гемфиброзил в дозе 100 мг/кг в день не влиял на аполипопротеин A-I в плазме, уровень которого повышался главным образом от высоких доз вещества по примеру 1. Уровень аполипопротеина Е слабо повышался гемфиброзилом и то лишь в заметно более высокой дозе, чем это определялось веществом по примеру 1. Эти данные относятся в основном к экспериментам продолжительностью в одну неделю (недельные опыты проводились на группе из тридцати животных, двухнедельные опыты на группе из восьми животных) и поэтому сюда не попадает заметное повышение уровня аполипопротеина Е, которое наблюдалось в двухнедельных опытах с гемфиброзилом. И гемфиброзил, и вещество по примеру 1 оба значительно снижают уровень аполипопротеина В. Эти изменения состава аполипопротеинов могут быть представлены в виде соотношения аполипопротеина Е к аполипопротеину В или отношением аполипопротеина A-I к аполипопротеину В. Вещество по примеру 1 положительно влияет на параметры липидов плазмы, включая общий холестерин, холестерин в липопротеинах и триглицериды (фиг.2). Общий холестерин плазмы несколько снижается дозой гемфиброзила в 100 мг/кг и в зависимости от дозы повышается соединением по примеру 1. Этот эффект основан главным образом на повышении уровня холестерина в комплексе с липопротеином высокой плотности. Оба исследуемых соединения (гемфиброзил и вещество по примеру 1) снижают уровень холестерина в комплексе с липопротеином очень низкой плотности и с липопротеином низкой плотности. Эти эффекты могут быть оценены как отношение уровня холестерина в липопротеине высокой плотности к сумме холестерина в липопротеине очень низкой плотности и липопротеине низкой плотности. В соответствии с этим 100 мг гемфиброзила повышали это соотношение до того же уровня, что и 10 мг вещества по примеру 1 (до двухкратной величины), тогда как более высокие дозы (30-100 мг) вещества по примеру 1 еще более повышали это соотношение, доводя его до восьми-девятикратного превышения в самой высокой из исследованных концентраций. И гемфиброзил, и вещество по примеру 1 снижали уровень триглицеридов в плазме.

Высокоэффективная гель-хроматография использовалась для характеризации распределения холестерина в липопротеинах в организме крыс (фиг.3) и использовавшихся в опытах обезьян после введения соединения по примеру 1 (фиг.4). На фиг. 3 показано распределение холестерина в липопротеинах у крыс (в группе из восьми животных), получающих в течение одной или двух недель только носитель лекарственного средства, 100 мг/кг в день гемфиброзила или 1, 3, 10, 30 или 100 мг/кг в день вещества по примеру 1. Каждая кривая распределения относится к одной крысе. Все кривые изображены в одном масштабе и для сравнения в начале каждой группы кривых изображено распределение липопротеинов с холестерином у первой крысы из контрольной группы (затемненный профиль). Распределение в группе, получавшей 100 мг/кг в день гемфиброзила, похоже на то, которое получено с веществом по примеру 1 в дозе 3 и 10 мг/кг в день. В результате введения доз вещества по примеру 1 влияние на холестерин в липопротеинах значительно более благоприятно; сюда входит как уменьшение содержания холестерина в липопротеине очень низкой плотности и в липопротеине низкой плотности, так и увеличение содержания холестерина в липопротеине высокой плотности.

Высокоэффективная гель-хроматография использовалась также для получения полной картины распределения холестерина в липопротеинах в опытах на трех макаках-самцах до начала эксперимента, во время эксперимента и после окончания введения животным соединения по примеру 1. Обезьяны были отобраны таким образом, чтобы каждая из них представляла животных с низкими, со средними и с высокими значениями отношения уровня холестерина в липопротеинах низкой плотности к уровню холестерина в липопротеинах высокой плотности. Три базовых кривых, полученных на каждой из обезьян, были в основном идентичны и в связи с этим они были объединены и усреднены для того, чтобы получить представительное базовое распределение. Введение вещества по примеру 1 в дозе 3 мг/кг в день в течение одной недели не влияло на характер распределения, тогда как введение 10 мг/кг в день вещества по примеру 1 в течение второй недели и 30 мг/кг в день в течение третьей недели приводило к прогрессирующему снижению уровня холестерина в липопротеинах очень низкой плотности, в липопротеинах низкой плотности и в липопротеинах высокой плотности. Возвращение этих показателей к уровню в контрольной группе началось у двух из трех обезьян после продолжавшегося в течение одной недели периода вымывания.

У приматов комплексу липопротеина (а) с холестерином соответствует плечо на спуске пика липопротеинов низкой плотности. С интенсификацией лекарственного воздействия пик липопротеинов низкой плотности становится более симметричным, что вероятнее всего связано с уменьшением содержания липопротеина (а). В связи с этим проводилось непосредственное измерение уровня липопротеина (а) по методике ELISA (фиг.5). Прямое количественное измерение уровня липопротеина (а) показывает его снижение, зависящее от дозы препарата. Это снижение уровня достигало 62%, 83% и 89% (в среднем 78±8%) при дозе вещества по примеру 1 по 30 мг/кг в день, независимо от исходного уровня у трех подопытных обезьян (фиг.5). После вымывания активного вещества в течение одной недели липопротеин (а) приближается к уровню до начала введения или даже превышает его.

В отличие от крыс, у которых содержание липопротеина высокой плотности заметно возрастает в результате введения вещества по примеру 1, у макак это вещество вызывало снижение уровня комплекса холестерина с липопротеином высокой плотности. Снижение уровня липопротеина высокой плотности у макак может быть отражением высокого уровня транспортного белка для сложных эфиров холестерина у этого вида. В плазме крыс активность этого белка низка или даже не обнаруживается совсем. Поэтому высокие уровни транспортного белка для сложных эфиров холестерина повышают скорость переноса холестерина с липопротеином высокой плотности на прекурсоры - липопротеины очень низкой плотности и липопротеины низкой плотности, а это и приводит к снижению уровня холестерина в липротеинах высокой плотности. Анализ уровня активности траспортного белка для сложных эфиров холестерина у кроликов и у различных приматов показывает, что уровни транспортного белка для сложных эфиров холестерина в плазме макак значительно выше (в десять-двенадцать раз), чем у людей (фиг. 6). Поэтому ожидаемым результатом введения в человеческий организм соответствующих изобретению соединений станет снижение уровня холестерина в липопротеине очень низкой плотности, в липопротеине низкой плотности и в липопротеине (а) с повышением уровня холестерина в липопротеине высокой плотности.

Фиг. 1 - 6 показывают результаты биологической оценки соответствующих изобретению соединений. Приведенные в них данные относятся к предпочтительному соединению по примеру 1. На фиг. 1 показано строение предпочтительного соединения по примеру 1, получившего обозначение "PD 72953" и это обозначение, использованное на некоторых других рисунках, относится к соединению по примеру 1. Вещество сравнения представляет собой гемфиброзил, обозначаемый на некоторых рисунках шифром "С1-719".

Фиг. 2 демонстрирует эффективность соединения по примеру 1 в результате его введения получающим стандартный корм крысам. Самцам крыс линии Спраг-Доули ежедневно в течение семи дней во время от шести до девяти часов утра вводят перорально лишенную активного вещества основу из карбоксиметилцеллюлозы с твином, гемфиброзил или вещество по примеру 1 в указанных концентрациях. В одном из экспериментов участвовали восемь крыс в контрольной группе, восемь крыс в группе, получающей гемфиброзил, и по восемь крыс в каждой из групп, получающих 1, 3, 10, 30 и 100 мг/кг в день вещества по примеру 1; продолжительность этого эксперимента составляла 14 дней. Животные имели свободный доступ к пище и к воде. Примерно через 12 часов после последнего введения последней дозы животных усыпляют в атмосфере эфира. Уровень всего холестерина и триглицеридов измеряют ферментативным способом. Распределение липопротеинов определяют с помощью высокоэффективной гель-хроматографии. Данные замеров уровня всего холестерина и площади пиков на полученной хроматограмме (см., например, фиг. 3) используют для определения холестерина в отдельных фракциях липопротеинов. Аполипопротеины A-I и Е определяют методом иммунного электрофореза. Аполипопротеин В определяют иммунотурбидиметрическим методом. В эксперименте, продолжавшемся 14 дней, активность гепатической карнитин-ацил-трансферазы определяют по показателю активности пероксисомального фермента. Эта методология описана Краузе и др., Pharmacol. Res., 29:345-357 (1994). Полученные данные показывают, что вещество по примеру 1 вызывает зависящее от дозы повышение этого вида ферментной активности и эта активация сравнима с той, которая наблюдалась с гемфиброзилом в дозе 100 мг/кг в день. Приведенные данные представляют собой усредненные значения со статистически достоверной ± ошибкой, полученные в девяти раздельно проведенных экспериментах с учетом данных по контрольной группе.

Эксперимент на крысах проводился так, как это указано выше для фиг. 2. Плазму анализировали с помощью высокоэффективной гель-хроматографии для определения распределения холестерина между липопротеинами. Все кривые распределения для каждой группы из восьми крыс сведены к одной шкале внутри группы и между группами. Для сравнения приводится кривая распределения у первой крысы из контрольной группы, которая накладывается на данные по каждой получавшей активное вещество группе из восьми крыс.

Высокоэффективная гель-хроматография использовалась для анализа распределения холестерина в липопротеинах в 10 мкл плазмы от трех макак (обезьяны 90-98, 90-122, 90-182) до введения вещества по примеру 1, во время введения и в течение следовавшей за этим недели вымывания активного вещества. Во время недельного периода с введением увеличивающейся дозы вещество по примеру 1 в указанных дозах вводили обезьянам перорально каждый день натощак с пяти до шести часов утра. Образцы крови отбирали по указанным датам до введения активного вещества и до кормления. Корм животных состоял из 20 стандартных кормовых бисквитов для обезьян, 12 виноградин и одного банана каждый день. Кривые распределения для трех базовых образцов от каждой обезьяны были в основном идентичны и в связи с этим три кривые для каждой из обезьян были объединены и усреднены для того, чтобы получить представительное распределение. Здесь следует отметить, что пик липопротеина низкой плотности уменьшился и стал более симметричным, чем это было до введения активного вещества, что предполагает снижение уровня липопротеина (а).

Липопротеин (а) определяют с помощью имеющегося в продаже аналитического набора ELISA. Образцы плазмы от каждого отбора крови делят на аликвоты небольшого объема (100 мкл) и замораживают при -70^oС. Липопротеин (а) во всех образцах плазмы определяют в ходе одного эксперимента. Приведенные на фиг.5 данные представляют собой абсолютные (верхняя часть рисунка) и сравнительные по отношению к базовому (нижняя часть рисунка) значения уровней липопротеина (а) для тех же трех обезьян, что и на фиг. 4.

Активность транспортного белка для сложных эфиров холестерина, показанная на фиг. 6, проверялась на разных видах приматов, а также на кроликах, получавших стандартное и обогащенное холестерином питание. Активность транспортного белка для сложных эфиров холестерина определялась на цельной плазме по скорости переноса синтетического флуоресцирующего аналога сложного эфира холестерина в виде микроэмульсии по методу Бисгайера и др., Lipid Res. 34:1625-1634 (1993).

Для сравнения относительной эффективности соединения по примеру 1 с другими соответствующими изобретению соединениями был проведен продолжавшийся в течение одной недели эксперимент на крысах, получавших стандартный корм. Самцы крыс линии Спраг-Доули получали через рот носитель активного вещества с карбоксиметилцеллюлозой и Твином или же носитель с приведенными на фиг. 7 соответствующими изобретению соединениями в дозе 30 мг/кг в день (их структуры сведены в таблицу) во время от шести до девяти часов утра в течение семи дней. Животные имели свободный доступ к пище и к воде. Примерно через 12 часов после последнего введения последней дозы вещества животных усыпляют в атмосфере эфира. Уровень триглицеридов в плазме, общего холестерина в плазме, распределение холестерина в липопротеинах и аполипопротеинах измеряют приведенными ранее способами.

Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 7. Рисунок показывает, что предпочтительное соединение по примеру 1 резко снижает уровень триглицеридов и холестерина в липопротеинах очень низкой плотности и повышает уровень холестерина в липопротеинах высокой плотности.

Было также показано, что диалкиловые простые эфиры повышают чувствительность к инсулину и могут как таковые быть полезными для повышения степени использования глюкозы диабетическими животными, то есть с их помощью можно лечить диабет, особенно не зависящий от инсулина сахарный диабет. Соответствующие изобретению соединения были исследованы в стандартном эксперименте на 3T3-L1 адипоцитах, которые дают ярко выраженный отклик на инсулин, то есть потребление сахара этими клетками может быть в короткие сроки повышено инсулином в 15-20 раз. Использованная для эксперимента методология более подробно описана Фростом и др., J. Biol. Chem., 260:2646-2652 (1985).

Специально для этого от Американской коллекции типовых культур (АТСС, Роквилл, МД) были получены клетки фибробласта 3T3-L1. Клетки выращивались до образования агрегатов и дифференцировались в адипоциты. В день начала эксперимента клеточные конгломераты обрабатывали инсулином (167 мм), дексаметазоном (0,25 мкмоль/л) и изобутилметилксантином (0,5 ммоль/л) в 10%-ной фетальной сыворотке крупного рогатого скота, содержащей модифицированную Дульбекко среду Игла. Двумя днями позже культуральную жидкость меняли на модифицированную Дульбекко среду Игла, содержащую 167 нм инсулина и 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Затем клетки перевели на 10%-ную модифицированную Дульбекко среду Игла и меняли ее каждый день до окончания выращивания клеток. Солюбилизированные в диметилсульфоксиде исследуемые соединения вводили в культуральную жидкость с начала эксперимента и восполняли их после каждой смены среды. Дифференциация оценивалась визуально по наблюдениям за накоплением жировых капелек в клетках. Транспорт глюкозы измерялся количественно по ассимиляции [¹⁴С] деоксиглюкозы в дифференцированных клетках на девятый день в соответствии с методологией, описанной в работе Сандук и др., Endocrinology, 133:352-359 (1993).

Фиг. 8 показывает результаты проверки представляющих изобретение соединений на клетках. Транспорт глюкозы оценивался на базовом уровне, определяемом по эффекту, вызываемому переносчиком глюкозы Глут 1 (Glut 1) на выращенных таким образом адипоцитах. В качестве вещества сравнения использовался троглитазон - соединение, которое прошло клиническую проверку на людях и животных как агент, интенсифицирующий ассимиляцию глюкозы (троглитазон подробно описан в примере 2 патента США 4572912). Вещество сравнения в концентрации 5 мкмоль/л вызывало возрастание транспорта глюкозы в эти клетки на 70%. Такая активность троглитазона не была неожиданной, так как он сенсибилизирует клетки по отношению к инсулину. Из прошедших проверку соединений в рамках данного изобретения заметное повышение активности транспорта глюкозы показали соединения по примеру 1 и по примеру 2: соединение по примеру 2 вызывало двукратную стимуляцию. Соответствующие изобретению соединения изучались в концентрации 100 мкмоль/л.

Из приведенных выше данных следует, что простые диалкиловые эфиры формулы (I) эффективны как средства для снижения уровня липопротеина (а), триглицеридов, аполипопротеина (В), комплекса холестерина с липопротеинами очень низкой плотности и холестерина с липопротеинами низкой плотности. Эти соединения повышали также уровень аполипопротеина А-I, аполипопротеина Е, комплекса холестерина с липопротеином высокой плотности и отношение уровня липопротеина высокой плотности к суммарному уровню липопротеинов очень низкой плотности и липопротеинов низкой плотности. Как таковые эти соединения могут использоваться для лечения и профилактики заболеваний сосудов и инсулинонезависимого сахарного диабета. Объектом изобретения является также способ лечения и профилактики заболеваний сосудов и диабета, заключающийся во введении млекопитающим при необходимости лечения эффективного количества вещества формулы I. "Эффективное количество" - это доза, необходимая для лечения или профилактики заболеваний сосудов или диабета у млекопитающих. В норме соединения вводятся в дозе от примерно 50 до примерно 5000 мг в день, обычно это от примерно 50 до примерно 2000 мг в день. Рекомендуемое обычно правило приема - это дозы от примерно 50 до примерно 300 мг, принимаемые от одного до четырех раз в день. Эти уровни дозировки применяются как для лечения и профилактики заболеваний сосудов, так и для направленного снижения в плазме уровней липопротеина (а) и повышения в плазме уровня холестерина в липопротеине высокой плотности, а также для лечения и профилактики диабета.

Соединения согласно изобретению относятся к категории нетоксичных веществ (в дозах до 1000 мг/кг).

Предлагаемая фармацевтическая композиция может представлять собой любую стандартную лекарственную форму как для перорального, так и для парентерального введения, причем предпочтение отдается введению через рот. Обычно используемыми фармацевтическими носителями и эксципиентами, применяемыми в лекарственных формах для приема через рот, являются лактоза, сахароза, крахмалы, такие как кукурузный или картофельный крахмал, такие производные целлюлозы, как метил- и этилцеллюлоза, желатины, тальк, масла, например растительные масла, кунжутное масло, хлопковое масло, а также гликоли, например полиэтиленгликоль. Предназначенные для перорального введения лекарственные формы выпускаются обычно в виде таблеток, капсул, эмульсий, растворов и им подобных. Могут быть использованы и лекарственные формы с контролируемым высвобождением препарата, например, за счет применения полимерной матрицы или осмотического насоса и им подобные. Обычные лекарственные формы содержат от примерно 5% до примерно 95% массы диалкилового простого эфира, принимаемого с эксципиентом или с носителем. В их состав могут быть введены ароматические добавки, такие как аромат вишни или аромат апельсина.

Для парентерального введения может быть приготовлена лекарственная форма с таким разбавителем, как изотонический раствор соли, 5%-ная водная глюкоза и им подобные. Введение может осуществляться как внутримышечно, так и внутривенно. На основе этих соединений может быть приготовлена и лекарственная форма в виде суппозиториев с восками или с гелями. Эти соединения могут с успехом применяться и для трансдермального введения в виде пластырей вместе с облегчающими их транспорт через кожу веществами и аналогичными добавками. Следующие далее примеры служат более подробной иллюстрацией типичных лекарственных форм, предусматриваемых данным изобретением.

Пример 10
Ингредиент - Количество
2,2-диметил-6-(3-метил-3-гидроксикарбонилбутилокси)-гексановая кислота - 1000 г
Лактоза - 960 г
Стеарат магния - 40 г
Ингредиенты смешивают до образования однородной массы и заполняют ею капсулы из жесткого желатина 4. Каждую капсулу заполняют приготовленной смесью в количестве 200 мг, что соответствует 100 мг активного простого диалкилового эфира. Капсулы предназначены для приема взрослыми с частотой от одного до трех раз в день для снижения уровня липопротеина (а) в плазме.

Пример 11
Ингредиент - Количество
2,2-диметил-6-(6-метил-6-этоксикарбонилгептилокси)-гексановая кислота - 3000 г
Лактоза - 750 г
Кукурузный крахмал - 300 г
Желатин - 120 г
Вода - 1000 мл
Стеарат магния - 20 г
Диалкиловый простой эфир, лактозу и 150 г кукурузного крахмала смешивают с раствором желатина в воде. Влажные гранулы просеивают, сушат и снова просеивают. Высушенные гранулы смешивают со стеаратом магния и остальным кукурузным крахмалом и прессуют из смеси таблетки массой 698 мг на стандартных матрице и пуансоне с вогнутыми поверхностями размером 15/32 дюйма. Каждая таблетка содержит 500 мг простого диалкилового эфира.

Пример 12
Ингредиент - Количество
6,6'-окси-бис-(2,2-диметилгексановая кислота) - 4,0 г
Моностеарат полиоксиэтилированного сорбитана - 0,1 мл
Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы - 0,3 г
Комплексный силикат магния и алюминия - 0,5 г
Сахар - 10,0 г
Глицерин - 2,0 мл
Бензоат натрия - 0,5 г
Цитрат натрия - 0,2 г
Разрешенный фармакопеей красный краситель - 1 мг
Аромат вишни - 0,02 мл
Дистиллированная вода до - 100 мл
Моностеарат полиоксиэтилированного сорбитана может быть представлен таким продуктом, как полисорбат 60 или Твин 60. Комплексный силикат магния и алюминия предназначен для образования геля, здесь можно использовать продукцию фирмы Veegum H.V. Это вещество гидратируют в течение ночи в 10 мл дистиллированной воды. Приготавливают смесь из моностеарата полиоксиэтилированного сорбитана, имитатора аромата вишни, 30 мл дистиллированной воды и простого диалкилового эфира и пропускают ее через гомогенизатор. При интенсивном перемешивании добавляют сахар, глицерин, цитрат натрия, бензоат натрия и натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, после этого прибавляют гидратированный комплексный силикат магния и алюминия и раствор красного красителя в 2 мл воды. Образующуюся суспензию гомогенизируют, с помощью лимонной кислоты устанавливают в ней рН 5,0 и разбавляют дистиллированной водой до конечного объема 100 мл. Предназначенная для перорального приема доза объемом 5 мл этой суспензии содержит 200 мг диалкилового простого эфира. При желании из состава смеси можно исключить красный краситель и имитатор аромата вишни или заменить их другими ароматическими и цветовыми добавками.

Формула изобретения

1. Производные простого диалкилового эфира общей формулы (I)

где n и m независимо друг от друга означают целые числа 2-6;
R¹, R², R³ и R⁴ независимо друг от друга означают алкил с числом атомов углерода от одного до шести;
Y¹ и Y² независимо друг от друга означают карбоксильную группу или группу COOR⁵, где R⁵ означает алкил с числом атомов углерода от одного до шести.

2. Производные простого диалкилового эфира общей формулы (I) по п.1, у которых каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает алкил с числом атомов углерода от одного до шести.

3. Производные простого диалкилового эфира общей формулы (I) по п.1, у которых каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает одинаковые алкильные группы и оба радикала Y¹ и Y² означают карбоксильную группу.

4. Производные простого диалкилового эфира по п.3, у которых каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает метильную группу.

5. Производные простого диалкилового эфира по п.4, у которых m и n означают одно и то же целое число.

6. Производные простого диалкилового эфира по п.5, у которых m и n оба означают число 4.

7. Производные простого диалкилового эфира по п.6, представляющие собой 6,6'-окси-бис-(2,2-диметил-гексановую кислоту).

8. Производные простого диалкилового эфира по п.5, у которых m и n оба выбираются из ряда 2, 3 или 5.

9. Производные простого диалкилового эфира по п.8, представляющие собой 4,4'-окси-бис-(2,2-диметилбутановую кислоту), 5,5'-окси-бис-(2,2-диметилпентановую кислоту) или 7,7'-окси-бис-(2,2-диметилгептановую кислоту).

10. Производные простого диалкилового эфира по п.5, у которых оба радикала Y¹ и Y² означают группу COOR⁵.

11. Производные простого диалкилового эфира по п.10, у которых R⁵ означает метил.

12. Производные простого диалкилового эфира по п.11, представляющие собой метиловый эфир 2,2-диметил-8-(7-метил-7-метоксикарбонилоктилокси)-октановой кислоты.

13. Производные простого диалкилового эфира по п.10, у которых R⁵ означает этил.

14. Производные простого диалкилового эфира по п.13, представляющие собой этиловый эфир 2,2-диметил-5-(4-метил-4-этоксикарбонилпентилокси)-пентановой кислоты или этиловый эфир 2,2-диметил-6-(5-метил-5-этоксикарбонилгексилокси)-гексановой кислоты.

15. Фармацевтическая композиция, проявляющая активность в отношении снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности и в отношении повышения в плазме уровня аполипопротеина А-I или Е, комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности, отличающаяся тем, что она включает активное вещество общей формулы (I)

где n и m независимо друг от друга означают целые числа 2-6;
R¹, R², R³ и R⁴ независимо друг от друга означают алкил с числом атомов углерода от одного до шести,
Y¹ и Y² независимо друг от друга означают карбоксильную группу или группу COOR⁵, где R⁵ означает алкил с числом атомов углерода от одного до шести,
в эффективном количестве, а также фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что включает активное вещество, у которого каждый из радикалов R¹, R², R³ и R⁴ означает метильную группу.

17. Фармацевтическая композиция по п.16, отличающаяся тем, что включает активное вещество, у которого n и m оба означают одно и то же число.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что включает активное вещество, у которого n и m оба означают число 4.

19. Фармацевтическая композиция по п.17, отличающаяся тем, что включает 6,6'-окси-бис-(2,2-диметилгексановую кислоту) в качестве активного вещества.

20. Способ снижения в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, отличающийся тем, что вводят активное вещество общей формулы (I) по п.1 в эффективном количестве.

21. Способ профилактики или лечения заболеваний сосудов, связанных со снижением в плазме уровня липопротеина (а), аполипопротеина В, триглицеридов, комплекса холестерина с липопротеинами низкой или очень низкой плотности, а также с повышением в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I или Е, отличающийся тем, что вводят активное вещество общей формулы (I) по п.1 в эффективном количестве.

22. Способ повышения в плазме уровня комплекса холестерина с липопротеинами высокой плотности или аполипопротеина А-I или Е, отличающийся тем, что вводят активное вещество общей формулы (I) по п.1 в эффективном количестве.

23. Способ профилактики или лечения инсулинонезависимого сахарного диабета путем введения активного вещества, отличающийся тем, что в качестве активного вещества вводят соединения по п.1 в эффективном количестве.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40