Способы усиления и ограничения экспрессии генов

 

Изобретение относится к генной терапии и касается усиления и ограничения экспрессии генов. Сущность изобретения включает набор векторов для поддерживаемой и регулируемой экспрессии, которые содержат терапевтические генные продукты, экспрессия которых осуществляется с помощью индуцибельных промоторов, а также способ достижения локализованной временной экспрессии под контролем индуцируемого теплом промотора. Также изобретение включает новые векторы для генотерапевтического лечения локального и метастазирующего рака молочной железы, яичника и предстательной железы. Преимущество изобретения заключается в создании новых векторов, с помощью которых экспрессия гена в клетках-мишенях усиливается и пролонгируется с помощью промоторов, индуцируемых теплом. 7 с. и 11 з.п.ф-лы, 10 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).

Формула изобретения

1. Рекомбинантный вектор pDATH-Х (плазмида с промотором теплового шока, контролируемым доминантно-негативной, антисмысловой TET-ON), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую TET-ON, экспрессируемую под контролем промотора теплового шока и tet-оператора, причем указанная TET-ON состоит из химеры последовательностей, кодирующих аминокислоты 1-207 тетрациклинового репрессора и последние С-концевые 130 аминокислот домена активации транскрипции белка VP16 вируса простого герпеса, причем указанный промотор теплового шока состоит из элементов реагирования на тепловой шок (от -260 до 30) промотора гена белка теплового шока 70-кД человека, соединенный с минимальным цитомегаловирусным промотором (pCMV), причем указанный tet-оператор состоит из 19-нуклеотидных инвертированных повторов оператора 02 TN10, с которым связаны tet-репрессор и TET-ON; (b) 2-ю кассету, включающую сайт клонирования терапевтического гена, расположенного ниже промотора tetp-CMV, состоящего из tet-оператора, соединенного с минимальным цитомегаловирусным промотором (pCMV), причем указанный tet-оператор состоит из 19-нуклеотидных инвертированных повторов оператора 02 TN10, с которым связаны tet-репрессор и TET-ON; (c) 3-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON под контролем промотора pCMV, причем указанная антисмысловая TET-ON состоит из антисмысловой последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности TET-ON, включая старт-кодон ATG; (d) 4-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON под контролем промотора pCMV, причем указанная доминантно-негативная TET-ON состоит из tet-репрессора без домена трансактивации VP16.

2. Способ достижения локализованной временной экспрессии гена под контролем индуцируемого теплом промотора, включающий стадии - встраивания указанного гена в сайт клонирования вектора pDATH-X по п.1; внесения вектора, включающего указанный ген, в организм-хозяин; приложения тепловой энергии к местоположению на указанном организме-хозяине, где желательна экспрессия указанного гена.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанным организмом-хозяином является человек.

4. Рекомбинантный вектор pDATE-X (экспрессирующая плазмида с промотором EGR, контролируемым доминантно-негативной, антисмысловой TET-ON), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую последовательность TET-ON под контролем EGRp, сайт связывания тетрациклинового оператора и pCMV; (b) 2-ю кассету, включающую терапевтический ген Х под контролем промотора tetp-pCMV; (c) 3-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON под контролем промотора pCMV; (d) 4-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON под контролем промотора pCMV.

5. Рекомбинантный экспрессирующий вектор pRIBs-X (индуцируемый облучением промотор, специфичный для молочной железы), причем указанный вектор включает: (а) 1-ю кассету, включающую “Gal-DBD-mx”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой (аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4 (Gal-DBD), химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40, причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого облучением промотора Еgr-1; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV, “антисмысловую Gal-DBD-mx”, которая является антисмысловой конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, внутренний сайт вхождения рибосомы (IRES) и “Gal-DBD”, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (c) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной ORF, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4 (аминокислоты 1-147), с последующими сигналом ядерной локализации большого Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора с-еrbВ2 “реrВ2” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую “Galp”, пять копий 17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-pTET, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через IRES; (e) 5-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности TET-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV; (f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующих последовательностей для аминокислот 1-207.

6. Рекомбинантный вектор по п.5, отличающийся тем, что промотор perbB2 в 3-й кассете заменен на промотор сывороточного кислого белка.

7. Рекомбинантный вектор по п.5, отличающийся тем, что промотор perbB2 в 3-й кассете заменен на промотор стромелизина-3.

8. Рекомбинантный вектор по п.5, отличающийся тем, что указанный ген Х является геном, кодирующим фактор некроза опухоли альфа.

9. Рекомбинантный экспрепрессирующий вектор pRIPs-X (индуцируемый облучением промотор, специфичный для предстательной железы), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую “Gal-DBD-mx”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой (аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4, химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40, причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого облучением промотора Egr-1; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV, антисмысловую Gal-DBD-mx, которая является антисмысловой конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, IRES, которая является внутренним сайтом вхождения рибосомы, и Gal-DBD, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (c) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4, с последующими сигналом ядерной локализации большого Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора гена пробазина “pProbasin” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую GALp, пять копий 17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-ptet, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через внутренний сайт вхождения рибосомы; (e) 5-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности ТЕТ-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV; (f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующей последовательности для аминокислот 1-207.

10. Рекомбинантный вектор по п.9, отличающийся тем, что указанный промотор пробазина в 3-й кассете заменен на промотор антигена, специфичного для предстательной железы.

11. Рекомбинантный вектор по п.9, отличающийся тем, что указанный ген Х является геном фактора-α некроза опухоли.

12. Рекомбинантный экспрессирующий вектор pHIBs-X (индуцируемый теплом промотор, специфичный для молочной железы), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую Gal-DBD-mx, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой (аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4, химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40, причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого теплом промотора белка теплового шока; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV, антисмысловую Gal-DBD-mx, являющуюся конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, внутренний сайт вхождения рибосомы и Gal-DBD, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (c) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4, с последующими сигналом ядерной локализации большого Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора гена с-еrbВ2 “реrВ2” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую GALp, пять копий 17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-ptet, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через внутренний сайт вхождения рибосомы; (e) 5-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности TET-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV; (f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующих последовательностей для аминокислот 1-207.

13. Рекомбинантный вектор по п.12, отличающийся тем, что промотор реrbВ2 в 3-й кассете заменен на промотор сывороточного кислого белка.

14. Рекомбинантный вектор по п.12, отличающийся тем, что промотор реrbВ2 в 3-й кассете заменен на промотор стромелизина-3.

15. Рекомбинантный вектор по п.12, отличающийся тем, что указанный терапевтический ген Х является геном фактора-α некроза опухоли.

16. Рекомбинантный экспрессирующий вектор pHIPs-X (индуцируемый теплом промотор, специфичный для предстательной железы), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую Gal-DBD-mx, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой (аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4, химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40, причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого теплом промотора белка теплового шока; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV (mCMVp), антисмысловую Gal-DBD-mx, являющуюся конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, внутренний сайт вхождения рибосомы и Gal-DBD, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (с) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4, с последующими сигналом ядерной локализации большого Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора гена пробазина “pProbasin” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую GALp, пять копий 17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-ptet, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через внутренний сайт вхождения рибосомы; (e) 5-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности TET-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV; (f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующих последовательностей для аминокислот 1-207.

17. Рекомбинантный вектор по п.16, отличающийся тем, что промотор пробазина заменен на промотор антигена, специфичного для предстательной железы.

18. Рекомбинантный вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный терапевтический ген Х является геном фактора-α некроза опухолей.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64