Обнаружение имеющей отношение к заболеванию нуклеиновой кислоты

 

Изобретение относится к области медицинской генетики. Сущность изобретения состоит в способах получения информации о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к заболеванию, которое, в частности, может быть вызвано патогенным микроорганизмом, присутствующим в организме этого субъекта. Настоящее изобретение относится также к подложкам с иммобилизованными зондами, предназначенными для использования в указанных способах. В частности, настоящее изобретение относится к способам и подложкам с иммобилизованными зондами, предназначенным для получения информации о восприимчивости субъекта к лечению заболевания, вызванного патогенными микроорганизмами. Технический результат - расширение арсенала средств генной терапии. 6 с. и 27 з.п.ф-лы, 3 табл., 3 ил.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способам получения информации о имеющей отношение к заболеванию нуклеиновой кислоте, выделяемой из организма субъекта. Данное изобретение относится к способам получения информации о нуклеиновой кислоте субъекта, в том числе о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к заболеванию, и нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, вызывающего данное заболевание. Настоящее изобретение относится также к подложкам с иммобилизованными зондами, в частности к чипам с иммобилизованными зондами, предназначенным для использования при осуществлении указанных способов.

Предпосылки изобретения

Способы обнаружения генов при помощи ДНК-чипа описаны в публикациях Beattie et al., Clin. Chem. 39:719-22, Fodor et al., Science, 251, 767 (1991), Khrapko et al., FEBS Lett., 256, 118 (1989) и Southern et al., Nucleic Acids Res., 22, 1368 (1994). ДНК-чип представляет собой стеклянную или силиконовую подложку площадью в несколько квадратных сантиметров, на которой находится несколько иммобилизованных ДНК-зондов с разными последовательностями. ДНК-зонды, иммобилизованные на таком чипе, подвергают взаимодействию с испытуемой нуклеиновой кислотой, меченной таким маркером, как флуоресцентный пигмент или радиоизотоп (RI), или смесью немеченой испытуемой нуклеиновой кислоты и меченого олигонуклеотида. При наличии в пробе последовательности, комплементарной ДНК-зонду, иммобилизованному на чипе, метка, присоединенная к определенному месту на чипе, подает сигнал. Поэтому, если заранее известна последовательность и положение иммобилизованного ДНК-зонда, можно идентифицировать последовательность оснований, имеющуюся в испытуемой нуклеиновой кислоте (Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5022 (1994), Parinov et al., Nucleic Acids Res., 24, 2998 (1996).

Таким образом, взяв у субъекта пробу крови и экстрагировав из нее нуклеиновую кислоту, можно получить нуклеиновую кислоту, присущую данному субъекту. Если нуклеиновую кислоту, присущую указанному субъекту, далее подвергнуть генному анализу, можно получить информацию о конституционной предрасположенности данного субъекта, в частности о его подверженности какому-либо заболеванию, об эффективности лекарственного средства и/или возможных побочных эффектах. На основании полученных данных можно разработать схему лечения, специально предназначенную для данного субъекта. Схема лечения, учитывающая особенности конкретного субъекта, получила название "специализированной медицинской помощи".

В настоящее время по-прежнему существует необходимость в более точных и простых методах определения схемы медицинского лечения на основе пробы, взятой у пациента.

Все ссылки и публикации патентов, приведенные в данном описании изобретения, полностью включены в него в качестве ссылки.

Описание изобретения

Способ получения первичной информации о нуклеиновой кислоте отдельного субъекта, подверженного конкретному заболеванию, и вторичной информации о нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, присутствующего в организме указанного субъекта и вызывающего конкретное заболевание, заключается в том, что:

(a) экстракт нуклеиновой кислоты субъекта подвергают взаимодействию с зондами, иммобилизованными на подложке, содержащей первый и второй зонды, причем первый зонд предназначен для обнаружения последовательности специфической нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма, вызывающего конкретное заболевание, и второй зонд предназначен для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты указанного субъекта; и

(b) в результате выполнения реакции, описанной в пункте (а), получают первичную информацию о наличии нуклеиновой кислоты, связанной с первым зондом, если таковая имеется, и вторичную информацию о наличии нуклеиновой кислоты, связанной со вторым зондом, если таковая имеется.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 дано схематическое изображение ДНК-чипа по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.2 дано схематическое изображение ПНК-чипа по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.3 показана блок-схема способа по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения информации о нуклеиновой кислоте отдельного субъекта, подверженного какому-либо заболеванию. Субъект может находиться на ранней или поздней стадии данного заболевания. Кроме того, субъект уже может быть болен указанным заболеванием или может заболеть им в будущем.

Настоящее изобретение относится к корреляции информации о нуклеиновой кислоте субъекта и патогенного микроорганизма. В описываемых вариантах осуществления изобретения субъект подвержен заболеванию, вызываемому патогенным микроорганизмом, таким как, например, вирус, бактерия, дрожжи или микоплазма, в связи с этим настоящее изобретение относится к корреляции информации о нуклеиновой кислоте, выделенной из патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта, и информации о нуклеиновой кислоте, выделенной из организма субъекта.

Таким образом, одной целью настоящего изобретения являются способы получения информации о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к конкретному заболеванию субъекта, и, в частности, о нуклеиновой кислоте, которая определяет восприимчивость к лечению данного заболевания, а также информации о нуклеиновой кислоте, имеющей отношение к конкретному заболеванию, которую выделяют из патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта. Настоящее изобретение относится также к специфическим НК-зондам, используемым для идентификации нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта и патогенного микроорганизма. В некоторых вариантах осуществления изобретения НК-зонды иммобилизованы на подложке, такой как чип. Настоящее изобретение относится также к подложкам с иммобилизованными зондами, в частности к чипам с иммобилизованными зондами, предназначенным для использования при осуществлении указанных способов. В настоящем изобретении можно также использовать другие подложки, такие как устройство для капиллярного электрофореза ДНК, некоторые типы гранул, мембранная матрица, микротитрационный планшет, электрод, некоторые типы полупроводниковых устройств, некоторые типы волноводных материалов, а также резонанс поверхностного плазмона (SPR), кварцевые микровесы (QCV) и масс-спектроскопию. Кроме того, при осуществлении настоящего изобретения можно также использовать аллельспецифическую олигогибридизацию, методы рестрикции (диагональный гель-электрофорез на микротитрационной матрице), методы лигирования (фильтрующий зонд, анализ методом лигирования олигонуклеотидов, лигирование меченных красителем олигонуклеотидов), введение нуклеотидов (минисеквенирование, анализ методом терминации с направленным окрашиванием матрицы) и анализ методом инвазии. Можно также использовать другие общие методы гибридизации в растворе, позволяющие обнаружить нуклеиновую кислоту субъекта и патогенного микроорганизма, такие как метод амплификации (полимераэная реакция синтеза цепи (PCR), лигазная реакция синтеза цепи (LCR), амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA), амплификация с замещением цепи (SDA), изотермическая амплификация в петле (LAMP), изотермическая и инициируемая химерной затравкой амплификация нуклеиновых кислот (ICAN), разветвленная ДНК).

Отбираемые у субъекта пробы, содержащие нуклеиновую кислоту, включают цельную кровь, кровь, сыворотку, лейкоциты, мочу, фекалии, сперму, слюну, биоптат, культивированные клетки и мокроту. Предпочтительной анализируемой пробой является кровь. Взятая проба предпочтительно содержит как нуклеиновую кислоту субъекта, то есть нуклеиновую кислоту, определяющую восприимчивость к лечению заболевания, так и нуклеиновую кислоту патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта и вызывающего данное заболевание. При необходимости взятую пробу можно подвергнуть предварительной обработке, такой как гомогенизация и экстракция. Тип предварительной обработки может быть выбран специалистом в данной области в зависимости от характера анализируемого материала.

В соответствии с одним описанным вариантом осуществления изобретения сначала у человека берут пробу цельной крови, которую используют для выделения нуклеиновой кислоты генома человека и вируса, присутствующего в организме человека, при помощи промышленно выпускаемого набора для экстракции генома человека, например набора средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp (торговое название фирмы QIAGEN, Токио, Япония). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения нуклеиновые кислоты, которые могут содержать последовательность-мишень, подвергают амплификации. Амплифицированный продукт анализируют путем гибридизации с чипом, содержащим иммобилизованные зонды, и затем выявляют нуклеиновую кислоту, которая связывается с чипом. Таким образом получают информацию о нуклеиновой кислоте субъекта, имеющей отношение к конкретному заболеванию, вместе с информацией о нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, присутствующего в организме субъекта и вызывающего данное заболевание.

В вышеописанном способе в качестве субъекта представлен человек. Однако человек не является единственным субъектом по данному изобретению. В соответствии с целью настоящего изобретения "субъектом" может быть любое позвоночное, включая млекопитающих, таких как приматы, в том числе человек, собаки, кошки, коровы, козы, свиньи, овцы и обезьяны. Среди них человек является наиболее приемлемым субъектом. Объектом настоящего изобретения может быть здоровый или страдающий каким-либо заболеванием субъект. Однако способы по настоящему изобретению в большей степени предназначены для обследования человека, страдающего заболеванием, вызываемым патогенным микроорганизмом, и для исследования типа последовательности специфической нуклеиновой кислоты субъекта. Термин "конкретное заболевание" в используемом здесь значении означает заболевания, вызываемые патогенными микроорганизмами, такими как, например, вирусы, бактерии, дрожжи или микоплазма, а также онкологические заболевания, причем указанный термин предпочтительно относится к заболеваниям, вызываемым патогенными микроорганизмами, и более предпочтительно к заболеваниям, возникновение которых и терапевтический эффект изменяются в зависимости от типа нуклеиновой кислоты субъекта, страдающего данным заболеванием, и/или экспрессии или отсутствия экспрессии гена, имеющего такую нуклеиновую кислоту. Однако список заболеваний не имеет каких-либо ограничений.

Термин "нуклеиновая кислота-мишень" в используемом здесь значении означает нуклеиновую кислоту, содержащую детектируемую и/или анализируемую последовательность.

В соответствии с целью настоящего изобретения в качестве экстрагированной нуклеиновой кислоты субъекта можно использовать любую нуклеиновую кислоту, выделенную из организма данного субъекта. В частности, такой нуклеиновой кислотой может быть ДНК, РНК и геномная ДНК. В качестве экстрагированной нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма можно использовать любую нуклеиновую кислоту, выделенную из патогенного микроорганизма-мишени, в частности ДНК или РНК.

Способ экстракции нуклеиновой кислоты из пробы не ограничивается вышеуказанными средствами. Можно выполнять экстракцию в системе жидкость - жидкость с использованием фенола-хлороформа, экстракцию в системе твердое тело - жидкость с использованием носителя и тому подобные. Альтернативно можно использовать промышленно производимый набор для экстракции нуклеиновой кислоты QIAamp (фирмы QIAGEN), набор для очистки геномной ДНК (фирмы Promega) или испытательный набор SMAI (фирмы Sumitomo Metal Co., Ltd), не ограничиваясь указанными наборами. Экстрагированная нуклеиновая кислота может быть подвергнута амплификации, например, методом PCR.

В том случае, когда экстрагированная нуклеиновая кислота представляет собой РНК, полученную РНК можно непосредственно использовать в качестве испытуемой нуклеиновой кислоты. Альтернативно в качестве испытуемой нуклеиновой кислоты можно использовать кДНК, полученную из РНК при помощи обратной транскриптазы. В этом случае можно использовать неразделенную смесь нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта, и нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма. В частности, указанные нуклеиновые кислоты экстрагируют при помощи набора средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp в соответствии с вышеуказанным способом, обрабатывают обратной транскриптазой и амплифицируют методом PCR.

В соответствии с целью настоящего изобретения амплификацию выполняют любым известным способом, используемым для амплификации нуклеиновой кислоты. Амплификацию предпочтительно осуществляют при помощи полимеразной реакции синтеза цепи (далее именуемой "PCR"). Амплификацию можно не выполнять, если проба содержит достаточное количество нуклеиновых кислот.

В соответствии с целью настоящего изобретения подложка с иммобилизованными зондами, такая как чип с иммобилизованными зондами, содержит первый и второй зонды, имеющие разные последовательности оснований и иммобилизованные на подложке. Первый зонд используют для обнаружения последовательности специфической нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, вызывающего конкретное заболевание. Второй зонд используют для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта.

Такая подложка с иммобилизованными зондами является особенно эффективной, так как на одной подложке можно одновременно анализировать нуклеиновые кислоты, выделенные из двух разных организмов, таких как субъект и патогенный микроорганизм. Такой чип с иммобилизованными зондами впервые описан авторами настоящего изобретения. Указанная подложка с иммобилизованными зондами является одним из объектов настоящего изобретения.

В чипе с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению первый зонд используют для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, имеющегося в пробе, такой как, например, проба цельной крови, взятая у человека. Указанный зонд имеет последовательность оснований, соответствующую хромосомной ДНК или гену (РНК), выделенным из патогенного микроорганизма, который может инфицировать организм-мишень (например, человека). Помимо этого, в качестве первого зонда можно использовать последовательность оснований, соответствующую кДНК, кРНК, фрагменту хромосомной ДНК, РНК, кДНК и кРНК или комплементарной последовательности каждого из указанных фрагментов.

Кроме того, при помощи первого зонда можно определить количество патогенного микроорганизма, содержащегося в пробе, то есть при помощи зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, фрагменту последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты или ее фрагменту.

Первый зонд предпочтительно используют не только для обнаружения патогенного микроорганизма, имеющегося в пробе, но и генной мутации патогенного микроорганизма.

При помощи первого зонда можно измерить количество нуклеиновой кислоты (РНК), экспрессируемой патогенным микроорганизмом в пробе, то есть при помощи зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, фрагменту последовательности нуклеиновой кислоты или комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты и ее фрагменту. В данном случае указанный зонд позволяет производить качественное и количественное определение РНК, кДНК или кРНК.

В соответствии с вариантом осуществления изобретения, в котором патогенный микроорганизм является вирусом, можно определить эффективность лекарственного средства, измеряя характер экспрессии (количество, качество), так как вирус экспрессирует большое количество специфического гена в период роста.

В соответствии с целью настоящего изобретения второй зонд на чипе с иммобилизованными зондами представляет собой последовательность оснований, соответствующую последовательности хромосомной ДНК или гену (РНК), выделенной из организма субъекта и имеющей отношение к какому-либо заболеванию. Помимо этого, в качестве второго зонда можно использовать последовательность оснований, соответствующую кДНК, кРНК, фрагменту последовательности хромосомной ДНК, РНК, кДНК и кРНК или комплементарной последовательности указанных фрагментов. Нуклеиновая кислота субъекта, "сопутствующая заболеванию", представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, присутствующую в хромосоме клетки субъекта и определяющую восприимчивость к лечению. В частности, указанная последовательность нуклеиновой кислоты определяет подверженность субъекта заболеванию, эффективность лекарственного средства и/или вероятность возникновения побочных эффектов.

Благодаря наличию второго зонда можно обнаружить последовательность специфической нуклеиновой кислоты, экспрессируемое количество специфического гена и характер экспрессии гена у субъекта.

Желательно, чтобы первый и второй зонды по настоящему изобретению имели последовательность, включающую по крайней мере 11 оснований, предпочтительно по крайней мере 12 оснований, более предпочтительно по крайней мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и даже 30 оснований. Если длина последовательности оснований, иммобилизуемой на подложке, является слишком большой, трудно распознать изменение одного основания. В отличие от этого, если последовательность оснований, иммобилизуемая на подложке, является слишком короткой, трудно определить данную последовательность оснований в пробе.

В качестве первого или второго зонда можно использовать олигонуклеотид, такой как рибонуклеиновая кислота (РНК), дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), пептидная нуклеиновая кислота (ПНК), метилфосфонатная нуклеиновая кислота или S-олиго; либо полинуклеотид, такой как кДНК и кРНК.

В соответствии с целью настоящего изобретения подложку с иммобилизованными зондами получают, иммобилизуя первый и второй зонды, имеющие вышеуказанные последовательности, на подложке, представляющей собой пластинчатую основу, пористый материал (Beattie et al., Clin. Chem., 41, 700 (1995)), микротитрационный планшет (Kawai et al., Anal. Biochem., 209, 63 (1993)), гранулы (Mirkin et al., Nature, 382, 607 (1996)), сферический материал, гранулированный материал, магнитный материал или магнитные гранулы (Miller et al., J. Magnet. Magn. Mater., 225, 138 (2001)), чип для капиллярного электрофореза ДНК (Chou et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 96, 11 (1999)), мембранную матрицу (Lemieux et al., Molecular Breeding, 4, 277 (1998)), некоторые типы полупроводниковых устройств (Thewes et al., 2002, IEEE International Solid-State Circuits Conference, 350 (2002)), некоторые типы волноводных материалов (Piunno et al., Anal., Chim. Acta, 288, 205 (1994)), SPR (Nelson et al., Anal. Chem., 73, 1 (2001)), QCM (Ito et al., Anal. Chim. Acta, 327, 29 (1996)) и масс-спектроскопию (Amexis et al., Proc. Natl. Acd. Sci., 98, 12097 (2001)). Качество, размер и форма материала подложки, используемой для иммобилизации нуклеиновой кислоты, не имеют каких-либо конкретных ограничений. В качестве подложки можно использовать материал любого качества, размера и формы, если он способен иммобилизовывать нуклеиновую кислоту. Последовательность нуклеиновой кислоты в пробе обнаруживают при помощи подложки с иммобилизованными зондами, для чего из пробы, взятой у субъекта, экстрагируют нуклеиновую кислоту, получая таким образом испытуемую нуклеиновую кислоту, затем испытуемую нуклеиновую кислоту наносят на подложку с иммобилизованными зондами, такую как чип с иммобилизованными зондами, и выявляют гибридизацию между зондом на подложке с иммобилизованными зондами и испытуемой нуклеиновой кислотой.

Для обнаружения гибридизации между зондом на чипе с иммобилизованными зондами и нуклеиновой кислотой в пробе в объем настоящего изобретения входит (1) способ с использованием вещества-маркера и (2) способ с использованием электрохимического устройства.

(1) В способе с использованием вещества-маркера испытуемую нуклеиновую кислоту предварительно метят флуоресцентным пигментом, таким как FITC, Су3, Су5 или родамин; ферментом, таким как биотин, гаптен, оксидаза или фосфатаза; или электрохимически активным веществом, таким как ферроцен или хиноны. Альтернативно для обнаружения гибридизации используют другой зонд, меченный таким веществом-маркером. Одновременно можно использовать несколько веществ-маркеров.

(2) В способе с использованием электрохимического устройства чип с иммобилизованными зондами применяют в качестве электрода, используя для изготовления подложки такого чипа материал, проводящий электрический ток. В данном случае помимо вышеуказанного электрода можно использовать противоэлектрод и электрод сравнения для обнаружения гибридизации в соответствии с известным способом электрохимического детектирования. В качестве электрода сравнения можно использовать электрод, изготовленный из серебра и хлорида серебра, или электрод, изготовленный из ртути и хлорида ртути. Чип с иммобилизованными зондами можно изготовить, иммобилизуя зонды с разными последовательностями оснований на разных проводящих подложках и располагая указанные проводящие подложки на одной пластинчатой основе. Такой чип с иммобилизованными зондами позволяет производить точное детектирование. В данном случае можно определить электрохимические сигналы, подаваемые разными зондами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гибридизацию между нуклеиновой кислотой, экстрагированной из пробы, и зондом, иммобилизованным на чипе с иммобилизованными зондами, выполняют следующим образом. Гибридизацию производят в буфере с ионной силой от 0,01 до 5 и рН от 5 до 10. Раствор для гибридизации может содержать добавки, такие как декстран-сульфат, служащий в качестве ускоряющего гибридизацию агента, ДНК спермы лососевых, ДНК из тимуса теленка, этилендиамин-тетрауксусная кислота (EDTA) и поверхностно-активное вещество. Нуклеиновую кислоту, экстрагированную из пробы, добавляют к буферному раствору и денатурируют под действием тепла при 90°С и выше. Чип с иммобилизованными зондами можно ввести сразу же после денатурации или после быстрого охлаждения до °С. Альтернативно гибридизацию выполняют, нанося по каплям раствор для гибридизации на подложку. Указанную реакцию можно осуществлять, перемешивая или встряхивая реакционный раствор для увеличения скорости реакции. Данную реакцию можно выполнять при температуре от 10 до 90°С в течение периода времени от одной минуты и на протяжении всей ночи. После выполнения гибридизации электроды удаляют и производят промывку буферным раствором с ионной силой от 0,01 до 5 и рН от 5 до 10.

(1) В способе с использованием вещества-маркера гибридизацию детектируют, выявляя меченую последовательность оснований или маркер дополнительного зонда, имеющегося в пробе, при помощи детектирующего устройства, выбираемого в зависимости от типа маркера. Например, в случае флуоресцентной метки можно использовать флуоресцентный детектор.

(2) В способе с использованием электрохимического устройства гибридизацию детектируют следующим образом. Подложку промывают и на поверхность электрода наносят вещество, распознающее двухцепочечную последовательность, которое способно избирательно связываться с двухцепочечной частью. Вещество, распознающее двухцепочечную последовательность, не имеет каких-либо конкретных ограничений и может включать, например, бис-интеркаляторы, такие как хехст 33258, акридин оранжевый, хинакрин, дауномицин, металлоинтеркалятор и бисакридин; трис-интеркалятор и полиинтеркалятор. Кроме того, такой интеркалятор можно предварительно модифицировать комплексом электрохимически активного металла, такого как ферроцен или виологен. Концентрация такого ДНК-связывающего вещества может изменяться в зависимости от типа интеркалятора, однако обычно она находится в пределах от 1 нг/мл до 1 мг/мл. В данном случае используют буфер с ионной силой от 0,001 до 5 и рН от 5 до 10. После взаимодействия электрода с веществом, распознающим двухцепочечную последовательность, производят промывку и электрохимическое измерение.

Для электрохимического измерения подводят напряжение, при котором вещество, распознающее двухцепочечную последовательность, вступает в электрохимическую реакцию, и измеряют величину тока, выделяемого веществом, распознающим двухцепочечную последовательность. Напряжение можно подводить, производя развертку с постоянной скоростью или в импульсном режиме. Альтернативно можно подводить напряжение постоянного тока. Ток реакции измеряют при помощи такого устройства, как потенциометр, цифровой мультиметр или генератор функций. Концентрацию нуклеиновой кислоты-мишени можно вычислить на основании калибровочной кривой с учетом полученной величины тока.

Устройство для обнаружения последовательности оснований с использованием электрода включает секцию экстракции нуклеиновой кислоты, секцию взаимодействия с нуклеиновой кислотой, секцию взаимодействия с веществом, распознающим двухцепочечную последовательность, секцию электрохимического измерения и секцию промывки.

Другой ДНК-чип, предназначенный для измерения гибридизации электрохимическим способом, описан в нижеследующих публикациях. Hashimoto и др. описали способ обнаружения гена специфической последовательности при помощи золотого электрода, модифицированного ДНК-зондами и электрохимически активным красителем. Анодный ток, выделяемый красителем, соответствует концентрации ДНК-мишени. Wang и др. описали биодатчик электрохимической гибридизации ДНК без индикатора. Конструкция биодатчика включает иммобилизацию инозинзамещенного (без гуанина) зонда на электроде из угольной пасты и прямое хронопотенциометрическое детектирование образования дуплекса по появлению пика окисления гуанина мишени. Указанные публикации включены в данное описание изобретения в качестве ссылки.

При выполнении электрохимического измерения необязательно метить препарат маркером. Поскольку детектирование производится путем измерения электрического сигнала, не нужна сложная система, используемая при детектировании флуоресценции. Поэтому при желании можно уменьшить размер системы электрохимического измерения.

В соответствии с целью настоящего изобретения, используя пробу, например кровь, взятую у субъекта, можно легко получить не только информацию о последовательности нуклеиновой кислоты данного субъекта, имеющей отношение к какому-либо заболеванию, но и информацию о последовательности нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма инфицирующего субъекта.

В соответствии с целью настоящего изобретения подложку с иммобилизованными зондами используют для определения приемлемого метода лечения данного субъекта, подверженного заболеванию. Подложка с иммобилизованными зондами включает второй и первый зонды, иммобилизованные на одной подложке, причем второй зонд используют для получения информации о последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей отношение к заболеванию и присутствующей в хромосоме клетки субъекта, и первый зонд используют для получения информации о последовательности нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма, вызывающего данное заболевание. При помощи подложки с иммобилизованными зондами можно простым способом одновременно получить информацию, касающуюся конкретного заболевания, и/или прогнозировать восприимчивость к лечению данного заболевания со стороны субъекта и патогенного микроорганизма на основании взятой у субъекта пробы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы и подложки с иммобилизованными зондами используют для определения эффективности лечения гепатита С. В других вариантах осуществления изобретения описанный способ и подложки с иммобилизованными зондами используют для оценки эффективности лечения СПИДа (титр ВИЧ и мутации). В других вариантах осуществления изобретения описанный способ и подложки с иммобилизованными зондами используют для оценки эффективности лечения гепатита В (титр вируса гепатита В, тип и мутации).

Способом по настоящему изобретению можно определить эффективность лечения гепатита С. Указанный случай будет рассмотрен ниже в качестве примера.

Известно, что гепатит С приводит к циррозу и затем раку печени. Одним из методов лечения гепатита С является введение интерферона (далее именуемого "IFN"). Для лечения гепатита С часто используют альфа- и бета-IFN. Однако эффективность IFN изменяется в значительной степени. Например, IFN влияет только на 20-30% японцев. Даже если лечение IFN оказывается эффективным, у принимающего его субъекта возникают чрезвычайно сильные побочные эффекты. Считается, что такое различие в эффективности IFN связано с различиями в генотипе вируса гепатита С (далее именуемого "HCV"), поражающего человека (см. J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996)), количестве вируса и различиями в последовательностях нуклеиновой кислоты субъекта, инфицированного данным вирусом. На основании сравнения нуклеотидных и предполагаемых аминокислотных последовательностей разных областей генома HCV описано по крайней мере шесть основных генотипов (Forns et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2516 (1996), Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)). В соответствии с целью настоящего изобретения можно оценить эффективность воздействия IFN на гепатит С. Термин "интерферон (IFN)" в используемом здесь значении означает α-, β-, γ- и/или ω-интерферон. Например, если субъект инфицирован вирусом гепатита С, относящимся к типу Ib (наиболее распространенный тип в Японии), лечение IFN оказывается менее эффективным. Это значит, что концентрация РНК вируса гепатита С, антитела к HCV, GOP и GTP в сыворотке не уменьшается при лечении IFN. Однако, если вирус относится к типу 2а, IFN характеризуется более высокой эффективностью. Из этого следует, что в результате подобного лечения в сыворотке уменьшается концентрация РНК вируса гепатита С, антитела к HCV, GOP и GTP. С другой стороны, при большом количестве вируса, равном 106 копиям/мл или выше, эффективность IFN оказывается низкой. Поэтому для выявления генотипа и количества инфицирующих субъекта вирусов на уровне нуклеиновой кислоты используют первый зонд по настоящему изобретению.

Например, в качестве зонда для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты вируса гепатита С (HCV) в пробе используют последовательность оснований, соответствующую РНК HCV, фрагменту РНК HCV, комплементарной последовательности РНК HCV или ее фрагменту. Желательно, чтобы зонд по настоящему изобретению, предназначенный для обнаружения генотипа или мутации РНК HCV, имел последовательность, включающую по крайней мере 11 оснований, предпочтительно по крайней мере 12 оснований, более предпочтительно по крайней мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и даже 30 оснований. С другой стороны, зонды длиннее по крайней мере 30, предпочтительно по крайней мере 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 оснований, также предпочтительны для обнаружения генома HCV. Последовательности длиной 11-30 оснований соответствуют формату чипа, и зонды длиннее 30 оснований соответствуют общему формату гибридизации. Например, можно использовать зонды, имеющие последовательности оснований, соответствующие SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3 и SEQ ID №4 и их комплементарным последовательностям. Указанные последовательности являются практически консервативными во всех генотипах HCV (Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)).

В качестве первого зонда по настоящему изобретению желательно использовать зонд, способный обнаруживать не только наличие патогенного микроорганизма в пробе, но и генную мутацию патогенного микроорганизма. Установлено, что в случае гепатита С эффективность IFN изменяется в зависимости от наличия сайтспецифической мутации последовательности нуклеиновой кислоты вируса HCV (Nagayama et al., Hepatology, 31, 745 (2000)). В качестве примера первого зонда, предназначенного для обнаружения сайтспецифической мутации последовательности нуклеиновой кислоты вируса HCV в пробе, можно привести зонд, имеющий последовательность оснований для определения аминокислоты в положениях 434, 580, 938, 962, 1176 или 2774 полипротеина HCV (описанный в Hepatology, 31, 745 (2000)). Геномные последовательности HCV-lb, выделенные у субъектов, страдающих печеночно-клеточным раком (НСС), характеризуются повышенным содержанием мутантных остатков по сравнению с аналогичными последовательностями, выделенными у здоровых людей (ASC). Используя такой зонд, можно точно определить эффективность воздействия IFN на гепатит С.

Как описывалось выше, установлено, что эффективность лечения IFN зависит от генотипов HCV. Поэтому первый зонд может представлять собой последовательность оснований, соответствующую РНК HCV, фрагменту РНК HCV, комплементарной последовательности РНК HCV или ее фрагменту. В частности, первый зонд может быть выбран из зондов, предназначенных для специфического обнаружения генотипов HCV типа 1 (SEQ ID №5), HCV типа 2 (SEQ ID №6) и HCV типа 3 (SEQ ID №7), в зависимости от определяемого генотипа. Другими словами, первый зонд, предназначенный для обнаружения HCV, может представлять собой нуклеиновую кислоту, последовательность которой соответствует любой одной последовательности из SEQ ID №5, SEQ ID №6 и/или SEQ ID №7 или их комплементарных последовательностей.

При использовании зонда, способного обнаруживать генотип, точное определение можно произвести, если на одной подложке иммобилизованы зонды, соответствующие разным генотипам.

Генотип патогенного микроорганизма в пробе можно обнаружить следующим образом. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма сначала подвергают PCR, используя затравку, специфичную для данного генотипа, и затем определяют генотип при помощи иммобилизованного универсального зонда. Используемый в настоящем изобретении универсальный зонд представляет собой зонд, способный обнаруживать все вирусы гепатита С независимо от их генотипов (Andonov et al., J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)).

В случае гепатита С выполняют PCR, используя в качестве смысловой цепи последовательность оснований, представленную SEQ ID №8 или SEQ ID №9, и в качестве антисмысловой цепи последовательность оснований, представленную SEQ ID №10 для генотипа 1a, SEQ ID №11 для генотипа 1b, SEQ ID №12 для генотипа 2а или SEQ ID №13 для генотипа 3а. Последующее определение производят, используя в качестве универсального зонда последовательность оснований, представленную SEQ ID №15.

Количество патогенного микроорганизма в пробе можно измерить при помощи первого зонда, то есть зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из патогенного микроорганизма, или последовательность оснований, соответствующую фрагменту нуклеиновой кислоты или ее комплементарной последовательности.

Установлено, что в случае гепатита С эффективность лечения IFN изменяется в зависимости от количества HCV в крови (J. Clin. Microbiol., 33, 254 (1995)). IFN не оказывает эффективного воздействия на субъектов, у которых содержание HCV в сыворотке превышает 106 копий/мл (Yeh et al., J. Med. Biol., 66, 481 (2002)). В качестве зонда для определения количества вирусов можно использовать последовательность оснований, соответствующую РНК HCV, фрагменту РНК HCV, комплементарной последовательности РНК HCV и ее фрагменту. Если нуклеиновая кислота в препарате помечена флуоресцентным маркером, количество вируса, то есть концентрацию вируса, определяют путем гибридизации зонда на чипе с иммобилизованными зондами с нуклеиновой кислотой и последующего измерения интенсивности флуоресценции флуоресцентного маркера. В случае электрохимического метода концентрацию вируса определяют путем гибридизации зонда на чипе с иммобилизованными зондами с нуклеиновой кислотой и последующего измерения величины тока, выделяемого чипом.

Если в чипе с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению в качестве первого зонда использован вышеуказанный зонд (SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7), можно получить информацию о генотипе патогенного микроорганизма, в частности вируса, инфицирующего субъекта, количестве вируса, наличии сайтспецифической мутации, количестве и типе экспрессированного гена. Так, если вирус относится к генотипу 1b, который особенно часто встречается у японцев, лечение IFN оказывается менее эффективным, и, если вирус относится к генотипу 2а, лечение IFN является весьма эффективным. С другой стороны, если количество вируса равно 106 копиям/мл или превышает указанное значение, эффективность лечения IFN оказывается низкой. Таким образом можно определить эффективность лечения IFN для конкретного субъекта.

Автор настоящего изобретения описал другой способ определения эффективности лечения IFN гепатита С в заявках на патент Японии №№2001-62371 и 2001-62372. В соответствии с указанным способом эффективность лечения IFN определяют с учетом полиморфизма отдельных специфических нуклеотидов (далее именуемого "SNP"), характерного для промоторной области (далее именуемой "промоторная область МхА") гена человека, кодирующего белок МхА. IFN эффективно воздействует на субъектов со специфическим типом SNP в промоторной области МхА. Поэтому эффективность лечения IFN можно установить, определяя наличие SNP. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения второй зонд используют для обнаружения отдельной нуклеиновой кислоты, который позволяет идентифицировать SNP в промоторной области МхА.

Вышеуказанное открытие показывает, что эффективность лечения IFN оказывается низкой, когда в положении-88 промоторной области МхА (далее именуемом "МхА-88") находится G/G, в то время как эффективность IFN является высокой при нахождении в указанном положении G/T и Т/Т. С другой стороны, эффективность лечения IFN оказывается низкой, когда в положении-123 промоторной области МхА (далее именуемом "МхА-123") находится С/С, в то время как эффективность IFN является высокой при нахождении в указанном положении С/А и А/А. На основании полученных данных определяют эффективность лечения IFN. Термины "положение-88" и "положение-123" означают положения относительно сайта инициации транскрипции гена МхА, определяемого как +1. Нуклеотидная последовательность промоторной области гена МхА показана на фиг. 1 в заявке WO 01/71007.

Таким образом, в соответствии с целью настоящего изобретения эффективность лечения IFN гепатита С можно определить, выполняя генный анализ HCV в пробе, взятой у субъекта, и генный анализ промоторной области гена, кодирующего белок МхА субъекта, при помощи чипа с иммобилизованными зондами, включающего первый и второй зонды, причем первый зонд используют для обнаружения гена HCV и последующего обнаружения генотипа HCV или генной мутации и второй зонд используют для обнаружения типа основания SNP, имеющегося в промоторной области гена, кодирующего белок МхА субъекта. Благодаря этому можно легко прогнозировать эффективность лечения IFN.

Кроме того, известен способ определения эффективности лечения IFN гепатита С, в основе которого лежит обнаружение двух положений SNP гена, кодирующего маннозасвязывающий лектин (далее именуемый "MBL") (M. Matsushita et al., J. Hepatology, 29; 695-700, 1998). MBL является ключевым фактором врожденной иммунной системы и характеризуется генетическим полиморфизмом. Группа генотипа MBL "ХВ" не восприимчива к IFN. Последовательности MBL описаны Laursen (Immunology, 93, 421 (1998)). Указанная публикация включена в данное описание изобретения в качестве ссылки. Анализ гена, кодирующего маннозасвязывающий лектин, можно выполнить отдельно или вместе с идентификацией гена для промоторной области гена, кодирующего белок МхА.

Полиморфизм MBL, влияющий на эффективность IFN, определяется положением-221 (далее именуемым "MBL-221") в промоторной области гена MBL, а также 52-м, 54-м и 57-м кодонами экзона 1 гена MBL. Термин "положение-221" означает положение относительно сайта инициации транскрипции гена MBL, определяемого как +1.

С и G являются возможными основаниями, которые могут занимать положение 221 в гене MBL. Когда С занимает положение 221, генотип гена MBL определяется как "X". Когда G занимает положение 221, генотип определяется как "Y". Номенклатура приведена на основе описания Madsen и др. (Madsen H.О., Garred Р., Thiel S., Kurtzhals J.A.L., Lamm L.U., Ryder L.P., et al., "The interaction between promoter and structural gene controls the minimum serum level of a human mannan-binding protein", J. Immunol., 1995; 155: 3013-20). Указанная публикации включена в данное описание изобретения в качестве ссылки.

Кодоны в положениях 52, 54 и 57 экзона 1 гена MBL находятся в структурном гене, а именно в коллагенподобном домене. Возможной последовательностью (генотипом) кодона 52 является CGT или TGT. В соответствии с номенклатурой Madsen первый генотип относится к типу А и второй генотип относится к типу D. Аналогичным образом возможной последовательностью (генотипом) кодона 54 является GGC или GAC. Первый генотип относится к типу А и второй генотип относится к типу В. Кроме того, последовательностью (генотипом) кодона 57 может быть GGA или GAA. Первый генотип относится к типу А и второй генотип относится к типу С. Во всех кодонах тип А является диким аллелем, а типы В, С и D являются мутантными аллелями. Эффективность IFN является высокой в том случае, когда все аллели кодонов 52, 54 и 57 относятся к типу А, и низкой, когда по крайней мере один из аллелей кодонов 52, 54 и 57 не относится к типу А.

IFN оказывает более эффективное воздействие на субъекта гомозиготного типа YA-YA, у которого положение MBL-221 относится к типу Y и аллели в кодонах 52, 54 и 57 относятся к типу А, по сравнению с субъектами гетерозиготного типа YnonA-YA и гомозиготного типа YnonA-YnonA, у которых положение MBL-211 относится к типу Y и аллели в кодонах 52, 54 и 57 относятся к типу А. Другими словами, IFN менее эффективно воздействует на субъектов гетерозиготного типа YnonA-YA и гомозиготного типа YnonA-YnonA, чем на субъектов гомозиготного типа YA-YA.

На основании вышеуказанных результатов можно определить требуемый второй зонд. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, в котором заболевание является гепатитом С и лекарственное средство является IFN, второй зонд на чипе с иммобилизованными зондами, используемый для гибридизации с нуклеиновой кислотой субъекта, представляет собой зонд, позволяющий обнаруживать SNP промотора МхА, как это описано ниже. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, в котором заболевание является гепатитом С и лекарственным средством является IFN, второй зонд на чипе с иммобилизованньми зондами, используемый для гибридизации с нуклеиновой кислотой субъекта, представляет собой зонд, позволяющий обнаруживать полиморфизм MBL, который взаимосвязан с эффективностью IFN, как это описано ниже.

Промоторные области гена МхА человека с полиморфизмом одного нуклеотида (SNP), имеющего место в положении 455 и 420 каждой из указанных последовательностей оснований, определяют эффективность лечения IFN. Поэтому все последовательности оснований, представленные SEQ ID №16, 17, 18, 19, 37, 38, 39 и 40, имеют промоторную область гена МхА человека.

В других вариантах осуществления изобретения второй зонд выбирают из нижеследующей группы:

(at455) последовательность оснований, представленная SEQ ID №16 в списке последовательностей;

(bt455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at455), путем делении или замены нескольких оснований, за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания. Модифицированный зонд, предназначенный для обнаружения полиморфизма MBL, сохраняет способность гибридизировать с нуклеиновой кислотой субъекта, кодирующей MBL. Условия гибридизации с использованием модифицированных зондов отличаются от условий, применяемых при использовании обычных зондов. Желательно, чтобы модифицированный зонд по настоящему изобретению имел последовательность, включающую по крайней мере 11 оснований, предпочтительно по крайней мере 12 оснований, более предпочтительно по крайней мере 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и даже 30 оснований, для обнаружения генотипа или мутации РНК HCV. С другой стороны, зонды, включающие по крайней мере 30 оснований, предпочтительно около по крайней мере 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 оснований, также пригодны для обнаружения генома HCV. Зонды длиной 11-30 оснований соответствуют формату чипа и зонды длиной более 30 оснований могут соответствовать обычному формату гибридизации.

(ct455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID №16;

(dt455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID №16;

(et455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемая из последовательностей оснований с (at455) по (dt455);

(аg455) последовательность оснований, представленная SEQ ID №17 в списке последовательностей;

(bg455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания;

(сg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID №17;

(dg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID №17;

(eg455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg455) по (dg455);

(аа455) последовательность оснований, представленная SEQ ID №18 в списке последовательностей;

(ba455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (aa455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания;

(са455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 18;

(da455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 18;

(еа455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа455) по (da455);

(ас455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 19 в списке последовательностей;

(bc455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания;

(сс455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 19;

(dc455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID №19;

(ec455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас455) по (dc455).

Все последовательности оснований, представленные SEQ ID №№16, 17, 18, 19, 37, 38, 39 и 40, включают промоторную область гена МхА человека. Полиморфизм одного нуклеотида (SNP), имеющий место в положениях 455 и 420 всех указанных последовательностей оснований характеризует эффективность лечения IFN.

Последовательности оснований SEQ ID №16-19 идентичны друг другу за исключением основания в положении 455. В положении 455 последовательности SEQ ID №16 находится тимин. В положении 455 последовательности SEQ ID №17 находится гуанин. В положении 455 последовательности SEQ ID №18 находится аденин. В положении 455 последовательности SEQ ID №19 находится цитозин.

Субъект, инфицированный HCV, который имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную SEQ ID №16, где в положении 455 находится тимин, эффективно поддается лечению IFN, в то время как субъект, инфицированный HCV, у которого отсутствует такая последовательность, плохо поддается лечению IFN. Другими словами, субъект, инфицированный HCV, который имеет гомологичную зиготу (именуемую "G/G гомо"), включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID №17, где в положении 455 находится G, менее эффективно поддается лечению IFN, чем субъект, инфицированный HCV, который имеет гетерологичную зиготу (именуемую "G/T гетеро"), включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID №16, где в положении 455 находится тимин, и последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID №17, где в положении 455 находится гуанин, и/или субъект, инфицированный HCV, который имеет гомологичную зиготу (именуемую "Т/Т гомо"), включающую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID №17, где в положении 455 находится тимин.

Альтернативно по сравнению с субъектом, инфицированным HCV, который относится к типу "Т/не-Т гетеро" или "Т/Т гомо", субъект, инфицированный HCV, который имеет гомологичную зиготу (именуемую "не-Т/не-Т гомо") с промоторными областями гена МхА, где в положении 455 отсутствует тимин, менее эффективно поддается лечению IFN. Примерами комбинаций "не-Т/не-Т гомо" являются G/G, G/A, G/C, А/А, А/С и С/С. Примерами комбинаций "Т/не-Т" являются T/G, Т/А и Т/С.

Последовательности оснований, представленные SEQ ID №37-40, идентичны друг другу за исключением основания в положении 425. В положении 425 SEQ ID №37 находится аденин. В положении 425 SEQ ID №38 находится цитозин. В положении 425 SEQ ID №39 находится тимин. В положении 425 SEQ ID №40 находится гуанин.

Если в чипе с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению в качестве второго зонда (для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта) использована последовательность оснований, представленная SEQ ID №16, которая имеет сайт SNP, включающий тимин, фрагмент последовательности оснований или любую из комплементарных последовательностей с (at455) по (et455), до начала лечения можно установить, находится или нет тимин в сайте SNP данной последовательности оснований (включая промоторную область гена МхА человека, выделенного из организма субъекта). Таким образом можно определить эффективность лечения IFN данного субъекта.

Если до начала лечения IFN определить тип основания в сайте SNP последовательности оснований, включающей промоторную область гена МхА человека, инфицированного HCV, можно установить, насколько эффективно IFN будет воздействовать на данного субъекта, инфицированного HCV.

Если в чипе с иммобилизованными зондами по настоящему изобретения в качестве второго зонда, предназначенного для обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта, использована любая последовательность оснований, представленная SEQ ID №17, которая имеет сайт SNP, включающий гуанин, фрагмент указанной последовательности оснований или любую из комплементарных последовательностей с (аg455) по (еg455), последовательность оснований, представленная SEQ ID №18, которая имеет сайт SNP, включающий аденин, фрагмент указанной последовательности оснований или любую из комплементарных последовательностей с (аа455) по (еа455), и последовательность оснований, представленная SEQ ID №19, которая имеет сайт SNP, включающий аденин, фрагмент указанной последовательности оснований или любую из комплементарных последовательностей с (ас455) по (ес455), можно идентифицировать основание в сайте SNP последовательности оснований, включающей промоторную область гена МхА человека, выделенного из организма субъекта. Таким образом можно определить эффективность лечения IFN данного субъекта (см. заявки на патент Японии №№2001-62371 и 2001-62372).

В соответствии с вариантом осуществления изобретения, в котором заболевание является гепатитом С и лекарственное средство является IFN, второй зонд, используемый для гибридизации с нуклеиновой кислотой субъекта, в том числе на чипе с иммобилизованными зондами, представляет собой зонд, выбираемый из нижеследующей группы:

(аа420) последовательность оснований, представленная SEQ ID №37 в списке последовательностей;

(bа420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания;

(са420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID №37;

(da420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа420) по (са420);

(ас420) последовательность оснований, представленная SEQ ID №38 в списке последовательностей;

(bс420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания;

(сс420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID №38;

(dc420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас420) по (сс420);

(at420) последовательность оснований, представленная SEQ ID №39 в списке последовательностей;

(bt420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания;

(ct420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID №39;

(dt420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at420) по (ct420);

(аg420) последовательность оснований, представленная SEQ ID №40 в списке последовательностей;

(bg420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания;

(сg420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID №40;

(dg420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg420) по (сg420).

Субъект, инфицированный HCV, который имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную SEQ ID №37, где в положении 425 находится аденин, эффективно поддается лечению IFN, в то время как субъект, инфицированный HCV, который не имеет последовательности SEQ ID №37, плохо поддается лечению IFN. Взаимосвязь между указанной последовательностью и эффективностью лечения IFN является почти такой же, как в случае наличия сайта SNP в положении 455.

Кроме того, в том случае, когда установлено, что заболевание, эффективно поддающееся лечению IFN, является гепатитом С, второй зонд по настоящему изобретению можно выбрать из группы, включающей описанные ниже последовательности (i)-(t). Указанные последовательности (i)-(t) пригодны для определения типов MBL-221 и наличия полиморфизма в кодонах 52, 54 и 57.

Последовательности гена MBL, содержащего MBL-221 и кодирующего полиморфизм в кодонах 52, 54 и 57, представлены SEQ ID №№41-56. MBL-221 находится в положении 425 указанных последовательностей.

Экзон 1 начинается с положения 646 каждой из указанных последовательностей. Кодон 52 занимает положения с 868 по 870. Кодон 54 занимает положения с 874 по 876. Кодон 57 занимает положения с 883 по 885. SNP кодонов 52, 54 и 57 находится соответственно в положениях 868, 875 и 884.

(i) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№41-44, содержащие сайт SNP MBL-221 и последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую положениям с 418 по 432.

(j) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№41-44, содержащие сайт SNP MBL-221 и последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую положениям с 421 по 430.

(k) Комплементарные последовательности фрагментов (i) и (j).

(1) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№45-56, содержащие сайты SNP кодонов 52, 54 и 57 и последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую положениям с 868 по 885, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56.

(m) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №45-56, содержащие сайты SNP кодонов 52 и 54 и последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую положениям с 868 по 876, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56.

(n) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№45-56, содержащие сайты SNP кодонов 54 и 57 и последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую положениям с 874 по 885, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56.

(о) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№45-56, содержащие сайт SNP кодона 54 и последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую положениям с 874 по 876, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56, и, в частности, фрагменты, включающие положения с 869 по 880.

(р) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№45-56, содержащие сайт SNP кодона 52 и нуклеиновую кислоту, соответствующую положениям с 868 по 870, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56, и, в частности, фрагменты, содержащие положения с 864 по 873 указанных последовательностей.

(q) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№45-56, содержащие сайт SNP кодона 57 и нуклеиновую кислоту, соответствующую положениям с 883 по 885, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56, и, в частности, фрагменты, содержащие положения с 880 по 890.

(r) Фрагменты нуклеиновой кислоты SEQ ID №№45-56, содержащие сайт SNP кодона 54 и нуклеиновую кислоту, имеющую положение 875, в котором находится сайт SNP кодона 54, например фрагменты, содержащие нуклеиновые кислоты, представленные SEQ ID №№45-56.

(s) Фрагменты нуклеиновой кислоты, приведенные в пунктах (i)-(m), длиной от 11 до 30 оснований. Для гена MBL предпочтителен зонд с последовательностью, включающей по крайней мере положения 420-430, 864-874, 870-880 и 879-889. Для гена МхА нужен зонд с последовательностью, содержащей по крайней мере положения 450-460.

(t) Фрагменты нуклеиновой кислоты, приведенные в пунктах (i)-(m), которые представляют собой нуклеиновые кислоты, модифицированные делецией, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеиотидов за исключением сайта SNP.

Во всех последовательностях, приведенных в списке последовательностей, прилагаемом к данному описанию изобретения, символы "N" и "n" означают любое из нижеследующих оснований, а именно аденин, тимин, гуанин и цитозин.

Используя чип с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению, при помощи второго зонда можно определить нуклеиновую кислоту (РНК), экспрессируемую субъектом, другими словами, при помощи зонда, имеющего последовательность оснований, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта, ее фрагменту или комплементарной последовательности к последовательности нуклеиновой кислоты или ее фрагменту. В данном случае можно обнаружить или произвести количественное определение последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей собой РНК, кДНК или кРНК. Например, благодаря тому что эффективность IFN изменяется в зависимости от генетической предрасположенности субъекта, можно измерить экспрессию гена, то есть количество и качество экспрессированного гена, и на основании полученных данных определить эффективность фактически вводимого IFN.

Настоящее изобретение применимо к различным заболеваниям без особых ограничений. К таким заболеваниям относятся любые заболевания, вызываемые патогенными микроорганизмами. В объем настоящего изобретения входят заболевания, вызываемые патогенными микроорганизмами, а также онкологические заболевания.

Например, помимо гепатита С можно прогнозировать эффективность лечения IFN и других заболеваний, хорошо поддающихся такому лечению, которые включают, но не ограничиваются ими, инфекционные заболевания, вызываемые вирусами, такими как вирус гепатита С (типы А, В, С, D, Е, F, G), ВИЧ, вирус гриппа, вирус герпеса, аденовирус, вирус полиомы человека, вирус папилломы человека, парвовирус человека, вирус паротита, ротавирус, энтеровирус, вирус японского энцефалита В, вирус денге, вирус краснухи и вирус человеческого Т-клеточного лейкоза (HTLV); инфекционные заболевания, вызываемые бактериями, такими как Staphylococcus aureus, гемолитический стрептококк, патогенные бактерии Escherichia coli, вибрион энтерита, Helicobacter pylori, Campylobacter, Vibrio cholerae, дизентерийная палочка, сальмонелла, Yelsinia, Neisseria gonorrhoeae, Listeria, Leptospira, Legionella, спирохета, Mycoplasma pneumoniae, риккетсия, хламидия, Malaria plasmodia, дизентерийная амеба и патогенные грибы; и заболевания, вызываемые паразитами и эумицетами.

Кроме того, можно оценить эффективность лечения IFN онкологических заболеваний. В качестве примеров онкологических заболеваний можно привести наследственные заболевания, ретинобластому, опухоль Вильмса, врожденный семейный полипоз прямой кишки, наследственный рак прямой кишки неполипозного типа, нейрофиброматоз, ксеродермический пигментоз, рак головного мозга, рак полости рта, рак пищевода, рак желудка, рак прямой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак щитовидной железы, опухоль молочной железы, опухоль мочевого пузыря, опухоль мужских половых органов, опухоль женских половых органов, рак кожи, остеосаркому, остеохондросаркому, лейкоз, лимфому и твердую опухоль.

Патогенные микроорганизмы, которые можно обнаружить при помощи настоящего изобретения, не имеют каких-либо ограничений. Например, можно определить эффективность лечения IFN заболеваний, вызываемых такими патогенными микроорганизмами, как HCV. Однако настоящее изобретение относится к любому патогенному микроорганизму, если известно, что он вызывает заболевание, эффективно поддающееся лечению IFN. Считается, что патогенный микроорганизм вызывает заболевание, если его можно прямо или косвенно соотнести с данным заболеванием или его симптомами.

Примеры таких патогенных микроорганизмов включают вирусы гепатита С (типы А, В, С, D, Е, F, G), ВИЧ, вирус гриппа, вирус герпеса, аденовирус, вирус полиомы человека, вирус папилломы человека, парвовирус человека, вирус паротита, ротавирус человека, энтеровирус, вирус японского энцефалита В, вирус денге, вирус краснухи и вирус человеческого Т-клеточного лейкоза (HTLV); и бактерии, такие как Staphylococcus aureus, гемолитический стрептококк, патогенные Escherichia coli, вибрион энтерита, Helicobacter pylori, Campylobacter, Vibrio cholerae, дизентерийная палочка, сальмонелла, Yelsinia, Neisseria gonorrhoeae, Listeria, Leptospira, Legionella, спирохета, Mycoplasma pneumoniae, риккетсия, хламидия, Malaria plasmodia, дизентерийная амеба и патогенные грибы; паразиты и эумицеты.

Способ определения эффективности лечения IFN в зависимости от заболевания и гена, присущего субъекту, описан в виде примера.

Однако объем настоящего изобретения не ограничивается данным примером.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения вероятность заболевания субъекта синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИДом) можно прогнозировать исходя из анализа вируса иммунодефицита человека (далее именуемого "ВИЧ"), присутствующего в организме субъекта, и гена, выделенного из организма данного субъекта. Кроме того, можно произвести анализ генотипа гена ВИЧ и/или его копии (например, кДНК) и специфического полиморфизма гена ВИЧ. На основании полученной информации можно прогнозировать эффективность нижеследующих лекарственных средств, включающих ингибитор протеазы, такой как ритнавил (RTV) или саквинавил (SQV), и ингибитор обратной транскриптазы, такой как адифотимин (AZT) или диданоизин (ddl). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения можно прогнозировать подверженность субъекта ветряной оспе или опоясывающему лишаю, анализируя вирус ветряной оспы, находящийся в организме субъекта, и ген, выделенный из организма данного субъекта. Альтернативно можно оценить эффективность антивирусного средства, такого как ацикловил. С другой стороны, зная генотип вируса гриппа, число копий вируса гриппа и генотип субъекта, можно прогнозировать подверженность субъекта гриппу и эффективность антивирусного средства, такого как тамифулу. Если экстрагированным компонентом нуклеиновой кислоты является РНК HCV, то полученную РНК HCV можно использовать в качестве испытуемой нуклеиновой кислоты. Альтернативно РНК HCV превращают в кДНК при помощи обратной транскриптазы и затем используют в качестве испытуемой нуклеиновой кислоты.

Если на одной подложке иммобилизовано несколько зондов, соответствующих разным генотипам, можно произвести точное определение, используя зонд, способный обнаруживать генотип.

Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Описание способа экстракции нуклеиновой кислоты из организма человека

1. Способ экстракции геномной нуклеиновой кислоты человека и геномной нуклеиновой кислоты вируса из организма человека

У каждого субъекта, инфицированного HCV, берут примерно 3 мл крови и помещают в пробирку под вакуумом для сбора крови, содержащую EDTA2K. Затем из пробы крови экстрагируют нуклеиновую кислоту при помощи набора средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp (фирмы QIAGEN GmbH). Геномную РНК вируса гепатита С (HCV), находящуюся в полученном экстракте, подвергают обратной транскрипции. В частности, из полученного экстракта берут аликвоту препарата, добавляют к ней гексадезоксирибонуклеотидную смесь (фирмы Takara К.К.) и обратную транскриптазу M-MLV (фирмы Life Technologies Inc.) и выполняют реакцию при 42°С в течение 30 минут.

2. Определение коэффициента экстракции геномной РНК HCV при помощи набора для экстракции геномной нуклеионовой кислоты человека

Во время экстракции геномной РНК HCV вместо цельной крови обычно используют сыворотку. По возможности полностью удаляют загрязняющие примеси, такие как белки, и, используя гуанидиновый буфер или тому подобный, экстрагируют геномную РНК HCV. Однако при осуществлении способа по настоящему изобретению геномную РНК HCV экстрагируют одновременно с геномной ДНК человека. Так авторы настоящего изобретения определяют коэффициент экстракции геномной РНК HCV при одновременной экстракции геномной ДНК человека из цельной крови, используя набор для экстракции геномной нуклеиновой кислоты человека из цельной крови.

Произведено сравнение двух способов. Один способ представляет собой обычный способ экстракции геномной РНК HCV из сыворотки (100 мкл) при помощи устройства SepeGeneRV-R (фирмы Sanko Junyaku К.К.). Другой способ представляет собой способ экстракции геномной РНК HCV из цельной крови при помощи набора средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp (QIAGEN GmbH), который далее именуется просто "способ QIAamp". Геномную РНК HCV, экстрагированную способом QIAamp, затем подвергают взаимодействию с обратной транскриптазой, как это описано выше, и очищают, производя осаждение этанолом. Затем сравнивают коэффициенты экстракции геномной РНК HCV способом QIAamp при осаждении этанолом или без осаждения этанолом.

Коэффициент экстракции оценивают при помощи конкурентной PCR (К. Chayama et al., J. Gastroenterol. Hepatol., 8, S40-44, 1993), используя 5’-концевую последовательность UTR геномной РНК HCV. Результаты показаны в таблице 1.

Из приведенных выше результатов следует, что коэффициент экстракции геномной РНК HCV способом QIAamp почти в 10 раз ниже по сравнению с обычным способом. Поэтому можно предположить, что РНК HCV нельзя экстрагировать способом QIAamp из пробы крови с очень низкой концентрацией вируса. Таким образом, способ QIAamp следует считать непригодным для количественного определения при помощи чипа с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению. Однако, анализируя обычным способом пробу цельной крови, содержащую вирусы в концентрации 10⁶ копий/мл или больше, теоретически можно предположить вероятность экстракции ДНК одновременно с РНК способом QIAamp. Другими словами, можно производить качественное определение вирусов способом QIAamp.

Препарат, полученный в результате выполнения обратной транскрипции, как это описано выше, подвергают амплификации, производя одновременную амплификацию геномной нуклеиновой кислоты человека и геномной РНК вируса гепатита С (HCV), присутствующего в организме данного субъекта.

Для амплификации геномной нуклеиновой кислоты человека используют затравки MxAF01 и MxAR02. Для амплификации геномной РНК HCV используют затравку nс2 (К. Chayama et al., J. Gastroenterol. Hepatol., 8, S40-44, 1993, nt27-45) и затравку 33 (Okamoto et al., Jpn. J. Exp. Med 60, 215-222, 1990). Амплификацию выполняют в одной пробирке. Геномную нуклеиновую кислоту человека и геномную РНК HCV амплифицируют, повторяя 50 раз цикл, включающий реакцию при 94°С в течение 30 секунд, реакцию при 55°С в течение 30 секунд и реакцию при 2°С в течение одной секунды. Предварительную обработку производят при 94°С в течение 4 минут до PCR и последующую обработку выполняют при 72°С в течение 7 минут после PCR.

Последовательность затравки:

MxAF01: 5’-ACACACCCGTTTCCACCCTGGAGAGGCCAG-3’

MxAR02: 5’-TGCGCAGTGCTGGAGTGCGGCCTCCGCTCT-3’

NC2: 5’-CCT GTG AGG AAC TAC TGT C-3’

33: 5’-GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC-3’

В результате этого происходит амплификация как геномной ДНК человека (длина: 610 п.н.), так и геномной РНК HCV (длина: 300 п.н.). Полученные данные свидетельствуют об одновременном и одинаковом выполнении всех стадий, начиная со стадии экстракции геномной ДНК человека и геномной РНК вируса и кончая стадией амплификации специфических областей геномных нуклеиновых кислот.

В соответствии с настоящим изобретением можно легко и быстро оценить эффективность лечения заболевания, используя пробу, взятую у субъекта.

Кроме того, в соответствии с данным вариантом осуществления изобретения на основании одной пробы, взятой у субъекта, можно получить разнообразную информацию. Благодаря этому можно предотвратить смешивание препаратов, иногда происходящее во время анализа проб. Альтернативно анализ чрезвычайно опасного препарата можно произвести с более высокой степенью безопасности по сравнению с обычным анализом. Таким образом, можно свести до минимума риск случайного заражения опасным препаратом.

Пример 2. Описание ДНК-чипа, предназначенного для оценки эффективности лечения IFN

Из пробы крови субъекта сначала выделяют хромосомную ДНК человека и РНК HCV. Фрагмент хромосомной ДНК человека длиной 135 п.н. амплифицируют, используя затравки, представленные SEQ ID №№20 и 21. РНК HCV обрабатывают обратной транскриптазой для получения кДНК.

Препарат нуклеиновой кислоты, полученной на предыдущей стадии, метят FITC при помощи набора, производимого фирмой Phamacia Inc.

На фиг.1 дано схематическое изображение ДНК-чипа по примеру 2. Подложка 6 представляет собой предметное стекло, покрытое полилизином. На подложку 6 наносят вторые и первые зонды, каждый в количестве 200 нл, и сушат (на фиг.1 первые и вторые зонды обозначены цифрами 1-5). В данном случае в качестве второго зонда использованы последовательности, представленные SEQ ID №№22, 23, 24, 25 и 26. Последовательности, представленные SEQ ID №5, 6 и 7, использованы в качестве первого зонда. Затем ДНК-чип облучают УФ-лучами для иммобилизации зондов на подложке 6. Последовательности оснований SEQ ID №№22-25 являются фрагментами последовательностей оснований, представленных соответственно SEQ ID №№16-19, каждая из которых имеет сайт SNP в положении 455. Последовательности оснований SEQ ID №№5-7 являются зондами, используемыми для обнаружения генотипов вирусов HCV, а именно типов 1, 2, 3.

Нуклеиновые кислоты, меченные FITC, растворяют в растворе 2×SSC-1 ммоль/л EDTA. Полученные таким образом нуклеиновые кислоты помещают в реактор в объеме 20 мкл и покрывают предметным стеклом с иммобилизованными зондами. Реакцию выполняют при 50°С в течение 12 часов, после чего чип с иммобилизованными зондами дважды промывают раствором 0,2×SSC-1 ммоль/л EDTA. Затем измеряют интенсивность флуоресценции, излучаемой предметным стеклом.

Результаты показывают, что только пятно зонда SEQ ID №22 характеризуется значительным уровнем флуоресценции. Таким образом, генотип МхА-88, выделенный из нуклеиновой кислоты человека и имеющийся в пробе крови, относится к типу "Т/Т гомо". Вирус, содержащийся в пробе крови, определен как вирус HCV типа 2. Полученная интенсивность флуоресценции показывает, что концентрация вируса равна 106 копиям/мл или меньше. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что IFN будет эффективно воздействовать на субъекта, у которого была взята указанная проба крови.

Пример 3. Описание ПНК-чипа, предназначенного для оценки эффективности лечения IFN

ПНК-чип, используемый для оценки эффективности лечения IFN.

Из пробы крови субъекта выделяют хромосомную ДНК человека и РНК HCV. Фрагмент хромосомной ДНК человека длиной 135 п.н. амплицируют, используя затравки SEQ ID №№20 и 21. С другой стороны, РНК HCV обрабатывают обратной транскриптазой, чтобы получить кДНК. PCR выполняют, используя полученную кДНК в качестве матрицы и затравки, представленные SEQ ID №№10, 11, 12, 13 и 14 (указанные затравки являются антисмысловыми затравками).

На фиг.2 дано схематическое изображение ПНК-чипа по примеру 3. Чип с иммобилизованными зондами изготавливают следующим образом. Десять золотых электродов 13 присоединяют на стеклянной подложке 12 к контактам 14. На подложку чипа наносят первые ПНК-зонды и вторые ПНК-зонды, каждый в количестве 200 нл (обозначены на чертеже цифрами 7-12), и оставляют на один час. В данном случае последовательности, представленные SEQ ID №27, 28, 29, 30 и 31, используют в качестве вторых ПНК-зондов, у которых N-концы модифицированы цистеином. Последовательности, представленные SEQ ID №№32, 33, 34, 35 и 36, использованы в качестве первых ПНК-зондов. Последовательности оснований SEQ ID №№27-30 являются фрагментами, включающими последовательности, представленные SEQ ID №№16-19, каждая из которых имеет сайт SNP в положении 455. Последовательности оснований SEQ ID №№32-36 использованы для обнаружения генотипов вирусов HCV, а именно 1a, 1b, 2а, 2b и 3а.

Затем препарат растворяют в растворе 2×SSC-1 ммоль/л EDTA. Полученный раствор помещают в реактор в количестве 20 мкл и покрывают чипом с иммобилизованными зондами. Реакцию выполняют при 50°С в течение одного часа, после чего чип с иммобилизованными зондами промывают раствором 0,2×SSC-1 ммоль/л EDTA. На чип по каплям добавляют раствор 10 мкмоль/л хехста 33258. На чипе с иммобилизованными зондами расположен золотой электрод 13, противоэлектрод и электрод сравнения. Ток окисления, поступающий от хехста 33258, измеряют, подводя напряжение между золотым электродом и противоэлектродом.

Результаты свидетельствуют о значительном изменении тока, поступающего от золотых электродов 13, на которых иммобилизованы зонды, имеющие последовательность, представленную SEQ ID №№27, 28 и 34. Таким образом установлено, что генотип МхА-88, выделенный из нуклеиновой кислоты человека и присутствующий в пробе, относится к типу "G/T гетеро". Кроме того, вирус, содержащийся в пробе, относится к типу 2а. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что IFN будет эффективно воздействовать на субъекта, у которого была взята указанная проба.

Пример 4

В соответствии с настоящим изобретением можно определить эффективность лечения IFN субъекта, страдающего гепатитом С, с учетом типа вируса HCV, генотипов МхА-88, МхА-123, MBL-221 и кодона 54 коллагеноподобного домена MBL.

Способ оценки эффективности лечения IFN с учетом типа вируса и генотипов MBL и МхА описан со ссылкой на блок-схему, показанную на фиг.3.

Блок-схема оценки эффективности IFN начинается со стадии 3а, на которой у субъекта, подлежащего лечению IFN, берут пробу такую, как проба крови. При необходимости полученную таким образом пробу очищают экстракцией или подобным способом. Затем определяют тип вируса и генотипы МхА-88, МхА-123, MBL-221 и кодон 54 коллагеноподобного домена MBL.

Вслед за этим переходят к стадии 3b указанного процесса оценки. Если на стадии 3а обнаруживают вирус типа 1, переходят к стадии 3с. Если на стадии 3b обнаруживают вирус типа 2, переходят к стадии 3d.

При помощи таблицы 2, в которой приведены величины эффективности IFN в зависимости от генотипов, на стадии 3с определяют эффективность IFN, соответствующую генотипам MBL и МхА, выявленным на стадии 3а. Таким образом оценивают эффективность лечения IFN. На этом завершается процесс определения эффективности.

При помощи таблицы 3, в которой приведены величины эффективности IFN в зависимости от генотипов, на стадии 3d определяют эффективность IFN, соответствующую генотипам MBL и МхА, выявленным на стадии 3а. Таким образом оценивают эффективность лечения IFN. На этом завершается процесс определения эффективности.

Приведенные здесь таблицы содержат данные восприимчивости к IFN в зависимости от генотипов.

Необходимые данные приведены соответственно в таблицах 2 и 3. Ниже в качестве примера описаны данные, приведенные в таблицах 2 и 3. Любые таблицы можно использовать при наличии в них взаимосвязи между эффективностью лечения IFN и генотипами. Например, в таблице 2 показана взаимосвязь между эффективностью лечения IFN и генотипами субъекта, инфицированного вирусом HCV типа 1. С другой стороны, в таблице 3 показана взаимосвязь между эффективностью лечения IFN и генотипом вирусов. Приведенная таблица может содержать только требуемые данные. Альтернативно наряду с требуемыми данными таблица может включать дополнительные данные. Таблицы 2 и 3, используемые на стадиях 3с и 3d, описанных в примере 4, представляют собой заранее составленные таблицы, в которые включены данные, необходимые для соответствующих стадий. Однако таблицы 2 и 3 могут быть объединены в одну. Альтернативно таблица может содержать другие данные. Данные, включаемые в таблицу, можно выбрать следующим образом. Например, таблица, используемая на стадии 3с, будет удовлетворять предъявляемым требованиям, если она включает данные о "генотипах" субъекта, инфицированного HCV типа 1, "процентные значения восприимчивых к лечению субъектов" и "процентные значения невосприимчивых к лечению субъектов". Таблица, используемая на стадии 3d, будет удовлетворять предъявляемым требованиям, если она включает данные о "генотипах субъекта, инфицированного HCV типа 2", "процентные значения восприимчивых к лечению субъектов" и "процентные значения невосприимчивых к лечению субъектов". Однако включаемые в таблицу данные не ограничиваются указанными показателями. Исследователь может произвольно выбирать данные, включаемые в таблицу.

Численные значения, приведенные в таблицах 2 и 3, показывают соответствие между генотипом и восприимчивостью к IFN или эффективностью лечения IFN. Однако соответствие между генотипом и восприимчивостью к IFN необязательно должно быть выражено численными значениями. Корреляцию между генотипом и эффективностью лечения IFN можно выразить любыми средствами, например символами, такими как О, Х и Δ, и баллами (упрощенными численными значениями), такими как 1, 2, 3, 4 и 5, если они позволяют точно представить существующую взаимосвязь.

Исследуя различные данные, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно более точно определить эффективность лечения IFN. Кроме того, при использовании методов и чипа с иммобилизованными зондами по настоящему изобретению можно легко, быстро и точно получить информацию о содержащейся в пробе нуклеиновой кислоте-мишени. Вышеуказанная цель настоящего изобретения описана в виде примера и поэтому не ограничивает объем настоящего изобретения.

Специалистам в данной области должны быть очевидны дополнительные преимущества и модификации изобретения. Поэтому настоящее изобретение в более широком объеме не ограничено конкретными деталями и типичными вариантами осуществления, рассмотренными в данном описании изобретения. Из вышеизложенного следует, что возможны разные модификации, не выходящие за пределы общего изобретательского замысла, определяемого прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Формула изобретения

1. Способ получения первичной информации о нуклеиновой кислоте субъекта, подверженного конкретному заболеванию, и вторичной информации о нуклеиновой кислоте патогенного микроорганизма, присутствующего в организме указанного субъекта и вызывающего данное заболевание, который заключается в том, что (a) экстракт нуклеиновой кислоты, выделенной из организма субъекта, подвергают взаимодействию с зондами, иммобилизованными на подложке, содержащей первый и второй зонды, причем первый зонд предназначен для обнаружения последовательности специфической нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма, вызывающего указанное заболевание, и второй зонд предназначен для обнаружения последовательности специфической нуклеиновой кислоты указанного субъекта; и (b) в результате выполнения реакции, описанной в пункте (а), получают первичную информацию о наличии нуклеиновой кислоты, связанной с первым зондом, если таковая имеется, и вторичную информацию о наличии нуклеиновой кислоты, связанной со вторым зондом, если таковая имеется.

2. Способ по п.1, в котором нуклеиновая кислота указанного субъекта определяет восприимчивость к лечению заболевания, при этом информацию о наличии указанной нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма и указанной нуклеиновой кислоты субъекта коррелируют с восприимчивостью указанного субъекта к лечению заболевания.

3. Способ по п.1, который далее включает амплификацию экстракта нуклеиновой кислоты, выделенной из организма указанного субъекта, с целью получения амплифицированных нуклеиновых кислот до выполнения реакции, описанной в п.(а).

4. Способ по п.1, в котором указанный субъект является человеком.

5. Способ по п.1, в котором указанный экстракт нуклеиновой кислоты получают из цельной крови.

6. Способ по п.5, в котором указанная нуклеиновая кислота, выделенная из организма субъекта, является геномной нуклеиновой кислотой человека и указанная нуклеиновая кислота, выделенная из указанного патогенного микроорганизма, является геномной нуклеиновой кислотой.

7. Способ по п.1, в котором указанная нуклеиновая кислота, выделенная из организма указанного субъекта, является геномной нуклеиновой кислотой человека и указанная нуклеиновая кислота, выделенная из указанного патогенного микроорганизма, является РНК, при этом до выполнения реакции, описанной в п.(а), осуществляют обратную транскрипцию.

8. Способ по п.3, в котором указанная нуклеиновая кислота, выделенная из организма указанного субъекта, является геномной нуклеиновой кислотой человека и указанная нуклеиновая кислота, выделенная из указанного патогенного микроорганизма, является РНК, при этом до амплификации осуществляют обратную транскрипцию.

9. Способ по п.6, в котором указанный экстракт нуклеиновой кислоты получают при помощи набора для экстракции генома человека.

10. Способ по п.9, в котором указанный набор для экстракции генома человека является набором средней величины для экстракции ДНК из крови QIAamp.

11. Способ по п.1, в котором указанное конкретное заболевание является гепатитом и указанный патогенный микроорганизм является вирусом гепатита.

12. Способ по п.3, в котором указанное конкретное заболевание является гепатитом и указанный патогенный микроорганизм является вирусом гепатита.

13. Способ по п.11, в котором указанный первый зонд предназначен для обнаружения генотипа вируса гепатита С и указанный второй зонд предназначен для обнаружения SNP промоторной области МхА.

14. Способ по п.11, в котором указанный первый зонд предназначен для обнаружения генотипа вируса гепатита С и указанный второй зонд предназначен для обнаружения полиморфизма гена MBL.

15. Способ по п.11, в котором указанный первый зонд включает последовательность оснований по крайней мере одного типа, выбираемую из нижеследующей группы: (a) последовательность оснований, выбираемая из группы, состоящей из последовательностей оснований, представленных SEQ ID № 1, 2, 3 и 5; (b) последовательность оснований, выбираемая из группы, состоящей из последовательностей оснований, представленных SEQ ID № 5, 6 и 7; (c) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из (а) и (b); и указанный второй зонд включает последовательность оснований по крайней мере одного типа, выбираемую из нижеследующей группы: (at455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 16 в прилагаемом списке последовательностей; (bt455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (ct455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 16; (dt455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 16; (et455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемая из последовательностей оснований с (at455) по (dt455); (аg455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 17 в списке последовательностей; (bg455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (сg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 17; (dg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 17; (eg455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg455) по (dg455); (аа455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 18 в списке последовательностей; (bа455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (са455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 18; (da455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 18; (еа455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа455) по (da455); (ас455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 19 в списке последовательностей; (bс455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (сс455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 19; (dc455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 19; (ес455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас455) по (dc455); (аа420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 37 в прилагаемом списке последовательностей; (bа420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (са420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 37; (da420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа420) по (са420); (ас420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 38 в списке последовательностей; (bс420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (сс420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 38; (dc420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас420) по (сс420); (at420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 39 в списке последовательностей; (bt420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (ct420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 39; (at420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at420) по (ct420); (аg420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 40 в прилагаемом списке последовательностей; (bg420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (сg420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 40; (dg420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg420) по (сg420); (аg221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 41 в прилагаемом списке последовательностей; (bg221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (сg221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 41; (dg221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 41; (eg221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg221) по (dg221); (ас221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 42 в прилагаемом списке последовательностей; (bс221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (сс221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 42; (dc221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 42; (ec221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас221) по (dc221); (аа221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 43 в прилагаемом списке последовательностей; (bа221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (са221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 43; (da221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 43; (еа221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа221) по (da221); (at221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 44 в прилагаемом списке последовательностей; (bt221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (ct221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 44; (dt221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 44; (et221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at221) по (dt221); (аg54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 45 в прилагаемом списке последовательностей; (bg54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сg54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (dg54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (eg54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg54) по (dg54); (aa54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 46 в прилагаемом списке последовательностей; (bа54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (aa54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (са54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (da54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (еа54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (aa54) по (da54); (ас54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 47 в прилагаемом списке последовательностей; (bс54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сс54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (dc54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (ес54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас54) по (dc54); (at54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 48 в прилагаемом списке последовательностей; (bt54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (ct54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (dt54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (et54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at54) по (dt54); (аg52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 45 в прилагаемом списке последовательностей; (bg52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сg52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (dg52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg52-57) по (сg52-57); (аа52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 46 в прилагаемом списке последовательностей; (bа52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (са52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (da52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа52-57) по (са52-57); (ас52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 47 в прилагаемом списке последовательностей; (bc52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сс52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (dc52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас52-57) по (сс52-57); (at52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 48 в прилагаемом списке последовательностей; (bt52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (ct52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (dt52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at52-57) по (ct52-57).

16. Способ по п.12, в котором указанный первый зонд включает последовательность оснований по крайней мере одного типа, выбираемую из нижеследующей группы: (a) последовательность оснований, выбираемая из группы, состоящей из последовательностей оснований, представленных SEQ ID № 1, 2, 3 и 5; (b) последовательность оснований, выбираемая из группы, состоящей из последовательностей оснований, представленных SEQ ID № 5, 6 и 7; (c) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из (а) и (b); и указанный второй зонд включает последовательность оснований по крайней мере одного типа, выбираемую из нижеследующей группы: (at455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 16 в прилагаемом списке последовательностей; (bt455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (ct455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 16; (dt455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 16; (et455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемая из последовательностей оснований с (at455) по (dt455); (аg455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 17 в списке последовательностей; (bg455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (сg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 17; (dg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 17; (eg455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg455) по (dg455); (аа455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 18 в списке последовательностей; (bа455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (са455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 18; (da455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 18; (еа455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа455) по (da455); (ас455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 19 в списке последовательностей; (bс455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (сс455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 19; (dc455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 19; (ес455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас455) по (dc455); (aa420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 37 в прилагаемом списке последовательностей; (bа420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (aa420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (са420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 37; (da420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (aa420) по (са420); (ас420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 38 в списке последовательностей; (bс420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (сс420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 38; (dc420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас420) по (сс420); (at420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 39 в списке последовательностей; (bt420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (ct420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 39; (dt420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at420) по (ct420); (аg420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 40 в прилагаемом списке последовательностей; (bg420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (сg420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 40; (dg420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg420) по (сg420); (аg221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 41 в прилагаемом списке последовательностей; (bg221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (сg221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 41; (dg221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 41; (eg221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg221) по (dg221); (ас221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 42 в прилагаемом списке последовательностей; (bс221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (сс221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 42; (dc221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 42; (ес221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас221) по (dc221); (аа221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 43 в прилагаемом списке последовательностей; (bа221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (са221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 43; (da221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 43; (еа221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа221) по (da221); (at221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 44 в прилагаемом списке последовательностей; (bt221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (ct221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 44; (dt221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 44; (et221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at221) по (dt221); (аg54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 45 в прилагаемом списке последовательностей; (bg54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сg54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (dg54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (eg54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg54) по (dg54); (аа54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 46 в прилагаемом списке последовательностей; (bа54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (са54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (da54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (еа54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа54) по (da54); (ас54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 47 в прилагаемом списке последовательностей; (bс54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сс54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (dc54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (ес54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас54) по (dc54); (at54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 48 в прилагаемом списке последовательностей; (bt54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (ct54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (dt54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (et54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at54) по (dt54); (аg52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 45 в прилагаемом списке последовательностей; (bg52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сg52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (dg52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg52-57) по (сg52-57); (аа52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 46 в прилагаемом списке последовательностей; (bа52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (са52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (da52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа52-57) по (са52-57); (ас52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 47 в прилагаемом списке последовательностей; (bс52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сс52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (dc52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас52-57) по (сс52-57); (at52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 48 в прилагаемом списке последовательностей; (bt52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (ct52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (dt52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at52-57) по (ct52-57).

17. Способ по п.12, в котором указанную амплификацию выполняют при помощи PCR, используя смысловую цепь, представленную по крайней мере одной последовательностью оснований, выбираемой из группы, состоящей из последовательностей, представленных SEQ ID № 8 и 9, и антисмысловую цепь, представленную по крайней мере одной последовательностью оснований, выбираемой из группы, состоящей из последовательностей, представленных SEQ ID № 10, 11, 12, 13 и 14.

18. Подложка с иммобилизованными зондами для определения, во-первых, информации о нуклеиновой кислоте субъекта, подвергнутого конкретному заболеванию, и, во-вторых, информации о нуклеиновой кислоте из патогенного микроорганизма, присутствующего в организме указанного субъекта, где указанный патогенный микроорганизм имеет отношение к указанному конкретному заболеванию, которая включает подложку; первый зонд, иммобилизованный на подложке, который предназначен для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты, если таковая имеется, патогенного микроорганизма, вызывающего конкретное заболевание; второй зонд, иммобилизованный на подложке и имеющий последовательность оснований, отличающуюся от первого зонда, который предназначен для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты субъекта, если таковая имеется, определяющей восприимчивость данного субъекта к лечению конкретного заболевания.

19. Подложка с иммобилизованными зондами по п.18, где указанный патогенный микроорганизм является вирусом гепатита С и указанное лекарственное средство является интерфероном (IFN).

20. Подложка с иммобилизованными зондами по п.18, где указанная нуклеиновая кислота субъекта является промоторной областью МхА.

21. Подложка с иммобилизованными зондами по п.18, где указанная нуклеиновая кислота субъекта является геном, кодирующим MBL.

22. Подложка с иммобилизованными зондами по п.18, где указанный первый зонд предназначен для обнаружения генотипа вируса гепатита С.

23. Подложка с иммобилизованными зондами для определения, во-первых, информации о нуклеиновой кислоте субъекта, подвергнутого конкретному заболеванию, и, во-вторых, информации о нуклеиновой кислоте из патогенного микроорганизма, присутствующего в организме указанного субъекта, где указанный патогенный микроорганизм имеет отношение к указанному конкретному заболеванию, которая включает подложку; первый зонд, включающий по крайней мере одну последовательность, выбираемую из нижеследующей группы: (a) последовательность оснований, выбираемая из группы, состоящей из последовательностей оснований, представленных SEQ ID № 1, 2, 3 и 5; (b) последовательность оснований, выбираемая из группы, состоящей из последовательностей оснований, представленных SEQ ID № 5, 6 и 7; (c) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из (а) и (b); и второй зонд, иммобилизованный на подложке и включающий по крайней мере одну последовательность, выбираемую из нижеследующей группы: (at455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 16; (bt455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (ct455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 16; (dt455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 16; (et455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемая из последовательностей оснований с (at455) по (dt455); (аg455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 17; (bg455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (сg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 17; (dg455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 17; (eg455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg455) по (dg455); (аа455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 18; (ba455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (са455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 18; (da455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 18; (еа455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа455) по (da455); (ас455) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 19; (bc455) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас455), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 455 или добавления по крайней мере одного основания; (сс455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 441 по 455 последовательности, представленной SEQ ID № 19; (dc455) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 449 по 459 последовательности, представленной SEQ ID № 19; (ес455) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас455) по (dc455); (аа420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 37; (ba420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (са420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 37; (da420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа420) по (са420); (ас420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 38; (bc420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (сс420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 38; (dc420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас420) по (сс420); (at420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 39; (bt420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (ct420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 39; (dt420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at420) по (ct420); (аg420) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 40; (bg420) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg420), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 420 или добавления по крайней мере одного основания; (сg420) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 415 по 425 последовательности, представленной SEQ ID № 40; (dg420) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg420) по (сg420); (аg221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 41 в прилагаемом списке последовательностей; (bg221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (сg221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 41; (dg221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 41; (eg221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg221) по (dg221); (ас221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 42 в прилагаемом списке последовательностей; (bс221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (сс221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 42; (dc221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 42; (ес221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас221) по (dc221); (аа221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 43 в прилагаемом списке последовательностей; (bа221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (са221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 43; (da221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 43; (еа221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа221) по (da221); (at221) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 44 в прилагаемом списке последовательностей; (bt221) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at221), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 425 или добавления по крайней мере одного основания; (ct221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 418 по 432 последовательности, представленной SEQ ID № 44; (dt221) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 421 по 430 последовательности, представленной SEQ ID № 44; (et221) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at221) по (dt221); (аg54) последовательность оснований, представленная SEQ ID №45 в прилагаемом списке последовательностей; (bg54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сg54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (dg54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (eg54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg54) по (dg54); (аа54) последовательность оснований, представленная SEQ ID №46 в прилагаемом списке последовательностей; (bа54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (са54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (da54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (еа54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа54) по (da54); (ас54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 47 в прилагаемом списке последовательностей; (bс54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сс54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (dc54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (ес54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас54) по (dc54); (at54) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 48 в прилагаемом списке последовательностей; (bt54) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at54), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (ct54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 874 по 876 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (dt54) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 869 по 880 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (et54) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at54) по (dt54); (аg52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 45 в прилагаемом списке последовательностей; (bg52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аg52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сg52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 45; (dg52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аg52-57) по (сg52-57); (аа52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 46 в прилагаемом списке последовательностей; (bа52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (аа52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (са52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 46; (da52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (аа52-57) по (са52-57); (ас52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 47 в прилагаемом списке последовательностей; (bс52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (ас52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (сс52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 47; (dc52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (ас52-57) по (сс52-57); (at52-57) последовательность оснований, представленная SEQ ID № 48 в прилагаемом списке последовательностей; (bt52-57) модифицированная последовательность оснований, полученная модификацией последовательности, представленной (at52-57), путем делеции или замены нескольких оснований за исключением основания в положении 875 или добавления по крайней мере одного основания; (ct52-57) последовательность оснований, содержащая основания в положениях с 868 по 885 последовательности, представленной SEQ ID № 48; (dt52-57) комплементарная последовательность к последовательности оснований, выбираемой из последовательностей оснований с (at52-57) по (ct52-57).

24. Подложка с иммобилизованными зондами по п.18, где наличие специфических нуклеиновых кислот определяют электрохимическими способами.

25. Подложка с иммобилизованными зондами по п.23, где наличие специфических нуклеиновых кислот определяют электрохимическими способами.

26. Способ определения восприимчивости субъекта к лечению заболевания, вызываемого патогенным микроорганизмом, присутствующим в организме субъекта, который включает нижеследующие стадии: (а) взаимодействие экстракта нуклеиновых кислот, выделенных из организма указанного субъекта, с первым НК-зондом, который гибридизируется с нуклеиновой кислотой патогенного микроорганизма, вызывающего указанное заболевание, и со вторым НК-зондом, который гибридизируется с нуклеиновой кислотой-мишенью указанного субъекта, определяющей восприимчивость данного субъекта к лечению заболевания; и b) обнаружение указанной нуклеиновой кислоты указанного патогенного микроорганизма, которая связывается с указанным первым НК-зондом, и указанной нуклеиновой кислоты-мишени указанного субъекта, которая связывается с указанным вторым НК-зондом; после чего информацию о указанной нуклеиновой кислоте указанного патогенного микроорганизма, связывающейся с указанным первым НК-зондом, и указанной нуклеиновой кислоте-мишени указанного субъекта, связывающейся с указанным вторым НК-зондом, коррелируют с восприимчивостью указанного субъекта к лечению конкретного заболевания.

27. Способ по п.26, в котором зонды иммобилизованы на подложке.

28. Способ по п.26, который далее включает стадию амплификации указанной нуклеиновой кислоты, выделенной из организма указанного субъекта, до выполнения реакции, описанной в пункте а).

29. Способ определения подверженности субъекта заболеванию, который включает нижеследующие стадии: a) взаимодействие экстракта нуклеиновой кислоты, выделенной из организма указанного субъекта, с первым НК-зондом, который гибридизируется с нуклеиновой кислотой патогенного микроорганизма, вызывающего указанное заболевание, и со вторым НК-зондом, который гибридизируется с нуклеиновой кислотой-мишенью указанного субъекта, определяющей подверженность данного субъекта указанному заболеванию; и b) обнаружение указанной нуклеиновой кислоты указанного патогенного микроорганизма, которая связывается с указанным первым НК-зондом, и указанной нуклеиновой кислоты указанного субъекта, которая связывается с указанным вторым НК-зондом; после чего информацию о указанной нуклеиновой кислоте указанного патогенного микроорганизма, связывающейся с указанным первым НК-зондом, и указанной нуклеиновой кислоте указанного субъекта, связывающейся с указанным вторым НК-зондом, коррелируют с подверженностью указанного субъекта конкретному заболеванию.

30. Способ по п.29, в котором зонды иммобилизованы на подложке.

31. Способ по п.29, который далее включает стадию амплификации указанной нуклеиновой кислоты, выделенной из организма указанного субъекта, до выполнения реакции, описанной в пункте а).

32. Способ получения подложки с иммобилизованными зондами, включающими первый зонд, предназначенный для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты патогенного микроорганизма, вызывающего заболевание, и второй зонд, предназначенный для обнаружения специфической нуклеиновой кислоты субъекта, определяющей восприимчивость к лечению конкретного заболевания, который включает стадию иммобилизации первого зонда и второго зонда на подложке.

33. Способ по п.32, в котором указанную подложку выбирают из группы, состоящей из пластинчатой основы, пористого материала, микротитрационного планшета, гранул, сферического материала, гранулированного материала, магнитного материала или магнитных гранул.

Приоритет по пунктам:

27.03.2001 по пп.1-33;

18.09.2001 по пунктам, в которые внесены изменения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42