Штамм бифидобактерий bifidobacterium breve 79-119-мб, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания пробиотического назначения, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium breve 79-119-МБ получен путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 22,2 ед/мг белка микробной массы. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1691. Штамм активно размножается в питательных средах с накоплением необходимого титра жизнеспособных бактерий, обладает высокой кислотообразующей способностью и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, проявляет выраженную антиоксидантную активность. Супероксиддисмутазная активность культуры свидетельствует о выраженном пробиотическом действии, проявляемом в условиях in vivo и in vitro. Использование штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.

Широкий ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий дает возможность разрабатывать новые моно- и комплексные продукты функционального питания, лечебного питания и бакпрепараты, способные обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстанавливать его нормальную микрофлору, снижать заболеваемость различными кишечными инфекциями.

На настоящий момент разработан ряд бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов на основе отечественных штаммов бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-88, В breve 79-119 (RU 2176270 C1, 27.11.2001, RU 2078815 С1, 10.05.1997).

Качество продуктов функционального питания и бакпрепаратов обусловлено свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и производственно-ценными свойствами.

Известный штамм Bifidobacterium breve 79-119, используемый для приготовления лечебно-профилактических бифидосодержащих препаратов, кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов и биологически активных добавок, является наиболее близким аналогом к заявленному штамму. Штамм выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка в 1979 г., хранится в лиофилизированном состоянии и депонирован под №153 в Государственной коллекции микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека (ГНКМ) Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. Характерной особенностью штамма является его способность активно размножаться на питательных средах, принятых в производстве бактерийных препаратов с высоким содержанием микробных клеток за 16-24 ч культивирования с образованием сгустка нежной консистенции. Штамм энергичный кислотообразователь. Кислотообразующая активность: к 16 ч - 156°Т, к 24 ч - 164°Т на гидролизатно-молочной среде, на стерильном молоке - до 114°Т и 120°Т соответственно (RU 2078814 С1, 10.05.1997).

Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую активность при прохождении пищеварительного тракта.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium breve 79-119-МБ, обладающего высокой кислотообразующей способностью, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антагонистической и антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и бактериальных препаратов с высокими пробиотическими и лечебно-профилактическими свойствами.

Штамм В.breve 79-119-МБ получен из коллекционного штамма В.breve 79-119М путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антибиотической и антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 22,2 ед/мг белка.

В результате проведенной селекции получен штамм В breve 79-119-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1691 и характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки, изящные, с У-образными раздвоениями на одном или двух концах; неподвижные, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка образует колонии в виде комет. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 24 ч. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный анаэроб, оптимальная температура выращивания 37,5-38,0°С, рН 7,2-7,4. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до 4,1. Ферментирует лактозу, маннозу, целлобиозу, салицин, не ферментирует арабинозу, ксилозу, инулин, маннит, сорбит. Сбраживает молоко с образованием к 16-24 ч плотного сгустка.

Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 16 ч - 134°Т, к 20 ч - 148°Т, к 24 ч - 164°Т. Штамм максимально накапливает микробную массу бифидобактерий к 16 ч культивирования, достигая в 1 мл 8,3 lg 9 микробных клеток; максимально накапливает микробную массу бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования - 1-3 lg 9.

Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 18-22 ч культивирования.

Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам:

Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, а также к сульфадимезину (таблица 1).

Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.

Таблица 1
Антибиотическая устойчивость штамма В.breve 79-119-МБ
Антибиотики, единицы измерения активности, мкг/см3	доза	Титруемая кислотность молока после культивирования со штаммом, °T
Ампициллин	250	72-68
Бензилпенициллин, ЕД/см3	10000	95-93
Канамицин сульфат	20	117-115
Линкомицин	25	97-91
Стрептомицин	10	111-105
Амикоцин сульфат	10	79-73

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.breve 79-119-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину.

Штамм обладает выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S.aureus, Candida albikans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисломолочных продуктов (таблица 2).

Таблица 2 Сравнительные данные антагонистической активности штамма В.breve 79-119-МБ и B.breve 79-119
	Зоны задержки роста тест-культур (мм)
Штамм Бифидобактерий	Sh.Sonnei	Sh.Flexneri	E.coli	S.aureus	Pr.vulgaris
В.breve 79-119	16,2	18,7	18,2	16,7	19,2
B.breve 79-119-МБ	16,0-16,7	18,2-18,9	18-18,5	16,9-17	19,2-20

Анализ данных таблицы показывает, что заявляемый штамм обладает более высокой антагонистической активностью по отношению к основным тест-культурам.

У заявляемого штамма обнаружена выраженная антиоксидантная активность: супероксиддисмутазная активность штамма - 22,2 ед/мг белка микробной массы.

Условия хранения заявляемого штамма.

Свежеприготовленный штамм В.breve 79-119-МБ хранят на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.

Основным производственно-полезным признаком штамма В.breve 79-119-МБ, отличающим его от штамма В.breve 79-119, является то, что выращенная в стационарных условиях в стерильном обезжиренном молоке культура обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью: СОД-активность штамма В.breve 79-119-МБ составляет 22,2±1,8 ед/мг белка, содержащегося в микробной массе.

Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.

Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза, и способствует восстановлению бифидофлоры.

Установлено, что штамм В.breve 79-119-МБ не является бактериогенным и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.bifidum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий.

Использование заявленного штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например: кремов, салфеток, лосьонов тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств.

Пример 1. Использование штамма B.breve 79-119-МБ в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов.

1-й пассаж. Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведений до 10^-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж. Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (продукт). Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 10⁸ живых бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма B.breve 79-119-МБ в составе биологически активной добавки.

1-й пассаж. Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж. Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение биологически активной добавки. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к биомассе 3-го пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.

Пример 3. Использование штамма B.breve 79-119-МБ для получения бифидосодержащего препарата.

1-й пассаж. Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж. Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение бифидосодержащего препарата. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, титром бифидобактрий. К биомассе 3-го пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.

Пример 4. Использование штамма B.breve 79-119-МБ для получения кваса или сока.

1-й пассаж. Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (получение продукта). Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 10⁸. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.

Пример 5. Использование штамма B.breve 79-119-МБ для получения косметического средства.

1-й пассаж. Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-й пассаж. Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-й пассаж (получение косметического средства). Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 10⁹ клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium breve 79-119-МБ, ВКПМ Ac-1691, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.