Штамм бифидобактерий bifidobacterium adolescentis г 7513-мб, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания пробиотического назначения, гигиенических и косметических средств. Штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ получен путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 19,7 ед/мг белка микробной массы. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1690. Штамм В. adolescentis Г 7513-МБ активно размножается в питательных средах с накоплением необходимого титра жизнеспособных бактерий, обладает высокой кислотообразующей активностью, антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, проявляет выраженную антиоксидантную активность. Супероксиддисмутазная активность культуры свидетельствует о выраженном пробиотическом действии, проявляемом в условиях in vivo и in vitro. Использование штамма в производстве кисломолочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано в производстве продуктов функционального питания, неферментированных продуктов, фармпрепаратов, при приготовлении косметических и гигиенических средств.

Широкий ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий дают возможность разрабатывать новые моно- и комплексные продукты функционального питания, лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстанавливать его нормальную микрофлору, снижать заболеваемость различными кишечными инфекциями.

На настоящий момент разработан ряд бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания на основе отечественных штаммов бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis МС-42 и Bifidobacterium adolescentis Г 7513 (SU 863639 A1, 15.09.1981, RU 2120991 C1, 27.10.1998, RU 2109054 C1, 20.04.1998).

Качество продуктов функционального питания и бакпрепаратов обусловлены свойствами штамма-продуцента, его специфической активностью и производственно-ценными свойствами.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513, используемый для получения бифидосодержащих препаратов-эубиотиков и продуктов лечебно-профилактического питания. Штамм выделен из содержимого кишечника взрослого человека в 1975 г., хранится в лиофилизированном состоянии и депонирован под №158 в Государственной коллекции микроорганизмов-представителей нормальной микрофлоры человека ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Характерной особенностью штамма является его способность активно размножаться на питательных средах, принятых в производстве бактерийных препаратов с высоким содержанием микробных клеток за 16-24 ч культивирования с образованием сгустка нежной консистенции. Штамм энергичный кислотообразователь. Кислотообразующая активность: к 16 ч - 160°Т, к 24 ч - 164°Т на кукурузно-лактозной среде, на гидролизатно-молочной среде - до 166°Т и 202°Т, соответственно (RU 2120991 C1, 27.10.1998).

Известный штамм недостаточно устойчив к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий штамма в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную его колонизирующую способность и жизнеспособность.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление штамма Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, обладающего устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, выраженной антиоксидантной активностью, биологической активностью, высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение продуктов функционального питания, продуктов на его основе и препаратов с высокими лечебно-профилактическими свойствами.

Штамм В.adolescentis Г 7513-МБ получен из селекционного штамма В.adolescentis Г 7513 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на питательной тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление). Отбирали клоны по признаку максимального накопления биомассы бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке к 16 ч культивирования не менее lg 9, а также с выраженной антибиотической и антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность штамма не ниже 19,7 ед/мг белка микробной массы.

В результате проведенной селекции получен штамм В.adolescentis Г 7513-МБ, который депонирован и хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" за номером ВКПМ Ас-1690 и характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В печеночной среде Блаурокка и кукурузно-лактозной среде образует колонии в виде гвоздиков.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный анаэроб, оптимальная температура 37-38°С, рН 7,2-7,4.

Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L(+)-изомера молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 4,0-4,1. Ферментирует лактозу, арабинозу, ксилозу, целлобиозу, салицин, не утилизирует маннозу, маннит, инулин, сорбит. Сквашивает стерильное молоко с образованием к 16-20 ч стабильного плотного сгустка. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины - отсутствуют.

Кислотообразующая активность: при культивировании на стерильном обезжиренном молоке титруемая кислотность достигает к 16 ч - 96°Т, к 24 ч - 100°Т. Штамм максимально накапливает микробную массу бифидобактерий к 16-20 ч культивирования, достигая в 1 мл lg 9,0-9,4 микробных клеток; максимально накапливает микробную массу бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования, достигая в 1 мл 1-3 lg 9 микробных клеток.

Кислотообразующая активность: к 24 ч - 70°Т, к 72 ч - 90-100°Т (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 100°Т и 200°Т, соответственно;

- максимальный титр бифидобактерий в гидролизатно-молочной агаризованной среде через 24 ч культивирования составляет 1×10¹⁰ КОЕ/см³;

- максимальный титр бифидобактерий в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов через 24 ч культивирования составляет 1-3×10¹⁰ КОЕ/см³.

Штамм растет на общепринятых в производстве питательных средах с накоплением биомассы не менее lg 8-9 микробного числа за 18-20 ч культивирования.

Максимальное количество клеток, накапливаемое на тиогликолевой среде и кукурузно-лактозной среде к 20 ч очень близко и составляет 2×10⁹ КОЕ/см³.

ДНК штамма относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,58, молекулярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,35.

Антагонистические свойства, устойчивость к антибиотикам.

Штамм устойчив к антибиотикам: канамицину, линкомицину, амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, стрептомицину, тетрациклину, гентамицину, а также к сульфадимезину (см. таблицу 1).

Определение уровня устойчивости штамма к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде - стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-ти часовую культуру бифидобактерий в количестве 5%. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при 37-38°С.

таблица 1 Антибиотическая устойчивость штамма В.adolescentis Г 7513-МБ
Антибиотики, единицы измерения активности, Мкг/см3	Доза	Титруемая кислотность молока после культивирования со штаммом, °Т
Ампициллин	250	54-58
Бензилпенициллин, ЕД/см3	10000	85-91
Канамицин сульфат	20	128-132
Линкомицин	25	77-83
Стрептомицин	10	51-53
Сульфадимезин	50	42-44
Тетрациклин	10	38-40
Олеандомицин	12,5	42-46
Офлоксацин	20	62-66
Рифампицин	15	45-51

Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В.adolescentis Г 7513-МБ устойчив к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: к канамицину, бензилпенициллину, линкомицину, офлоксалину, ампициллину, стрептомицину.

У штамма наблюдается выраженная антагонистическая активность к патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Е.coli, S.aureus, Candida aibirans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaricus, Klebsiella pneumonia, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis (см. таблицу 2).

Таблица 2 Сравнение антагонистических свойств штаммов В.adolescentis Г 7513 и В.adolescentis Г 7513-МБ
Штамм бифидобактерий	Зона задержки роста тест-культур, (мм)
	Sh.Sonnei	Sh.Flexneri	Е.coli	Proteus vulgarus	S.aureus
В.adolescentis Г 7513	23,2	25,5	27,2	25,7	27,5
В.adolescentis Г 7513-МБ	24,3	25,9	27,7	26,1	28,3

Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшее антагонистическое действие штамм оказывает на Sh.sonnei, Е.coli, Proteus vulgarus, S.aureus, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при употреблении кисломолочных продуктов.

Условия хранения заявляемого штамма.

Свежеприготовленный штамм В.adolescentis Г 7513-МБ хранят на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Штамм хорошо хранится при 6-8°С без потери титра активности в течение года.

Основным производственно-полезным признаком штамма В.adolescentis Г 7513-МБ, отличающим его от штамма В.adolescentis Г 7513, является то, что выращенная в стационарных условиях на тиогликолевой среде в объеме 300 см³ культура, обладает выраженной супероксиддисмутазной активностью. СОД - активность штамма В. adolescentis Г 7513 МБ составляет 19,7±1,6 ед/мг белка, содержащегося в бактериальной массе. Выявленная СОД-активность культуры бифидобактерий свидетельствует о том, что штамм обладает выраженным пробиотическим действием, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, устойчивость штамма к основным антибиотикам, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.

Заявляемый штамм может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств, например: кремов, салфеток, лосьонов, тампонов, питательных масок, женских прокладок, мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению бифидофлоры.

Изобретение также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный штамм, способствует колонизации слизистой кишечника, вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза, и способствует восстановлению бифидофлоры.

Установлено, что штамм В.adolescentis Г 7513-МБ не является бактериогенньм и не обладает бактериоциноустойчивостью к штаммам бифидобактерий вида В.longum, и В.bifidum, что позволяет использовать его при совместном культивировании в заквасках, в составе комплексного бакпрепарата или консорциума бифидобактерий.

Пример 1. Использование штамма B.adolescentis Г 7513-МБ в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм бифидобактерий в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы титруют методом десятикратных разведений до 10^-9 и выращивают при 37,5-38°С до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы вносят в емкость с питательной средой и выращивают до появления отдельных колоний в последних разведениях. Или 1 дозу сухой биомассы штамма вносят в емкость с питательной средой и выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж - (продукт) Полученную биомассу в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 10⁸ живых бифидобактерий.

Пример 2. Использование штамма B.adolescentis Г 7513-МБ в составе биологически активной добавки.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-ый пассаж - Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение биологически активной добавки - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку для этого к биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁷/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением.

Пример 3 Использование штамма B.adolescentis Г 7513-МБ для получения бифидосодержащего препарата.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5°С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 10⁸/мл.

3-ый пассаж - Полученную маточную культуру в количестве не более 5% вносят в питательную среду и выращивают при 37,5-38°С.

Получение бифидосодержащего препарата - Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл титром бифидобактрий. К биомассе 3-его пассажа добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45°С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸/мл, который можно использовать в качестве бифидосодержащего препарата.

Пример 4. Использование штамма B.adolescentis Г 7513-МБ для получения кваса или сока.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (получение продукта) - Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета, чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 10⁸. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения.

Пример 5. Использование штамма B.adolescentis Г 7513-МБ для получения косметического средства.

1-ый пассаж - Лиофилизированный штамм в количестве 0,1 г сухой биомассы активизируют путем посева в питательную среду. Выращивают при 37,5-38°С до получения биомассы с содержанием микробных клеток, не менее 10⁸/мл.

2-ой пассаж - Выросшую культуру в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с содержанием клеток не менее 10⁸/мл.

3-ий пассаж (получение косметического средства) - Выросшую биомассу в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,5-38°С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 10⁹ клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема.

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, ВКПМ Ac-1690, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.