Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных

Изобретение относится к медицине и экспериментальной биологии. Способ включает введение белкового препарата подкожно. В качестве белкового препарата вводят сирийским хомякам нативную бычью плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента. Способ обладает высокой эффективностью. 5 ил.

 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей.

Амилоидоз - стромально-сосудистый диспротеиноз, характеризующийся отложением в тканях и органах аномальных фибриллярных белков, предшественников амилоида - сложного гликопротеина, в котором фибриллярные и глобулярные белки находятся в тесной связи с гликозаминогликанами. Обладая химической инертностью и иммунологической толерантностью, амилоид безудержно накапливается в органах и тканях в больших количествах, становясь морфологическим субстратом многих заболеваний и патологических процессов. Выраженный амилоидоз приводит к атрофии и склерозу органов, что сопровождается развитием их функциональной недостаточности (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan-Mar-6 (1 Pt 2). P. - 107-116).

В связи с этим возникла насущная необходимость создания и разработки способов моделирования амилоидоза для получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза.

Внимание привлекла нативная бычья плазма своей доступностью, природной стерильностью, изотоничностью, постоянной концентрацией, стабильной рН, отсутствием побочных примесей.

Известен классический способ моделирования экспериментального амилоидоза (Грицман А.Ю. Некоторые вопросы экспериментальной терапии амилоидоза и резобции амилоида. // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук, М., 1974), заключающийся в введении белым мышам через день по 0,5 мл 5% казеината натрия подкожно в течение 60 дней, который был взят нами за аналог.

Недостатком аналога является то, что приготовление раствора казеината связано с определенными сложностями, такими как поиск чистого казеина, необходимость растворения его точной навески в кипящем 0,25% растворе гидроокиси натрия, фильтрование, стерилизация, хранение. Готовый раствор казеината натрия имеет щелочную реакцию, высокое содержание натрия, что резко ограничивает применение данной модели при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.

Наиболее близким является способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных (патент РФ на изобретение №2269825, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 10.02.2006, заявка №2004127649/14, от 15.09.04. МПК G09B 23/28), заключающийся в введении белым мышам через день по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно в течение 30 дней, который был взят нами за прототип.

Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции нативной бычьей плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес. в течение 60 дней.

Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая то, что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек и системы кровообращения из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно.

Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных имеет следующие существенные признаки: животным проводятся подкожные инъекции нативной бычьей плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес. в течение 60 дней.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что применяется нативная бычья плазма для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании системы кровообращения, функционального состояния почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных. Введение нативной бычьей плазмы приводит к развитию системного вторичного амилоидоза с преимущественным поражением селезенки, печени, почек в течение 60 дней эксперимента.

Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется выше указанная возможность получения способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно, отличающегося тем, что в качестве белкового препарата вводят сирийским хомякам нативную бычью плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции нативной бычьей плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес. в течение 60 дней.

Нативная бычья плазма получается из крови быков, забиваемых на бойне. Кровь из сонной артерии собирается в стерильный сосуд емкостью 3 л с добавлением гепарина из расчета 5000 ЕД/л крови. Емкость закрывается стерильной полиэтиленовой крышкой. Стабилизированная кровь разливается в центрифужные пробирки и центрифугируется в течение 20 минут при 3000 оборотах в минуту. Полученная плазма собирается с помощью стерильного шприца емкостью 20 мл, разливается в пластиковые пробирки и замораживается при температуре -10° С. Перед произведением инъекций плазма размораживается при температуре 30°С.

По истечении времени эксперимента (2 мес.) животные забиваются под наркозом. Морфологическому исследованию на предмет амилоидоза (окраска гематоксилином и эозином, конго-красным) подвергаются внутренние органы, кровеносные сосуды. Образцы тканей фиксируются в 10% нейтральном формалине, с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго-красным. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.

Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически:

Фиг.1. Очаговые воспалительные инфильтраты в миокарде, явления эндо- и периваскулита, очаговые отложения амилоида, паренхиматозная дистрофия и очаги кровоизлияний.

Фиг.2. Отложения амилоида в стенках сосудов, в основном в интиме и мышечном слое. Утолщение и разрыхление стенок сосудов.

Фиг.3. Отложение амилоида в печени преимущественно в центрах долек вокруг сосудов.

Фиг.4. Отложение амилоида в канальцах почек. Выраженная паренхиматозная дистрофия канальцев.

Фиг.5. Отложение амилоида в селезенке преимущественно вокруг лимфоидных фолликулов.

Пример 1. Проведены серии опытов из 2-х групп:

1-я группа - контрольная (20 сирийских хомяков-самцов).

2-я группа (20 сирийских хомяков-самцов) - (амилоидная) - животным проводились подкожные инъекции нативной бычьей плазмы через день из расчета 0,025 мл/г массы тела сирийских хомяков-самцов в возрасте 5-6 мес. в течение 60 дней.

Морфологическому исследованию на предмет амилоидоза (окраска конго-красным) подвергнуты внутренние органы, кровеносные сосуды.

В результате проведенных исследований получены морфологические доказательства эффективности применения нативной бычьей плазмы для моделирования экспериментального амилоидоза у животных.

Гистологически у 2-ой группы животных в миокарде (фиг.1) обнаруживались очаговые воспалительные инфильтраты, явления эндо- и периваскулита, очаговые отложения амилоида, паренхиматозная дистрофия и очаги кровоизлияний. В стенках сосудов (фиг.2) отмечались отложения амилоида, в основном в интиме и мышечном слое, что приводило к утолщению и разрыхлению стенок сосудов. В печени (фиг.3) амилоид откладывался преимущественно в центрах долек вокруг сосудов. В почках (фиг.4) амилоид обнаруживался по ходу прямых сосудов и собирательных трубок. В интермедиарной зоне и пирамидах строма пропитывалась белками плазмы. Амилоид откладывался не только в пирамидах, но и в клубочках. В селезенке (фиг.5) амилоид откладывался перифолликулярно, отмечалась гиперплазия лимфоидной ткани.

Исходя из полученных результатов исследования обосновывается использование нативной бычьей плазмы для моделирования амилоидоза.

Из вышеизложенного следует, что введение нативной бычьей плазмы животным является эффективным способом моделирования экспериментального амилоидоза.

Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающий введение белкового препарата подкожно, отличающийся тем, что в качестве белкового препарата вводят сирийским хомякам нативную бычью плазму через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента.