Лекарственное средство на основе d-циклосерина, препарат пролонгированного действия, содержащий наночастицы, способ его получения
Владельцы патента RU 2318513:
Автономная некоммерческая организация "Институт молекулярной диагностики" (АНО "ИнМоДи") (RU)
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных препаратов регулируемого действия на основе циклосерина, содержащих наночастицы. Для получения этого препарата средство, содержащее смесь из D-циклосерина, PLGA 50/50, D-маннита, полисорбата 80 и диметилсульфоксида в определенном соотношении нагревают при 50-60°С до образования однородной прозрачной жидкости, которую далее охлаждают до комнатной температуры и после разбавления водой образующуюся суспензию, содержащую наночастицы размеров 3.0±0.5 нм (˜20% от общего количества частиц) и ˜200 нм (˜80% от общего количества частиц), используют по назначению. Изобретение обеспечивает получение препарата, обладающего высокой антимикробной активностью, пролонгированным действием, относительной безвредностью и низкой токсичностью. 3 н.п. ф-лы., 4 табл.
Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к новому поколению противомикробных средств регулируемого действия на основе D-циклосерина.
Циклосерин - D-4-амино-3-изоксазолидинон - обладает широким спектром антибактериальной активности и назначается больным хроническими формами туберкулеза, у которых ранее применявшиеся основные препараты перестали оказывать эффект [1]. В этой связи циклосерин применяется как для лечения туберкулеза легких в активной форме и внелегочного туберкулеза (включая туберкулез почек), так и для лечения острых инфекций мочевыводящих путей, вызванных чувствительными штаммами грамположительных и грамотрицательных бактерий, в особенности видами Klebsiella/Enterobacter и Escherichia coli.
Вместе с тем при лечении циклосерином наблюдаются побочные явления, связанные с токсическим влиянием препарата на центральную нервную систему. Так, при приеме циклосерина более 500 мг в сутки у больных фиксировались судороги, сонливость, головная боль, тремор, головокружение, потеря памяти, психозы, возможно, с попытками самоубийства, изменения характера и повышенная раздражительность.
Уменьшение токсического действия циклосерина достигается назначением в период лечения либо глутаминовой кислоты (по 0,5 г 3-4 раза в день), либо внутримышечным введением натриевой соли аденозинтрифосфорной кислоты (по 1 мл 1% раствора ежедневно), либо внутримышечной инъекцией пиридоксина (1-2 мл 5% раствора в сутки). Запатентован оригинальный способ преодоления токсичности циклосерина путем его применения в желатиновых капсулах, содержащих 2-5 мас.% глутаминовой кислоты [2]. Это наиболее близкий аналог, который не дает возможности получить средство в виде наночастиц, которые дают пролонгированное действие.
Циклосерин быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта после приема внутрь, создавая обнаруживаемые уровни в плазме в течение одного часа. Он свободно распределяется по жидкостям и тканям организма. Около 66% дозы обнаруживается в неизменном виде в моче в течение 24 часов, 10% выводятся в течение следующих 48 часов. Около 35% метаболизируется, период полувыведения циклосерина колеблется в пределах 8-12 часов.
По своей молекулярной структуре циклосерин напоминает D-аланин и является мощным ингибитором аланинрацемазы. Он ингибирует также АТФ-зависимую D-аланил-D-аланин-синтетазу, необходимую для биосинтеза пептидоглюкана стенок бактериальной клетки, в частности Micobacterium tuberculosis [3-4].
Следует отметить, что в растворах циклосерин существует в нейтральной и диполярной формах, обладает амфотерными свойствами, рКа 4.4 и 7.3 [5], нестабилен в нейтральных и кислых водных средах [6].
Из анализа приведенных выше информационных материалов закономерно формулируется цель настоящего изобретения, а именно: создание лекарственного средства и препарата на основе циклосерина, уменьшающего токсичность активного вещества, обладающего пролонгацией действия при сохранении антимикробной активности стабильного при хранении и упрощение получения препарата.
Поставленная цель достигается использованием циклосерина в препарате, содержащем наночастицы, и базируется на современных достижениях фармакологии и медицины. Так, после проникновения M.tuberculosis в организм человека в качестве первой защитной реакции развивается фагоцитоз. Процесс взаимодействия легочных макрофагов с этими бактериями очень сложен [7]. При этом оптимизировать биораспределение противомикробного препарата можно лишь путем снижения его накопления в печени. Уменьшение эффективности фагоцитоза в печени достигается за счет применения наночастиц лекарственного препарата с неионогенными поверхностно-активными веществами (ПАВ), к примеру, полисорбата 80, что позволяет снизить накопление частиц в печени и увеличить время их циркуляции в организме («стелс-эффект») [8]. В этом плане значимые результаты были достигнуты при разработке наносомальной лекарственной формы рифампицина на полибутилцианоакрилате [9]. Имеются и другие данные о высокой эффективности наносомальных препаратов при лечении, в частности туберкулеза [10, 11]. За рубежом были разработаны противоонкологические препараты на основе наночастиц сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) [12], которые под названиями декапептил, золадекс, сандостатин и соматулин разрешены к применению в медицинской практике Российской Федерации. Сополимер PLGA [50/50 Poly(DL-lactide-co-glycolide) (nominal)] нетоксичен и в организме человека подвергается биодеградации с образованием молочной и гликолевой кислот, катаболизм которых завершается образованием двуокиси углерода и воды [13].
Еще один аспект рассматриваемой проблемы связан с противопоказаниями применения циклосерина при наличии у больных тяжелой почечной недостаточности (клиренс креатинина менее 250 мл/мин) [1], которая преодолевается с помощью осмотических диуретиков, к примеру D-маннита [14].
Таким образом, из приведенных выше данных следует, что новое лекарственное средство и препарат на основе циклосерина потенциально должны содержать биодеградируемый полимер (PLGA), ПАВ (полисорбат 80) и D-маннит. В патентной литературе описано множество способов получения наночастиц, содержащих лекарственные или диагностические средства на биодеградируемых полимерах. К настоящему моменту эти методы суммированы в двух основополагающих патентах: эмульгирование с последующим лиофильным высушиванием [15] и механическое дробление в присутствии измельчающей среды [16]. При этом особое внимание обращает на себя тот факт, что для достижения эффективного всасывания препаратов в желудочно-кишечном тракте нужно, чтобы диаметр частиц был менее 500 нм [17].
Апробация известных методов нанотехнологии применительно к циклосерину не привела к успеху в силу его нестабильности в нейтральных и кислых водных средах [6]. В этой связи нами был разработан новый способ получения лекарственного препарата регулируемого действия на основе циклосерина, содержащего наночастицы. Предлагаемый способ базируется на упорядоченной структуре диметилсульфоксида (ДМСО), которая разрушается в интервале температур 40-60°С и возобновляется при 20-25°С [18]. При этом ДМСО способен к координационной сольватации с рядом органических и неорганических соединений, стабилизируя лабильные вещества [19]. Это в полной мере относится и к D-циклосерину, существующему в диполярной форме [5], и к PLGA, и к D-манниту. Дефицит электронной плотности на атоме углерода и нуклеофильность атома кислорода карбонильных групп PLGA способствуют образованию в жидком ДМСО агрегатов цепочечного строения. Получение упорядоченной матрицы становится определяющим событием при комплексном использовании ДМСО, циклосерина, PLGA и D-маннита в силу возникновения водородных связей за счет последнего ингредиента. Система стабилизированна и может быть использована по назначению. Необходимость применения неионогенных ПАВ (полисорбата 80) была рассмотрена ранее. При разведении полученного средства водой образуется устойчивая аполесцирующая суспензия, содержащая наночастицы размеров 3.0±0.5 нм (˜20% от общего количества частиц) и ˜200 нм (˜80% от общего количества частиц), которые могут эффективно всасываться в желудочно-кишечном тракте согласно вышеприведенным данным относительно размеров частиц [17].
Следует подчеркнуть, что экспериментальным путем были найдены такие соотношения циклосерина, PLGA, D-маннита, полисорбата 80 и ДМСО, при которых образуется средство жидкое, однородное, прозрачное и стабильное свыше года при комнатных условиях. При оценке стабильности качества образцов полученного затем препарата были использованы классические методы визуального контроля и рефрактометрического анализа. Рефрактометрия является интегральным методом оценки подлинности и чистоты веществ, позволяет определять концентрацию веществ в растворах и применяется в фармакопеи не одно десятилетие [20].
Обсуждая состав рассматриваемых средства и препарата, нельзя обойти вниманием вопрос о перспективах применения ДМСО в медицине. Так, внутримышечное введение больным алкогольной зависимостью дисульфирама в ДМСО приводит к длительному сенсибилизирующему эффекту [21]; при наружном применении ДМСО используется в комплексной терапии ревматоидного артрита, болезни Бехтерева, дискоидной красной волчанке, тромбофлебите, фурункулезе и экземе [22]; для лечения амилоидоза ДМСО применяют перорально до 100-200 мл 3-5% раствора в воде в сутки [23].
В целом, суммируя вышесказанное, впервые предложен лекарственный препарат регулируемого действия на основе циклосерина, содержащий наночастицы. Вначале получают раствор циклосерина, PLGA, D-маннита и полисорбата 80 в ДМСО. Затем аликвоту этой смеси разбавляют водой и получают устойчивую коллоидную систему, состоящую из наночастиц, и готовую к применению.
Оптимальный состав нового средства следующий, мас.%:
| D-циклосерин | 0,75-2,50 |
| PLGA 50/50 | 1,25-7,50 |
| D-маннит | 1,25-7,50 |
| Полисорбат 80 | 0,5-1,0 |
| ДМСО | остальное |
При других соотношениях ингредиентов, как было установлено экспериментально, происходит либо потеря антимикробной активности, либо увеличение токсичности, либо нежелательные изменения в размерах полимерных частиц. Оптимальное разбавление средства в воде соответствует соотношению от 1:20 до 1:10, что может быть использовано для регулировки дозирования препарата в зависимости от индивидуальных особенностей больного.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. Способ получения средства на основе D-циклосерина
В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и термометром, при температуре 20-25°С последовательно загружают D-циклосерин, PLGA 50/50, D-маннит, полисорбат 80 и ДМСО. Смесь перемешивают и нагревают до 50-60°С в течение 15-20 мин до полного растворения твердой фазы, после чего охлаждают до комнатной температуры за 20-30 мин.
Состав граничных препаратов представлен в таблицах 1 и 2.
| Таблица 1 | ||
| Состав препаратов №1 | ||
| № пп | Наименование компонента | мас.% |
| 1. | D-Циклосерин | 0.75±0.05 |
| 2. | PLGA 50/50 | 7.50±0.10 |
| 3. | D-Маннит | 7.50±0.05 |
| 4. | Полисорбат 80 | 0.75±0.05 |
| 5. | Диметилсульфоксид | 83.50±0.20 |
| Таблица 2 | ||
| Состав препаратов №2 | ||
| № пп | Наименование компонента | мас.% |
| 1. | D-Циклосерин | 2.50±0.10 |
| 2. | PLGA 50/50 | 1.25±0.10 |
| 3. | D-Маннит | 1.25±0.10 |
| 4. | Полисорбат 80 | 0.80±0.05 |
| 5. | Диметилсульфоксид | 94.20±0.20 |
Указанные выше примеры средства представляют собой прозрачные однородные жидкости светло-желтого цвета, устойчивые при хранении свыше года. При добавлении к ним воды в соотношении 1:20-1:10 образуются устойчивые опалесцирующие суспензии, определение размеров частиц которых приведены в примере 2.
Пример 2. Анализ размеров частиц препаратов.
Определение размеров частиц и распределение частиц по фракциям осуществляли методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD фирмы Coulter Electronics (Франция-США). Алгоритм измерений основан на программе CONTIN.
Образцы препаратов при разбавлении средства водой №1 и №2 циклосерина в количествах 3.5 мг вносили в кювету с дистиллированной водой (3 мл) и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 1 мин с помощью ультразвуковой ванны (Westwood Ultrasonics Ltd, Model 90S). Затем производили измерения. Результаты представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||||||
| Результаты анализа размеров частиц образцов препаратов №1 и №2 | ||||||||
| №№ композиции | Унимодальный анализ | Распределение частиц | Распределение размеров частиц по фракциям | |||||
| Значение размера нм | Стандартное отклонение нм | Среднее значение нм | Стандартное отклонение нм | Коэффициент вариации % | Размер нм | Стандартное отклонение нм | Кол-во % | |
| 1 | 145 | 47 | 126 | 81 | 64 | 3.0 | 0.5 | 21 |
| 158 | 33 | 79 | ||||||
| 2 | ||||||||
| 148 | 31 | 133 | 94 | 71 | 3.0 | 0.5 | 23 | |
| 172 | 95 | 77 |
Пример 3. Элиминирование ингредиентов из препаратов.
Сравнительное исследование элимирования ингредиентов из препаратов осуществляли в условиях сменного диализа в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7.5) при комнатной температуре.
Для приготовления фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) (рН 7.5) применяли таблетки PBS Tablets phosphate buffered saline (AMRESCO). Одна таблетка на 100 мл дистиллированной воды.
В качестве диализных мешков использовали ленту Dialysis tubing, high retention. Size: 23 mm × 15 mm (Sigma-Aldrich). Предел исключения 12 кДа. Предварительно отрезки диализной ленты (10 см) кипятили в ˜0.001 М растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты в течение 1 ч.
Сосудами для проведения диализа служили мерные цилиндры емкостью 250 мл с крышками. Перемешивание диализной жидкости в ламинарном режиме осуществляли при помощи магнитных мешальников в тефлоновой оболочке и магнитной мешалки RH-KT/S (IKA®, Германия).
Измерение оптических плотностей растворов проводили на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония).
Для взвешивания использовали аналитические весы VIBRA (max/d 220/0.0001 г) (Япония).
Для отбора проб применяли пипетку (1-5 мл) и пластиковые наконечники (BIOHIT) (Финляндия).
Диализу были подвергнуты следующие препараты:
(1) ДМСО(1.33 г).
(2) Раствор в воде циклосерина (2.5 мг циклосерина +0.34 мл воды).
(3) Композиция №1 (0.3361 г).
В подготовленные диализные мешки (емкость около 5-6 мл) с помощью пипетки помещали перечисленные жидкие образцы. Мешки, загерметизированные с помощью зажимов, помещали в сосуды для диализа с 250 мл буферного раствора, закрепляли нитью, закрывали крышкой и включали перемешивание.
Периодически проводили отбор проб диализатов (по 3 мл) в стеклянные пробирки емкостью 10 мл. В пробах измеряли оптическую плотность при λ 207 и 226 нм против чистого раствора PBS. Затем пробы возвращали обратно в сосуды для диализа. Было проведено 2 смены диализатов. Продолжительность экспериментов составила 1-2 суток.
Установлено:
1. Элиминирование ДМСО из препарата (1) завершилось через 3 ч, а диализ циклосерина из препарата (2) прекратился через 2 ч.
2. Элиминирование циклосерина и ДМСО из препарата №1 не завершилось даже через сутки.
Таким образом, правомерно считать, что пролонгация действия циклосерина увеличится до 10 раз в случае применения препарата №1 в сравнении с индивидуальным циклосерином.
Однотипные данные получены и для препарата №2.
Пример 4. Оценка противомикробной активности препаратов
Определение противомикробной активности образцов препаратов в отношении тест-культур грамположительных, грамотрицательных и атипичных бактерий осуществляли методом серийных микроразведений в жидкой среде в соответствии с рекомендациями NCCLS/24/ при визуальной регистрации видимого роста. Динамическое измерение оптической плотности проводили с помощью многоканального спектрофотометра Bioscren (Labsystems) при длине волны 610 нм с интервалом 20 мин. Планшеты с бактериальными суспензиями инкубировали при 37°С в термостатируемом модуле прибора. Исходная концентрация микроорганизмов составляла 5×104 КОЕ/мл. Полученные результаты суммированы в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||
| Антибактериальная активность образцов препаратов | ||||
| Препарат | Концентрации препарата, % | Зоны задержки роста микроорганизмов, мм | ||
| Staphylococus aureus АТСС 906 | Escherichia coli АТСС 25022 | Salmonella spp. (атипичная форма) | ||
| ДМСО | 100 | 6.5 | 8 | 8 |
| 10 | - | 7 | 7 | |
| 5 | - | 7 | - | |
| Циклосерин 2.5% р-р в ДМСО | 100 | 19 | 20 | 20 |
| 10 | - | 7 | 11 | |
| 5 | - | 7 | - | |
| Препарат №1 | 100 | - | - | - |
| 10 | - | - | - | |
| 5 | - | - | - | |
| Препарат №2 | 100 | 24 | 18 | 19 |
| 10 | - | 11 | 11 | |
| 5 | - | 10 | 7 |
Пример 5. Оценка токсичности препаратов.
Определение токсичности образцов препаратов осуществлялось согласно общепринятым методикам [25].
В исследованиях на 2-х видах животных обоего пола - мышах линии Balb-C и крысах Wistar установлено, что готовый к употреблению препарат (10% раствор средства №1 и №2) при однократном введении внутрь в дозе эквивалентной эффективной разовой терапевтической дозе циклосерина для человека (250 мг), а также в дозах, в 5 и 10 раз ее превосходящих, не производило токсического действия.
Источники информации
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. 4.2. / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.381-382.
2. Нестерук В.В., Сыров К.К. Лекарственное средство в виде желатиновой капсулы. / Патент РФ №2248205 С1. - 2003 г.
3. Gaie E.F., Cundliffe E., Reynolds P.E. et al. The Molecular Basis of Antibiotic Action. / Wiley. - New York. - 1972. - P.61-71.
4. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. Т.2. М.: Мир, 1980. - С.223-225.
5. Химическая энциклопедия: В 5 т.: т.5. Триптофан-Ятро-химия/Редкол.: Зефиров Н.С.(гд. ред.) и др. М.: Большая Российская энциклопедия, 1998. - С.740.
6. The Merck Jndex, 12 ed. (1996), N 2820, P.464.
7. Хоменко А.Г. Современные представления о патогенезе туберкулеза. // Русск. мед. журн. - 1998. - Т.6. - №17. - С.810-814.
8. Moghimi S.M., Hunter AC, Murrey J.C. Long-circulating and targetspecific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol. Rev. - 2001. - V.53. - P.283-318.
9. Оганесян Е.А., Будько А.П., Стукалов Ю.В. и др. Разработка и изучение наносомальной лекарственной формы рифампицина. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - T.5 -. - Вып.8-9. - C. 15-19.
10. Khuller G.K., Pandey R. Sustained release drug delivery systems in management of tuberculosis. // J. Chest. Dis. Allied Sci. - 2003. - V.45. - P.229-230.
11. Pandey R., Zahoor A., Sharma S., Khuller G.K. Nanoparticle encapsulated antitubercular drugs as a potential oral drug delivery system against marine tuberculosis. // Tuberculosis. - 2003. - V.83. - N6. - P.373-378.
12. Ruth Duncan. Polymer conjugates as anticancer nanomedicines // Nature Reviews CancerYAOP, published online 10 August 2006; doi: 10.1038/nrc 1958
(www.nature.com/revuews/cancer).
13. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. М.: Академкнига. - 2006. - 400 С.
14. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч.1. / 12-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 1993. - С.586-597.
15. Фанг Джна-Хва, Сингх Манмохан, О′Хейган Дерек, Хора Маниндер. Композиции микрочастиц и способы их получения. / Патент РФ №227198 С.2. - 2005 г.
16. Сиджфрид К.Джун. Частицы, включающие плохо растворимое кристаллическое терапевтическое или диагностическое средство и способ их получения. / Патент РФ №2124886 С1. - 1999 г.
17. Вранккс Анри, Демустье Мартин, Делеер Мишель. Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения. / Патент РФ №2145498 С1. - 1994 г.
18. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид - важнейший апротонный растворитель. // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - №9. - С.54-59.
19. Оаэ С. Химия органических соединений серы. / Пер. с японск. М.: Мир, 1975 - С.223-278.
20. Государственная фармакопея СССР. Выпуск 1. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1987. - С.24-30.
21. Собетов Б.Г., Собетова В.Б., Алексеевич Я.И., Озеров Б.Г., Меркулов СП. Способ получения инъекционной формы дисульфирама. / Патент РФ №2013090 С1. - 1994 г.
22. Димексид. Регистрационный номер РФ: PN 003411/01 от 22.04.2005.
23. Лечение амилоидоза. Московская многопрофильная клиника. htth://clinic.inventech.ru/urologv/urologv.0273shtml.
24. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard M-7-A4./4th ed. Villanova.
25. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. 4.1. Совместное издание программы ООН по окружающей среде и Всемирной организации здравоохранения, ВОЗ, Женева - 1981 г.
1. Лекарственное средство, обладающее антимикробным действием, характеризующееся тем, что оно содержит D-циклосерин, сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50), D-маннит, полисорбат 80, диметилсульфоксид (ДМСО) при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| D-Циклосерин | 0,75-2,50 |
| PLGA 50/50 | 1,25-7,50 |
| D-Маннит | 1,25-7,50 |
| Полисорбат 80 | 0,5-1,0 |
| Диметилсульфоксид | Остальное |
2. Препарат пролонгированного действия, характеризующийся тем, что содержит средство по п.1, которое при разбавлении его водой в соотношении 1:20 до 1:10 представляет собой суспензию наночастиц с размером частиц от 3 до 200 нм, в эффективной дозе.
3. Способ получения препарата по п.2, характеризующийся тем, что в емкость последовательно загружают D-циклосерин, PLGA 50/50, D- маннит, полисорбат 80 и ДМСО, смесь перемешивают и нагревают до 50-60°С в течение 15-20 мин до полного растворения твердой фазы, после чего охлаждают до комнатной температуры за 20-30 мин, при добавлении к смеси воды в соотношении 1:20 до 1:10 получают суспензию наночастиц с размером частиц от 3 до 200 нм.
