Антибактериальное средство для лечения внутриклеточных инфекций

Антибактериальное средство содержит в качестве лекарственного вещества моксифлоксацин иммобилизованный на полимерном носителе. В качестве полимерного носителя средство содержит наночастицы размером 100-800 нм полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в указанных сополимерах до 50 мольных %, при этом молекулярная масса указанных полимеров и сополимеров составляет от 5 до 300 кДа. Средство также содержит холестерилсульфат калия или гликохолат натрия и водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с молекулярной массой не более 70 кДа, выбранный из группы, включающей поливиниловый спирт, полинилпирролидон, полоксамер, полоксамин и сывороточный альбумин, и наполнитель, в указанных в формуле изобретения количествах. Средство может дополнительно содержат растворитель - воду или водосодержащие смеси. Изобретение позволяет направленно доставлять моксифлоксацин в очаг патологии и регулировать скорость его высвобождения из полимерной матрицы, что обеспечивает снижение применяемых доз антибиотика, уменьшение токсичных эффектов и позволяет преодолеть резистентность возбудителей инфекций. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Изобретение относится к области медицины и фармакологии, конкретно к лекарственным средствам для лечения бактериальных внутриклеточных инфекций, в первую очередь туберкулеза легких и септических инфекций.

В последние годы наблюдается значительный рост заболеваемости туберкулезом легких во всех странах мира, что связано с появлением резистентных штаммов и распространением заболеваний иммунной системы, в том числе СПИДа. По оценкам ВОЗ в период до 2020 года количество вновь инфицированных туберкулезом достигнет 1 миллиарда, 200 миллионов человек заболеют и 35 миллионов умрут от туберкулеза, если не будут найдены новые более эффективные средства лечения.

Среди бактериальных инфекций все более актуальной становится также проблема сепсиса, в том числе внутрибольничного. Это связано с увеличением числа больных сепсисом, высокой летальностью при этом заболевании и значительными экономическими затратами на его лечение. Так, по данным официальной статистики, в США в 70-80-е годы количество зарегистрированных случаев возросло в 4 раза: с 70000 до 300000 случаев в год, а в 90-е годы - до 600000. При этом летальность при сепсисе остается очень высокой, достигая 50%. Высоки также материальные затраты на лечение: в Европе лечение сепсиса требует примерно трехнедельной госпитализации больного в отделении интенсивной терапии, а связанные с этим затраты оцениваются в 70-90 тысяч долларов. Стоимость последующего реабилитационного лечения в течение года может составить от 100 до 250 тысяч долларов.

Низкая эффективность используемых к настоящему времени антибактериальных препаратов объясняется двумя основными причинами. С одной стороны, постоянно растет количество больных с множественной лекарственной устойчивостью, вызванной появлением лекарственно-резистентных штаммов микроорганизмов, что требует использования новых препаратов широкого антимикробного спектра действия. С другой стороны, большинство лекарственных препаратов действует неселективно, то есть при введении препарата в организм только незначительная часть лекарственного вещества попадает в орган/клетку-мишень. Кроме того, большая часть вводимых лекарственных веществ подвергается биотрансформации, не оказав антибактериального действия. В связи с этим возникает необходимость введения избыточного количества лекарственного вещества, что приводит к возникновению серьезных побочных эффектов в виде нарушения гемопоэза, функции печени, почек и т.п.

Для повышения эффективности антибактериальной терапии существуют различные пути. Большое распространение получило введение пациенту наряду с антибиотиками различных препаратов иммуномодулирующего действия (см., например, RU 2266119, А61К 31/502, А61Р 31/06, 37/02, 20.12.2005; RU 2254872, А61К 38/20, А61Р 31/06, 27.06.2005; RU 2197984, А61К 38/08, А61Р 31/06, 10.02.2003; RU 2242222, А61К 31/138, А61Р 31/06, 20.12.2004). Известно также применение антиметаболитов, например, фторурацила, в сочетании с изониазидом (RU 2211035, А61К 31/455, 31/513, А61Р 31/06, 27.08.2003; RU 2185170, А61К 31/505, 31/513, 9/08, А61Р 31/06, 20.07.2002). Предложены средства для повышения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (RU 2207863, А61К 33/00, 10.07.2003; RU 2255746. А61К 35/08, А61Р 43/00, 10.07.2005).

Наиболее значимым из возможных путей повышения эффективности антибактериальных лекарственных средств нам представляется разработка препаратов направленного действия, обеспечивающих локализацию лекарства в клетках-мишенях в эффективных для терапии количествах. При этом важно, чтобы способность доставить лекарство в мишень сочеталась с длительным постепенным его выделением, что позволит снизить применяемые дозы антибиотика. Решению этой задачи посвящено большое количество исследований, показывающих, что при создании конкретных лекарственных средств возникает множество специфических проблем, обусловленных как природой заболевания, так и химическими свойствами лекарственного вещества.

Для обеспечения постепенного выделения активного ингредиента из лекарственных средств применяют препараты, в которых действующее начало распределено в биодеградируемой полимерной матрице. Известны различные формы пролонгированных антибактериальных препаратов: в виде таблеток (RU 2146130, А61К 9/20, 31/455, 31/4965, 10.03.2000; RU 2246946, А61К 31/47, 27.02.2005), в виде микрогранул (RU 2003123513, A61L 15/44, А61Р 31/02, 27.01.2005), в виде гелей (RU 2241455, А61К 31/4164, 31/7072, А61Р 27/02, 10.12.2004; RU 2226383, А61К 6/00, 7/16, А61Р 1/00, 10.04.2004), в виде растворов для ингаляций (RU 2235537, А61К 9/08, 31/133, 31/395, А61Р 31/06, 10.09.2004) или для инъекций (US 6264991, МКИ А61К 9/50, A61F 2/02, НКИ 424/501, 424/426, 424/502, 24.07.2001). Недостатком большинства пролонгированных лекарственных средств является их неспособность обеспечить целенаправленную внутриклеточную доставку лекарственного вещества.

Для повышения эффективности лекарства внутри организма используют липосомальные формы (Губенко Л.В. Липосомальные формы антибиотиков: фармакокинетика на уровне клетки и организма, эффективность. - Купавна, 1992; RU 2264827, А61К 45/08, А61К 9/127, 27.11.2005; RU 2223764, А61К31/496, А61К 9/127, 20.02.2004; RU 2122855, А61К 31/471, А61К 9/127, А61М 15/02. 10.12.1998). Недостатком липосомальных препаратов является низкая стабильность, так как составляющие липосомы фосфолипиды легко окисляются.

Известны препараты направленного действия, в которых лекарственное вещество химически связано с макромолекулярным носителем. Примером такого подхода является ковалентный конъюгат изониазида и декстрана (RU 2087146, А61К 31/455, 31/70, 20.08.1997; RU 2143900, А61К 31/455, 47/48, 10.01.2000). Недостатком таких препаратов является низкая емкость (соотношение лекарственного вещество : носитель), а также сложность технологии создания таких препаратов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является антибактериальное средство для лечения легочных инфекций, прежде всего туберкулеза легких (RU 2185818, А61К 9/08, 31/455, 31/7036, А61Р 31/06, 27.07.2002 - прототип), представляющее собой композицию на основе лекарственного вещества, адсорбированного на частицах полиалкилцианоакрилатов (С₂-С₁₀) или их смесей размером 200-700 нм, содержащую также декстран с молекулярной массой 20-70 кДа и наполнители при следующем соотношении компонентов, вес.%:

Полиалкилцианоакрилат (или их смесь)	20-40
Лекарственное вещество	1-10
Декстран	15-20
Наполнители	остальное,

Композиция может дополнительно содержать растворитель в количестве не более 98 вес.% от общего веса коллоидной системы, а также дополнительно может содержать поверхностно-активные вещества (ПАВ) (полоксамеры, полоксамины, полисорбаты и др.) в количестве не более 20 вес.% от общего веса водной коллоидной системы.

Известное антибактериальное средство, выбранное за прототип, обеспечивает внутриклеточную локализацию лекарства в альвеолярных макрофагах в эффективных для терапии количествах, однако у него имеется ряд существенных недостатков. Во-первых, полиалкилцианоакрилаты отличаются весьма высокими скоростями разложения в живом организме, что существенно снижает длительность выделения лекарства из полимерной матрицы. Во-вторых, в России полиалкилцианоакрилаты не разрешены для применения в качестве компонентов лекарственных средств для внутреннего применения (хотя алкилцианоакрилаты широко используются в качестве медицинских клеев, например, в стоматологии или в хирургии для покрытия раневых поверхностей; см., например, RU 2156140, A61L 24/00, C09J 4/04, 20.09.2000). В-третьих, полиалкилцианоакрилаты необходимо синтезировать из соответствующих мономеров, и получение частиц определенных размеров (менее одного микрона) в ходе синтеза представляет сложную технологическую проблему, следствием чего является недостаточная стабильность характеристик получаемых наночастиц, что отрицательно сказывается на сорбционных свойствах полимерного носителя. Наконец, мономеры, необходимые для синтеза полиалкилцианоакрилатов, не производятся российской промышленностью.

Задачей заявляемого изобретения является создание пролонгированного антибактериального средства направленного действия на основе коммерчески доступных биодеградируемых и биосовместимых полимеров, разрешенных для применения в качестве вспомогательных ингредиентов лекарственных средств, которое обеспечит максимальное проявление присущих лекарственному веществу положительных характеристик и позволит повысить эффективность лечения внутриклеточных инфекций, в частности туберкулеза и септических инфекций. Кроме того, предлагаемое изобретение позволит избежать технологически сложного и трудоемкого процесса синтеза полимерной матрицы.

Решение поставленной задачи достигается предлагаемым антибактериальным средством для лечения внутриклеточных инфекций на основе лекарственного вещества, иммобилизованного на полимерном носителе, включающим целевые добавки, которое в качестве лекарственного вещества содержит моксифлоксацин, в качестве полимерного носителя наночастицы размером 100-800 нм полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в указанных сополимерах до 50 мольных %, при этом молекулярная масса (М.М.) указанных полимеров и сополимеров составляет от 5 до 300 кДа, и средство дополнительно содержит холестерилсульфат калия или гликохолат натрия и водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с молекулярной массой не более 70 кДа, выбранный из группы, включающей поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полоксамер, полоксамин и сывороточный альбумин, и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Указанный полимерный носитель	10-40
Моксифлоксацин	1-5
Холестерилсульфат калия или гликохолат натрия	0,01-5
Указанный полимерный стабилизатор	5-20
Наполнитель	остальное.

При добавлении растворителя (например, воды) в количестве не менее 80 вес.% от общего веса средства предлагаемое средство образует микротонкую суспензию с размером частиц 100-800 нм (содержание в полученной суспензии полилактидов и/или сополимеров лактид/гликолид не более 3 вес.%), не требующую для агрегативной стабильности дополнительного введения ПАВ, однако она может содержать подходящие ПАВ, например, такие как полисорбаты, полоксамеры, полоксамины, или многоатомные спирты, например полиэтиленгликоль или его функциональные производные, в количестве не более 15 вес.% от общего веса водной коллоидной системы.

В качестве растворителя можно использовать воду для инъекций, физиологический раствор, растворы ПАВ и другие подходящие для инъекций водосодержащие смеси.

В качестве наполнителя в предлагаемом средстве могут быть использованы сахара, обладающие криопротекторными свойствами (например, глюкоза, лактоза, маннит, трегалоза) и соли (например, хлорид натрия, цитрат натрия).

При выборе лекарственного начала для предлагаемого антибактериального средства необходимо было учитывать, что большинство больных имеют множественную лекарственную устойчивость, поэтому наиболее распространенные в практике лечения туберкулеза и септических инфекций антибиотики не смогут обеспечить высокой эффективности терапии. Моксифлоксацин (МОКС) является одним из лучших антибиотиков фторхинолонового ряда последнего поколения; к тому же до настоящего времени для лечения туберкулеза он не применялся.

Выбор полимерного носителя определялся химическими свойствами МОКС и поставленной задачей. Проведенные нами экспериментальные исследования нескольких полимерных носителей, таких как полиалкилцианоакрилаты, полиметилметакрилат, полиакрилаты, а также гомополимеры молочной кислоты (полилактиды, ПЛА) и сополимеры молочной и гликолевой кислот (ПЛГА), показали, что из-за особенностей химического строения МОКС не всякий полимер можно использовать в качестве полимерной матрицы, способной сорбировать и удерживать достаточное количество МОКС. Из всех исследованных полимеров наилучшие сорбционные свойства проявили ПЛА и ПЛГА, а также полиалкилцианоакрилаты. Однако, как уже упоминалось, из-за высокой скорости биодеградации полиалкилцианоакрилаты не обеспечивают достаточно длительного действия МОКС, тогда как скорость биодеградации ПЛА и ПЛГА значительно ниже (Vauthier С., Dubernet С., Fattal E., Pinto-Alphandary H., Couvreur P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug. Delivery Rev., 2003; 55(4), p.519-548; Anderson J.M., Shive M.S. Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres. Adv. Drug. Delivery Rev., 1997; 28(1), p.5-24).

Дальнейшие исследования сорбционного процесса на примере ПЛА и ПЛГА позволили выявить ряд факторов, оказывающих существенное влияние на эффективность сорбции, то есть на количество сорбированного в полимерных наночастицах МОКС. Было установлено, что эффективность сорбции в существенной степени зависит от химического строения полимера-носителя. Кроме того, наличие в полимере свободных концевых карбоксильных групп также способствует повышению эффективности включения МОКС в полимерную наночастицу. Неожиданно оказалось, что введение в препарат в процессе сорбции гидрофобных противоионов для аминогруппы МОКС (холестерилсульфата калия или гликохолата натрия) позволяет значительно увеличить количество иммобилизованного на полимере лекарства; при этом была выявлена четкая закономерность между количеством введенного гидрофобного противоиона и степенью включения МОКС. Для придания системе устойчивости необходимо добавлять водорастворимые полимерные стабилизаторы эмульсии, химическая природа которых также может оказывать влияние на эффективность сорбции. Была найдена оптимальная величина М.М. таких стабилизаторов - она не должна превышать 70 кДа.

В результате изучения процесса скорости выделения лекарственного начала из полимерных наночастиц было обнаружено, что, изменяя М.М. полимера, можно регулировать как скорость, так и длительность высвобождения антибиотика из полимера. В результате проведенных исследований было установлено, что терапевтический эффект достигается при использовании ПЛА и сополимеров ПЛГА, имеющих М.М. от 5 до 300 кДа. Размер полимерных наночастиц не должен превышать 1000 нм, но и слишком мелкие частицы - менее 50 нм - нежелательны, поскольку, обладая высокой удельной поверхностью, такие наночастицы слишком быстро выделяют лекарственное вещество. Увеличение содержания активного ингредиента в средстве сверх 10 вес.% не приводит к повышению эффективности лечения. Заявленные соотношения компонентов в средстве являются оптимальными. Экспериментально было установлено, что благодаря иммобилизации антибиотика в наночастицах биодеградируемого полимера повышается эффективность доставки лекарственного средства непосредственно в макрофаги.

Предлагаемое антибактериальное средство получают следующим образом.

Известным методом изготовления либо простой эмульсии: вода/масло, либо сложной (двойной) эмульсии: вода/масло/вода путем однократной или многократной гомогенизации органической и водной фаз, содержащих компоненты заявленного средства, с последующим испарением органического растворителя получают наночастицы из ПЛА или сополимеров ПЛГА размером 100-800 нм. Сорбцию МОКС внутри наночастиц полимера осуществляют в процессе образования суспензии наночастиц при удалении органического растворителя из эмульсии. Метод с применением двойных эмульсий обладает определенными преимуществами для некоторых видов лекарственных веществ. Однако, как показали наши опыты (см. контрольные примеры 1 и 2), в случае МОКС предпочтительнее применять более простой в технологическом отношении метод простых эмульсий с использованием гидрофобного противоиона, хотя метод двойных эмульсий также приемлем в случае низких концентраций противоиона.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

I. Получение полимерных наночастиц с включенным в них МОКС.

Пример 1. (контрольный - без добавления гидрофобного противоиона)

Получение наночастиц методом двойных эмульсий.

Систему, состоящую из 5-20% раствора полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот в органическом растворителе (обычно в метиленхлориде или хлороформе) и 0,5-5% водного раствора моксифлоксацина гидрохлорида (МОКС·HCl), объемное соотношение органической и водной фаз 3:2, гомогенизируют для получения первичной эмульсии. Полученную первичную эмульсию смешивают с 0,5-5% водным раствором полимерного стабилизатора эмульсии в объемном отношении 1:5 и гомогенизируют повторно. Полученную сложную эмульсию перемешивают в течение 3 часов до полного удаления органического растворителя либо удаляют органический растворитель испарением при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Полученную суспензию фильтруют, добавляют 1-10 вес.% наполнителя-криопротектора (глюкоза, маннит, лактоза, трегалоза) и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет 100-800 нм в зависимости от условий гомогенизации и использованных стабилизатора эмульсии и ПАВ. Степень включения МОКС составляет 20-40%.

Пример 2. (контрольный - без добавления гидрофобного противоиона)

Получение наночастиц методом простых эмульсий.

Систему, состоящую из 2-20% раствора полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот в органическом растворителе (обычно в метиленхлориде или хлороформе) и 0,5-5% раствора МОКС·HCl в 0,5-5% водном растворе полимерного стабилизатора эмульсии, объемное соотношение органической и водной фаз 1:5, гомогенизируют до получения эмульсии. Полученную эмульсию далее обрабатывают, как описано в примере 1. Средний размер частиц составляет 100-800 нм (в зависимости от условий гомогенизации и использованного стабилизатора эмульсии). Степень включения МОКС составляет 20-40%.

Пример 3. Получение наночастиц методом простых эмульсий.

Систему, состоящую из 2-20% полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот и 0,5-5% гидрофобного противоиона в органическом растворителе (обычно в хлороформе) и 0,5-5% раствора МОКС·HCl в 0,5-5% водном растворе полимерного стабилизатора эмульсии, объемное соотношение органической и водной фаз 1:5, гомогенизируют до получения эмульсии. Органический растворитель из полученной эмульсии удаляют испарением при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Полученную суспензию фильтруют, добавляют 1-10 вес.% наполнителя-криопротектора (глюкоза, маннит, лактоза, трегалоза) и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет 100-800 нм в зависимости от условий гомогенизации и использованного стабилизатора эмульсии. Степень включения МОКС составляет 50-100%.

Пример 4. Получение наночастиц методом двойных эмульсий.

Систему, состоящую из 5-20% полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот и 0,01-0,5% гидрофобного противоиона в органическом растворителе (обычно в хлороформе) и 0,5-5% водного раствора МОКС·HCl, объемное соотношение органической и водной фаз 3:2, гомогенизируют для получения первичной эмульсии. Полученную первичную эмульсию смешивают с 0,5-5% водным раствором полимерного стабилизатора эмульсии в объемном отношении 1:5 и гомогенизируют повторно. Органический растворитель из полученной сложной эмульсии удаляют испарением при пониженном давлении с помощью роторного испарителя. Полученную суспензию фильтруют, добавляют 1-10 вес.% наполнителя-криопротектора (глюкоза, маннит, лактоза, трегалоза) и лиофилизируют. Средний размер частиц составляет 100-800 нм в зависимости от условий гомогенизации и использованных стабилизатора эмульсии и ПАВ. Степень включения МОКС составляет 40-70%.

Приводим составы предлагаемого антибактериального средства, полученного по примерам 3 или 4, в мас.%.

Состав 1. (по примеру 3)
ПЛА, М.М. 42 кДа, средний размер частиц 400 нм	14,1
Моксифлоксацин	1,4
Холестерилсульфат калия	1,4
Сывороточный альбумин, М.М. 6-10 кДа	16
Глюкоза	67,1
Состав 2 (по примеру 4).
ПЛА-СООН, М.М. 16 кДа, средний размер частиц 100 нм	10
Моксифлоксацин	1
Гликохолат натрия	0,1
Поливинилпирролидон, М.М. 30-60 кДа	20
Манит	68,9
Состав 3 (по примеру 4).
ПЛА, М.М. 42 кДа, средний размер частиц 200 нм	24
Моксифлоксацин	2,4
Холестерилсульфат калия	0,01
Поливиниловый спирт, М.М. 30-70 кДа	12,2
Маннит	61,39
Состав 4 (по примеру 4).
Сополимер ПЛГА 75/25, М.М. 90-126 кДа, ср.размер частиц 220 нм	39
Моксифлоксацин	3,9
Холестерилсульфат калия	0,1
Поливиниловый спирт, М.М. 30-70 кДа	15
Глюкоза	42
Состав 5 (по примеру 3).
Смесь ПЛА, М.М. 300 кДа и сополимера ПЛГА 50/50,
М.М. 60 кДа (2:1), ср.размер частиц 800 нм	40
Моксифлоксацин	5
Холестерилсульфат калия	5
Полоксамер 407	20
Трегалоза	30
Состав 6 (по примеру 3).
Смесь ПЛА, М.М. 5 кДа и ПЛА, М.М. 42 кДа
(1:1), средний размер частиц 500 нм	25
Моксифлоксацин	1,1
Гликохолат натрия	1,5
Полоксамин 908	5
Лактоза	67,4
Состав 7 (по примеру 3) с добавлением воды
ПЛА, М.М. 42 кДа, средний размер частиц 250 нм	10,0
Моксифлоксацин	2,1
Холестерилсульфат калия	0,9
Поливиниловый спирт, М.М. 30-70 кДа	5,0
Глюкоза	1,0
Вода	81,0.

II. Исследование эффективности предлагаемого антибактериального средства.

1) Эффективность доставки моксифлоксацина во внутриклеточную среду in vitro. Для установления эффективности доставки МОКС предлагаемым наносомальным препаратом в макрофаги, инфицированные Mycobacterium tuberculosis, использовали полученный состав 3. Для этого дифференцированные макрофаги ТНР-1 (монослой), инфицированные суспензией М. tuberculosis (H37Rv), содержащей в 1 мл 2.5×10⁶ колониеобразующих единиц (CFU/ml), инкубировали при 37°С с наносомальным препаратом (состав 3) и контроль - с раствором свободного МОКС. Отделение клеток от внеклеточной среды проводили после инкубации фильтрацией через мембранные фильтры Millipore SM с диаметром пор 5 мкм. Концентрацию МОКС в клеточном лизате и фильтрате определяли методом ELISA. При инкубации клеток со свободным МОКС равновесная внутриклеточная концентрация МОКС достигается в течение 5 мин и составляет 131±12 мкг/мл, в то время как при инкубации клеток с иммобилизованным МОКС равновесная внутриклеточная концентрация МОКС продолжает возрастать в течение 1 часа и достигает более высоких значений - 373±32 мкг/мл - см. фиг.1а, на которой приведены сравнительные данные по накоплению свободного и наносомального МОКС. При инкубации клеток с наносомальным МОКС выделение антибиотика в среду продолжается в течение 24-48 час.

Как видно из данных по внутриклеточному накоплению МОКС, предложенный наносомальный препарат эффективнее накапливается в макрофагах и удерживается там в течение более длительного времени, чем свободный МОКС. Эти результаты свидетельствуют о больших потенциальных возможностях такой системы доставки лекарственных веществ для терапии внутриклеточных инфекций, так как инфицированные макрофаги способны накапливать наночастицы в больших количествах.

2) Определение антибактериальной активности предлагаемого наносомального средства в отношении внутриклеточных бактерий.

Для оценки активности МОКС, ассоциированного с полимерными наночастицами (состав 3), в отношении внутриклеточных бактерий дифференцированные макрофаги ТНР-1 (монослой) инфицировали суспензией М.tuberculosis (H37Rv), содержащей 2.5×10⁶ CFU/мл. Через 1 час клетки отмывали для удаления неинтернализованных бактерий и культивировали в течение 24 час. Затем в среду дважды с интервалом в 2 часа добавляли предлагаемый препарат (состав 3), содержащий МОКС в концентрациях 0.1, 1.0 и 10.0 мкг/мл. Подсчет жизнеспособных бактерий (CFU/мл) осуществляли путем серийных разбавлений клеточных лизатов и последующим их культивированием в течение 4 или 8 дней. Антибактериальную активность оценивали по изменению числа жизнеспособных клеток в пробах после инкубации суспензии клеток с иммобилизованным антибиотиком. В качестве контроля использовали свободный МОКС в тех же концентрациях.

Результаты сравнения активности иммобилизованного и свободного МОКС приведены на фиг.1b. Как видно из фиг.1b, противомикробный эффект наносомального МОКС был значительно выше по сравнению со свободным антибиотиком. Так, через 4 дня для концентрации МОКС 10 мкг/мл число колониеобразующих единиц для свободного МОКС было 1.5×10⁴ CFU/мл, а для наносомального - 6.2×10³ CFU/мл. Кроме того, наносомальный МОКС длительно удерживался внутри клеток, выделяясь в течение 48 час, что указывает на пролонгацию действия МОКС (депо-эффект), ассоциированного с наночастицами, по сравнению со свободным МОКС.

3) Эффективность предлагаемого антибактериального средства для лечения экспериментального туберкулеза у мышей.

Исследование химиотерапевтической активности МОКС, ассоциированного с полимерными наночастицами - состав 4, проводили на мышах с экспериментальным туберкулезом. Самок мышей линии BALB/c (возраст 7-8 недель) заражали внутривенным введением Mycobacterium tuberculosis H37Rv в дозе 5×10⁶-10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мышь. Инфицированных мышей разделили на три группы (n=10). Животным в группе 1 вводили наносомальный МОКС (Мокси/PLGA). Для этого к 200 мг наносомального МОКС (состав 4) добавляли 2,5 мл воды для инъекций. Полученную коллоидную систему вводили мышам в дозе 10 мг/кг по МОКС внутривенно трехкратно: на четвертые, пятые и шестые сутки после заражения. Контрольным животным вводили субстанцию свободного МОКС (Мокси) в тех же терапевтических дозах. В качестве дополнительного контроля использовали животных, не получавших лечения (Контроль). Через сутки после окончания курса 3-дневной терапии зараженных животных подвергали эвтаназии, в асептических условиях выделяли и гомогенизировали легкое (правое), далее проводили высев на чашки со средой 7Н11. Подсчет живых микобактерий в единицах КОЕ проводили через 3-4 недели. Результаты приведены на фиг.2.

Как видно из фиг.2, при экспериментальном туберкулезе у мышей наносомальный препарат (Мокси/PLGA, состав 4) проявляет более высокий антибактериальный эффект по сравнению со стандартной субстанцией (Мокси), то есть позволяет повысить эффективность лечения.

4) Эффективность предлагаемого антибактериального средства для лечения экспериментальной септической инфекции у мышей.

Исследование химиотерапевтической активности МОКС, ассоциированного с полимерными наночастицами - состав 1 (Мокси-ПЛА), проводили на мышах с экспериментальной септической инфекцией, вызванной введением Е.coli.

В исследовании использовали самок мышей линии BALB/c в возрасте 6-8 недель (n=10). Мыши содержались в микроизоляторах и получали воду и пищу ad libitum. После недельного карантина мышей инфицировали Е.coli (штамм 0157). Суспензию бактерий вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5×10 КОЕ в 0,1 мл физиологического раствора.

Препараты МОКС (Мокси-ПЛА и свободного МОКС - Мокси) вводили внутривенно в дозе 1×25 мг/кг (по МОКС) через 4 ч после заражения. Результаты приведены на фиг.3. Видно, что лечение наносомальным МОКС (Мокси-ПЛА) привело к выживанию 60% животных, в то время как при введении свободного антибиотика (Мокси) выжило лишь 20%. В контроле погибли все животные.

Таким образом, приведенные результаты показывают, что предлагаемое антибактериальное средство для лечения внутриклеточных инфекций обеспечивает максимальное проявление присущих моксифлоксацину положительных характеристик, так как позволяет направленно доставлять антибиотик в макрофаги, которые при внутриклеточных инфекциях являются нишей для выживания патогенных микроорганизмов, а также позволяет регулировать скорость высвобождения лекарственного вещества из полимерного носителя и, следовательно, обеспечивать пролонгированное действие антибиотика. В результате повышается эффективность лечения внутриклеточных инфекций, в частности туберкулеза и септической инфекции, что предполагает возможность уменьшения применяемых доз антибиотика и, следовательно, токсических эффектов. Достигаемый эффект депо предлагаемого препарата, вероятно, позволит также преодолеть резистентность возбудителей туберкулеза, так как известно, что микобактерии при множественной лекарственной устойчивости растут в полтора раза медленнее, чем микобактерии с сохраненной лекарственной чувствительностью (Г.Б.Соколова, С.Е.Борисов, А.Д.Кунич, Я.В.Лазарева, Г.Н.Можокина, Н.А.Елистратова, А.А.Цыбанев, М.И.Перельман. Лечение лекарственно-резистентного туберкулеза. Пособие для врачей-фтизиатров. МЗ РФ, НИИ Фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова, Москва, 2002). Кроме того, предлагаемое изобретение позволяет избежать технологически сложного и трудоемкого процесса синтеза полимерного носителя из мономеров.

1. Антибактериальное средство для лечения внутриклеточных инфекций на основе лекарственного вещества, иммобилизованного на полимерном носителе, включающее целевые добавки, отличающееся тем, что в качестве лекарственного вещества оно содержит моксифлоксацин, в качестве полимерного носителя наночастицы размером 100-800 нм полимера/полимеров молочной кислоты и/или сополимера/сополимеров молочной и гликолевой кислот при содержании гликолевой кислоты в указанных сополимерах до 50 мол.%, при этом молекулярная масса указанных полимеров и сополимеров составляет от 5 до 300 кДа, и средство дополнительно содержит холестерилсульфат калия или гликохолат натрия и водорастворимый природный или синтетический полимерный стабилизатор с молекулярной массой не более 70 кДа, выбранный из группы, включающей поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полоксамер, полоксамин и сывороточный альбумин, и наполнитель, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Указанный полимерный носитель	10-40
Моксифлоксацин	1-5
Холестерилсульфат калия или
гликохолат натрия	0,01-5
Указанный полимерный стабилизатор	5-20
Наполнитель	остальное

2. Антибактериальное средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит растворитель - воду или водосодержащие смеси в количестве не менее 80 мас.%.