Вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней
Владельцы патента RU 2347585:
Федеральное государственное учреждение "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ "ВГНКИ") (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцина содержит вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 и дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%: вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 - 10,33-11,74, сахароза - 4,31-4,80, пептон ферментативный - 3,13-3,69, казеин - 0,78-1,11, тиомочевина - 0,04-0,70, аэросил AM-1-300 - 1,00-2,00, смола КБ-4П-2 - остальное. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, безвредна, экологически безопасна. 5 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии вирусных вакцинных ветеринарных препаратов, в частности к вакцине «ОРОВАК-ТГЭ» против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, предназначенной для пероральной иммунизации супоросных свиноматок, поросят и хряков ремонтной и основной групп.
Известна вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 (SU 734279, 21.12.1978).
Недостатком данной вакцины является значительная потеря ее антигенной и иммуногенной активности при производстве и последующем хранении, из-за низкой устойчивости вакцинного вируса к сублимационному высушиванию и, как следствие, к снижению ее эффективности.
Целью изобретения является повышение эффективности вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.
Указанная цель достигается тем, что она дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| вирусный материал из штамма | |
| Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 | 10,33-11,74 |
| сахароза | 4,31-4,80 |
| пептон ферментативный | 3,13-3,69 |
| казеин | 0,78-1,11 |
| тиомочевина | 0,04-0,70 |
| аэросил АМ-1-300 | 1,00-2,00 |
| смола КБ-4П-2 | остальное. |
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Для получения вирусного материала из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 используют культуру СПЭВ, выращенную в роллерных условиях с образованием монослоя через 20-48 часов. Ростовую среду заменяют поддерживающей средой того же состава, но без сыворотки, с добавлением вируса. Множественность заражения составляет 1-10 ТЦД50 на 1 клетку. Инфицированную культуру инкубируют в роллерных условиях в течение 16-30 часов. Вирусный материал хранят при минус 20°С.
Перед приготовлением вакцины "ОРОВАК-ТГЭ" компоненты вакцины: сахарозу, пептон ферментативный, казеин и тиомочевину (каждый компонент в отдельности) подвергают тепловой обработке, при температуре 90°С, а смолу КБ-4П-2 в смеси с гидрофобным аэросилом при температуре 102±2°С в течение 4 часов, с последующим их охлаждением до температуры 4±2°С. В аппарат типа РТ-1 последовательно загружают вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 в объеме 14-15 л; сахарозу в количестве 5,5-6,5 кг; пептон ферментативный в количестве 4-5 кг; казеин в количестве 1-1,5 кг и 0,05-0,1 кг тиомочевины. Смешение - растворение компонентов в аппарате проводят при 8000 об/мин в течение 2 минут.Полученную суспензию вакцинного полуфабриката переносят в барабан шаровой мельницы, в котором осуществляют его смешивание и обезвоживание, в соотношении 1:4, с ионнообменной смолой КБ-4П-2 с нанесенным на поверхность ее частиц гидрофобного аэросила АМ-1-300, взятого по массе в количестве 1,25-2,50%. Скорость вращения барабана 60-90 об/мин.
Получают 3 состава предложенной вакцины, приведенной в таблице 1. Готовый вакцинный продукт «ОРОВАК-ТГЭ» представляет собой сыпучий порошок серо-желтого цвета. Биологическая активность препарата не ниже 6,0 lg ТЦД50/г-1. Массовая доля влаги в пределах 10-14%.
Вакцину расфасовывают по 100-200 г в стерильные флаконы или двойные полиэтиленовые пакеты. Флаконы укупоривают стерильными резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а пакеты герметично запаивают.
Срок годности вакцины - 6 месяцев при условии хранения в темном помещении при температуре 2-10°С.
Пример 2.
Изучают биологическую активность 3-х образцов вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», приготовленных по примеру 1 и хранившихся в течение 12 месяцев при температуре минус 8-12°С; 2-10°С; 18-20°С. Количественную оценку вирусной активности определяют путем титрования по ЦПЭ в клеточной линии СПЭВ. Клеточную суспензию в концентрации 4·105 клеток в см3 наносят на 96-луночные плашки по 0,01 см3 в каждую лунку. Инкубирование проводят в СО2 инкубаторе. Монослой формируется на вторые сутки. В опытах используют плашки со сплошным монослоем. Готовят 10-кратные разведения вируса с 10-1 до 10-8. На каждое разведение используют по 4 лунки, вирус вносят по 0,05 см3. Зараженную куль-туру инкубируют 5-7 дней. Титр вируса выражают в ТЦД50/см3. Результаты по изучению устойчивости вирусвакцины «ОРОВАК-ТГЭ» в зависимости от условий хранения представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 следует, что наилучшие условия сохранности биологическоской активности вакцины обеспечивает температурный режим минус 8-12°С, при этом за 12 месяцев хранения активность снижается в среднем на 0,8 lg ТЦД50. Температура 2-10°С обеспечивает сохранность активности на высоком уровне только в течение 6 месяцев, а температура 18-20°С вызывает значительную инактивацию вируса.
Пример 3.
Исследуют безвредность 3 образцов вакцины "ОРОВАК-ТГЭ", приготовленных по примеру 1 из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5. Для контроля используют 6 подсвинков, серонегативных к вирусу ТГЭ свиней (по 2 на каждый образец). Навески вакцины массой 1 г суспендируют в 10 см3 стерильного физиологического раствора. Приготовленную суспензию вводят животным в объеме 5 см3 в область шеи или бедра.
Контрольное наблюдение за животными ведут в течение 10 суток с ежедневным измерением температуры тела. Все животные остались живы. Клиническое состояние подопытных животных не отличалось от нормы и от группы контроля.
Таким образом, исследуемые образцы вакцины безвредны.
Пример 4.
Изучают антигенную активность 2-го опытного образца вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», приготовленного по примеру 1 и хранившегося в течение 6 месяцев при температуре 2-10°С. Сухую вакцину смешивают с небольшим количеством (100-200 г) сухого корма, который раскладывают равномерным слоем в кормушки для скармливания животным перед утренним кормлением. Супоросным свиноматкам дозу вакцины скармливают за 10-14 дней до опороса по 10 г препарата на голову. Поросятам дозу вакцины (5 г) скармливают через 10-14 суток после отъема.
Об антигенной активности судят по образованию вируснейтрализующих антител к вирусу ТГЭ у иммунизированных свиноматок на 7, 14, и 21 день после вакцинации; у иммунизированных поросят на 35 день после применения вакцины. Определение титра антител проводят в реакции нейтрализации против вируса ТГЭ, штамм «ВГНКИ-5», в разведении, соответствующему 100 ТЦД50/0,1 см3. Реакцию ставят стандартным методом, используя культуру клеток СПЭВ. Результат учитывают через 5 дней после постановки реакции. За титр нейтрализующих антител принимают наивысшее разведение сыворотки, которое полностью ингибирует цитопатический эффект вируса ТГЭ.
Свиней считают серонегативными к вирусу ТГЭ, если их сыворотка крови в разведении 1:2 не обладала вируснейтрализующей активностью. До вакцинации в сыворотке крови подопытных животных специфические вируснейтрализующие антитела к вирусу ТГЭ отсутствовали.
Динамика антител у животных, вакцинированных вторым опытным образцом «ОРОВАК-ТГЭ», представлена в таблице 3.
Как видно из результатов таблицы 3, иммунизация вторым опытным образцом вакцины индуцирует образование вируснейтрализующих специфических антител у свиноматок на 7 день исследования, а у поросят на 35 день в титрах 1:128-256.
Таким образом, антигенный компонент является активным и вакцина пригодна для применения.
Пример 5.
Испытывают иммуногенную активность 2-го опытного образца вакцины «ОРОВАК-ТГЭ», хранившегося в течение 6 месяцев при температуре 2-10°С, приготовленного по примеру 1. Сухую вакцину с биологической активностью 6,25 lg ТЦД50/г-1 смешивают с небольшим количеством (100-200 г) сухого корма. Полученную смесь равномерным слоем расклавают в кормушки для скармливания 4 супоросным свиноматкам. Вакцину скармливают животным перед утренним кормлением в дозе 10 г на голову, в течение 3-х дней подряд, за 10-14 дней до опороса. У всех свиноматок, получивших вакцину «ОРОВАК-ТГЭ» в течение всей продолжительности опыта изменений клинических признаков не отмечено. На 10-14 день поросят отнимают от свиноматок и формируют в 4 опытные группы.
Вакцину скармливают всем поросятам также перед утренним кормлением в дозе 5 г на голову. В качестве контроля используют поросят от не вакцинированных свиноматок, которым вакцину не скармливают.
Эффективность иммунизации поросят контролируют через 21 день по титрам антител, выявленным в реакции нейтрализации и по результатам контрольного заражения привитых поросят культурой вирулентного штамма «Мюллер» вируса ТГЭ в дозе 1000 ЛД50/0,2 см3. У 12 опытных поросят после заражения отмечали слабость, лихорадку (40,5-41,5°С), 5 из которых на 4-5 сутки после появления сильной диареи погибли.
Результаты по иммунизации поросят 2 опытным образцом вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» представлены в таблицах 4 и 5.
Данные таблиц 4 и 5 говорят о том, что опытный образец вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» №2 индуцирует у всех опытных поросят выработку специфических антител в титрах 1: 32-256, тем самым обеспечивая их надежную защиту от контрольного заражения, в среднем на 84,8%. У поросят из группы контроля на вторые сутки после заражения отмечают отсутствие аппетита, жажду, слабость, лихорадку, сильную диарею - желтоватые пенистые фекалии. На 3 день после наступления комы все поросята погибли.
Вакцина «ОРОВАК-ТГЭ», изготовленная по технологии контактного обезвоживания, для перорального применения безвредна для свиноматок и поросят, не вызывает поствакцинальных реакций; высокоиммуногенна (защита от вируса ТГЭ на 75-100%) и экологически безопасна для обслуживающего персонала.
Использование вакцины «ОРОВАК-ТГЭ» для иммунизации животных позволит сократить затраты и повысить эффективность мероприятий по борьбе с трансмиссивным гастроэнтеритом свиней.
| Таблица 1 | |||||||
| Компоненты: | Содержание компонентов, мас.%: | ||||||
| Состав 1 | Состав 2 | Состав 3 | |||||
| Вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 | 10,33 | 11,016 | 11,74 | ||||
| Сахароза | 4,80 | 4,558 | 4,31 | ||||
| Пептон ферментативный | 3,69 | 3,419 | 3,13 | ||||
| Казеин | 1,11 | 0,950 | 0,78 | ||||
| Тиомочевина | 0,70 | 0,057 | 0,04 | ||||
| Аэросил AM-1-300 | 2,00 | 1,500 | 1,00 | ||||
| Смола КБ-4П-2 | Остальное | Остальное | Остальное | ||||
| Таблица 2 | |||||||
| Вакцина «ОРОВАК-ТГЭ» | Биологическая активность, lg ТЦД50/г-1 | ||||||
| Вакцина после приготовления | Хранение при t (°С) в течение (мес.) | ||||||
| 6 | 12 | ||||||
| минус 8-12 | 2-10 | 18-20 | минус 8-12 | 2-10 | 18-20 | ||
| Опытный образец №1 | 6,7 | 6,5 | 6,10 | 5,0 | 5,9 | 4,0 | 3,8 |
| Опытный Образец №2 | 6,6 | 6,6 | 6,25 | 4,8 | 5,8 | 4,2 | 4,1 |
| Опытный Образец №3 | 6,5 | 6,4 | 6,10 | 4,7 | 5,7 | 4,2 | 4,0 |
| Таблица 3 | |||||
| Вид | Сроки исследований, дни | ||||
| Животных | До вакцинации | 7 | 14 | 21 | 35 |
| Свиноматки | |||||
| №1 | 0 | 1:8 | 1:64 | 1:256 | - |
| №2 | 0 | 1:8 | 1:64 | 1:256 | - |
| Поросята | |||||
| №1 | 0 | - | - | - | 1:256 |
| №2 | 0 | - | - | - | 1:128 |
| №3 | 0 | - | - | - | 1:128 |
| №4 | 0 | - | - | - | 1:256 |
| №5 | 0 | - | - | - | 1:256 |
| №6 | 0 | - | - | - | 1:128 |
| Таблица 4 | |||||
| Титр вируснейтрализующих специфических антител в сыворотках крови опытных поросят | |||||
| № | Группа №1 | Группа №2 | Группа №3 | Группа 4 | |
| 1 | 1:256 | 1:256 | 1:256 | 1:256 | |
| 2 | 1:64 | 1:128 | 1:128 | 1:64 | |
| 3 | 1:128 | 1:128 | 1:128 | 1:64 | |
| 4 | 1:128 | 1:128 | 1:256 | 1:256 | |
| 5 | 1:128 | 1:128 | 1:128 | 1:128 | |
| 6 | 1:64 | 1:64 | 1:64 | 16128 | |
| 7 | 1:128 | 1:64 | 1:128 | 1:128 | |
| 8 | 1:64 | 1:128 | 1:64 | - | |
| 9 | - | - | 1:128 | - | |
| 10 | - | - | 1:32 | - |
| Таблица 5 | ||||||
| № группы | Кол-во поросят в группе | Средний геометрический титр поствакцинальных антител | Результаты контрольного заражения | |||
| Выжило | Клинически переболело | Из них пало | % выживших | |||
| 1 | 8 | 100 | 6 | 3 | 2 | 75 |
| 2 | 8 | 230 | 7 | 3 | 1 | 87,5 |
| 3 | 10 | 110,2 | 8 | 4 | 2 | 80 |
| 4 | 7 | 126,5 | 7 | 2 | 0 | 100 |
| Всего | 33 | 28 | 12 | 5 | 84,8 | |
| Контроль | 10 | 0 | 0 | 10 | 10 | 0 |
Вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней, содержащая вирусный материал из штамма Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сахарозу, пептон ферментативный, казеин, тиомочевину, аэросил AM-1-300 и смолу КБ-4П-2 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Вирусный материал из штамма | |
| Transmissible gastroenteritis ВГНКИ №5 | 10,33-11,74 |
| Сахароза | 4,31-4,80 |
| Пептон ферментативный | 3,13-3,69 |
| Казеин | 0,78-1,11 |
| Тиомочевина | 0,04-0,70 |
| Аэросил AM-1-300 | 1,00-2,00 |
| Смола КБ-4П-2 | Остальное |
