Химерный антигенный рецептор

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен химерный антигенный рецептор (CAR), который содержит дисиалоганглиозид (GD2)-связывающий домен. Кроме того, представлены нуклеиновая кислота, кодирующая CAR по изобретению; вектор экспрессии; Т-клетки и способ получения Т-клетки. Также описаны фармацевтическая композиция, способ лечения злокачественной опухоли и применение T-клетки в получении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли. Предложенный CAR обеспечивает увеличенное продуцирование INF-γ, пролиферацию CAR-T-клеток и уничтожение клеток нейробластомы по сравнению с CAR на основе антитела 14g2a. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии. 9 н. и 17 з.п. ф-лы, 15 ил., 10 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), который связывает антиген злокачественной опухоли дисиалоганглиозид (GD2). T-клетки, экспрессирующие такой CAR, можно использовать в лечении злокачественных заболеваний, таких как нейробластома.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дисиалоганглиозид (GD2, PubChem: 6450346) представляет собой гликосфинголипид, содержащий сиаловую кислоту, экспрессируемый в первую очередь на клеточной поверхности. Функция этого углеводного антигена понята не полностью; однако полагают, что он играет важную роль в прикреплении опухолевых клеток к белкам внеклеточного матрикса. GD2 плотно, гомогенно и почти повсеместно экспрессирован на нейробластоме. В нормальных тканях экспрессия GD2 главным образом ограничена меланоцитами кожи и миелиновой оболочкой периферических болевых волокон. В ЦНС GD2 по-видимому является эмбриональным антигеном, но находят его слабо экспрессированным в рассеянных олигодендроцитах и в задней доле гипофиза. Это делает GD2 хорошо подходящим для направленной противоопухолевой терапии.

Антитела к GD2 проходили экстенсивное тестирование в качестве терапии нейробластомы. В настоящее время в клинике используют два клона и их производные: клон 3F814 и 3F8. Другой клон 14.187 тестировали в качестве IgG3 мыши, после переключения изотипа на IgG2a (14g2a) и, наконец, после химеризации с IgG1 человека для того, чтобы формировать ch14.18. Это последнее антитело приводило к явному эффекту в рандомизированном исследовании: US Childrenʹs Oncology Group сообщала о III фаза рандомизированного исследования ch14:18 у детей с высоким риском нейробластомы, которые достигли радиологической ремиссии после начального лечения. У этих пациентов имело место 20% улучшение EFS в группе ch14:18 со средним последующим наблюдением 2,1 года. Важно, что для этих средств нейротоксичность, наиболее часто в виде нейропатии, вызывающей хроническую боль, и менее часто офтальмоплегия являются основной токсичностью, ограничивающей дозу.

Продолжается улучшение этих терапевтических mAb: описан IL-2, иммуноцитокин, полученный от ch14.18. Это является достаточно токсичным средством с некоторым эффектом, оказываемым на минимальное остаточное заболевание, но не на массивное поражение. Ch14.18 полностью гуманизировано и его Fc содержит мутации для того, чтобы ингибировать активацию комплемента. Эта гуманизированная версия Ch14.18 проходит клинические исследования, но доступны только очень ограниченные данные. Также описана гуманизация антитела 3F8. Хотя клинические данные о серотерапии GD2 обнадеживают, устойчивая полная ремиссия до сих пор ограничена и нет свидетельств клинически полезной роли антител, за исключением условий минимального заболевания.

Таким образом, существует потребность в усовершенствованных терапевтических подходах к лечению нейробластомы и других злокачественных опухолей, экспрессирующих GD2.

Химерные антигенные рецепторы (CAR)

Химерные антигенные рецепторы представляют собой белки, которые в их обычном формате, объединяют специфичность моноклонального антитела (mAb) с эффекторной функцией T-клетки. Их обычной формой является трансмембранный доменный белок I типа с антигенраспознающим аминоконцом, спейсером, трансмембранным доменом, все соединены в составной эндодомен, который передает сигналы выживаемости и активации T-клетки (см. фиг. 1a).

Наиболее распространенной формой этих молекул являются слитные конструкции из одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), полученных из моноклональных антител, которые распознают целевой антиген, слитых через спейсер и трансмембранный домен с сигнальным эндодоменом. Такие молекулы вызывают активацию T-клетки в ответ на распознавание своей мишени с помощью scFv. Когда T-клетки экспрессируют такой CAR, они распознают и уничтожают целевые клетки, которые экспрессируют целевой антиген. Разработано несколько CAR против опухолеассоциированных антигенов и в настоящее время подходы адоптивного переноса с использованием таких CAR-экспрессирующих T-клеток проходят клинические исследования для лечения различных злокачественных опухолей.

Описаны химерные антигенные рецепторы против GD2, в которых антигенсвязывающий домен основан на scFv 14g2a (WO 2013/040371 и Yvon et al (2009, Clin Cancer Res 15:5852-5860)).

Показано, что T-клетки человека, экспрессирующие 14g2a-CD28-OX40-ζ CAR, имеют некоторую противоопухолевую активность, но не способны полностью устранять заболевание (Yvon et al (2009) как выше).

Авторы настоящего изобретения пытались создать альтернативный GD2-нацеленный CAR с усовершенствованными свойствами.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 - Конструкция химерного антигенного рецептора (CAR).

(a) обобщенное устройство CAR: связывающий домен распознает антиген; спейсер поднимает связывающий домен над клеточной поверхностью; трансмембранный домен заякоривает белок в мембране и эндодомен передает сигналы. С (b) до (d): различные генерации и перестановки эндодоменов CAR: (b) начальные конструкции передавали ITAM сигналы только через эндодомен FcεR1-γ или CD3ζ, тогда как более поздние конструкции передавали дополнительный (c) один или (d) два костимуляторных сигналах в цис.

Фиг. 2 - сконструированные варианты CAR против GD2 (a) CAR против GD2 с использованием антитела KM666 мыши в качестве scFv со спейсером IgG1 человека и эндодоменом CD28-OX40-ζ; (b) CAR против GD2 с использованием гуманизированного антитела huKM666 Nakamura в том же формате, что и (a); (c) тот же формат, что и (b), за исключением того, что Fc домен модифицируют для того, чтобы удалять мотивы распознавания Fc рецептора; (d) тот же формат, что и (c), за исключением того, что спейсер представляет собой шарнир IgG1 - стебель CD8; (e) то же, что и (c), за исключением того, что спейсер представляет собой только стебель CD8; (f) то же, что и (c), за исключением того, что спейсер представляет собой только шарнир IgG1.

Фиг. 3 - сравнение CAR на основе muKM666 и huKM666. (a) Экспрессия на T-клетках периферической крови от 3 нормальных доноров; (b) средняя интенсивность флуоресценции этих графиков FACS, представленная в виде гистограммы; (c) анализ высвобождения хрома с использованием нетрансдуцированных, трансдуцированных muKM666 и huKM666 T-клеток в качестве эффекторов против мишеней A204 (GD2-отрицательные) и LAN-1 (GD2-положительные); (d) продуцирование IL-2 после того же стимула; (e) продуцирование интерферона-γ после того же стимула; и (f) кратность пролиферации после того же стимула.

Фиг. 4. (a) Ретровирусная конструкция, делающая возможной коэкспрессию маркерного гена CD34 и CAR 1:1; (b) проточный цитометрический анализ экспрессии CAR (метка HA) в сравнении с маркерным геном CD34; (c) анализ высвобождения хрома нетрансдуцированными T-клетками и T-клетками, трансдуцированными тремя различными вариантами CAR против GD2-положительных мишеней (LAN-1) и GD2-отрицательных мишеней (A204); (d) высвобождение интерферона-γ; (e) высвобождение IL-2; и (f) пролиферация тех же мишеней и эффекторов.

Фиг. 5 - введение мутаций, нарушающих связывание FcR, в Fc спейсер (a) введенные мутации; (b) экспрессия CAR, как определяют посредством окрашивания против Fc: нетрансдуцированный, дикого типа и мутантный; (c) уничтожение GD2-отрицательных и GD2-положительных мишеней с использованием одного из нетрансдуцированных T-клеток, T-клеток с CAR против GD2 с Fc дикого типа и с мутантным Fc; (d) активация нетрансдуцированных T-клеток, T-клеток против GD2 с Fc дикого типа и с мутантным Fc с использованием клеточной линии THP-1, экспрессирующей FcR; высвобождение IL-1β клеточной линией THP-1 в ответ на нетрансдуцированные T-клетки, T-клетки с CAR с Fc дикого типа и мутантным Fc.

Фиг. 6 - оптимизация экспрессирующей кассеты

(a) картирование оптимизации, которую осуществляли в кассете: SAR или CHS4; (b) репрезентативная экспрессия CAR с различными модификациями с использованием открытой рамки считывания или дикого типа или с оптимизацией кодонов. SAR конструкция дает узкий пик экспрессии, который является тем, что желательно. (c) Гистограмма, представляющие эти данные FACS от 3 нормальных доноров.

Фиг. 7 - сравнение различных эндодоменов

Сравнивали три различных химерных антигенных рецептора. Все рецепторы состояли из huK666 scFv, Fc домена из IgG1, мутированного для того, чтобы снижать связывание FcR, и трансмембранного домена CD28. CAR «28tmZ» имеет эндодомен CD3ζ; «28Z» имеет составной эндодомен CD28-CD3ζ; «28OXZ» имеет составной эндодомен, состоящий из CD28, OX40 и CD3ζ. T-клетки периферической крови от нормальных доноров трансдуцировали этими конструкциями с использованием ретровирусных векторов схожих титров. Эти различные T-клеточные линии сравнивали наряду с нетрансдуцированными T-клетками в качестве контролей. T-клетки стимулировали с использованием клеток A204 (клеточная линия рабдомиосаркомы, которая является GD2-отрицательной) и клеток LAN-1 (клеточная линия нейробластомы, которая является GD2-положительной). Пролиферация и высвобождение цитокинов показывают, что активность рецепторов представляет собой 28tmZ < 28Z < 28OXZ.

Фиг. 8 - коэкспрессия с геном самоубийства iCasp9

(a) Коэкспрессия iCasp9 с CAR против GD2 с использованием последовательности FMD-2A; (b) экспрессия CAR в NT T-клетках, T-клетках, трансдуцированных GD2CAR, и T-клетках iCasp9-2A-GD2CAR отдельно и после лечения с использованием CID; (c) уничтожение GD2-положительных (LAN-1) и -отрицательных (A204) мишеней нетрансдуцированными T-клетками, T-клетками, трансдуцированными GD2CAR, и T-клетками, трансдуцированными iCasp9-2A-GD2CAR, с лечением с использованием CID или без него. Усредненное для T-клеток 5 нормальных доноров.

Фиг. 9 - коэкспрессия с геном самоубийства RQR8

(a) CARhuK666Fc совместно экспрессировали с геном самоубийства наподобие RQR8 в ретровирусном векторе. (b) T-клетки трансдуцировали этим ретровирусным вектором и определяли коэкспрессию CAR и RQR8 посредством окрашивания трансдуцированных T-клеток поликлональным антителом против Fc и моноклональным антителом QBend10. (c) CAR положительную популяцию в этих T-клетках можно истощать в присутствии ритуксимаба и комплемента. (d) T-клетки, истощенные с использованием ритуксимаба, более не распознавали экспрессирующие GD2 мишени.

Фиг. 10 - (a) Бицистронный вектор, экспрессирующий GM3-синтазу и GD2-синтазу. (b) Клетки SupT1, трансдуцированные этим вектором, становились GD2-положительными (нетрансдуцированный незакрашенный график; трансдуцированный закрашенный график).

Фиг. 11 - Кривые роста отдельных опухолей у мышей в следующих когортах: верхняя левая: мыши с GD2-экспрессирующими опухолями CT26, получающие спленоциты с CAR против GD2; верхняя правая: GD2-экспрессирующие опухоли CT26, получающие трансдуцированные имитатором спленоциты; нижняя левая: GD2-отрицательные опухоли CT26 (дикого типа) со спленоцитами с CAR против GD2; нижняя правая: GD2-экспрессирующие опухоли CT26, не получающие спленоциты

Фиг. 12 - Аминокислотные последовательности

A. CAR против GD2 представлен как (a) на фиг. 2 (muKM666-HCH2CH3-CD28OXZ - SEQ ID № 26)

B. CAR против GD2 представлен как (b) на фиг. 2 (huKM666-HCH2CH3-CD28OXZ - SEQ ID № 27)

C. CAR против GD2 представлен как (c) на фиг. 2 (huKM666-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ - SEQ ID № 28)

D. CAR против GD2 представлен как (d) на фиг. 2 (huKM666-HSTK-CD28OXZ - SEQ ID № 29)

E. CAR против GD2 представлен как (e) на фиг. 2 (huKM666-STK-CD28XOXZ - SEQ ID № 30)

F. CAR против GD2 представлен как (f) на фиг. 2 (huKM666-HNG-CD28OXZ - SEQ ID № 31)

G. CAR против GD2 как показано в (c) фиг. 2, но с эндодоменом первой генерации (huKM666-HCH2CH3pvaa-CD28tmZ - SEQ ID № 32)

H. CAR против GD2 как показано в (c) фиг. 2, но с эндодоменом второй генерации (huMK666-HCH2CH3pvaa-CD28Z - SEQ ID № 33)

I. CAR против GD2, совместно экспрессированный с геном самоубийства iCasp9 - SEQ ID № 34

J. CAR против GD2, совместно экспрессированный с геном самоубийства RQR8 - SEQ ID № 35

Фиг. 13 - Структура GD2

Фиг. 14 - Сравнение CAR huK666 и 14g2a. (a) Карты протестированных конструкций: две конструкции тестировали в первичных T-клетках. Обе представляют собой ретровирусные векторы, кодирующие RQR8 и GD2 CAR второй генерации, совместно экспрессированные с FMD-2A-подобной последовательностью. Единственное различие между конструкциями состоит в том, что в одной scFv представляет собой huK666 и в другой он представляет собой 14g2a. T-клетки, трансдуцированные этими конструкциями, стимулировали 1:1 с использованием или A204 (GD2-отрицательная клеточная линия рабдомиосаркомы), и LAN-1 (GD2-положительная клеточная линия). (b) Через 24 часа в супернатанте измеряли интерферон-γ. huK666 CAR T-клетки продуцируют больше интерферона-γ. (c) После одной недели подсчитывали T-клетки, huK666 демонстрируют более высокую пролиферацию.

Фиг. 15 - Проточный цитометрический анализ совместной культуры между вторыми генерациями CAR на основе huK666 или 14g2a и клеточной линией нейробластомы LAN1. (a) Постановка эксперимента. После одной недели совместного культивирования клетки собирали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Экспрессия CD45 позволяла различать лимфоидные клетки и нелимфоидные клетки с CD45- клетками, являющимися клетками LAN-1. Дополнительное окрашивание с использованием CD3/QBEND/10 делало возможным подсчет CAR T-клеток. (b) Только T-клетки; (c) NT T-клетки и клетки LAN-1; (d) T-клетки с huK666-28-Z CAR и клетки LAN-1; (e) T-клетки с 14g2a-28-Z CAR и клетки LAN-1. Остаток клеток LAN-1 наблюдали в совместной культуре с T-клетками 14g2a CAR.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения сконструировали новый химерный антигенный рецептор (CAR), направленный на GD2, который содержит GD2-связывающий домен на основании антитела K666.

Антитело к GD2 14g2a можно рассматривать в качестве золотого стандарта, поскольку его используют в качестве терапевтического антитела и оно представляет собой единственный scFv, тестированный до настоящего времени в исследовании CAR (PMID: 18978797). Авторы настоящего изобретения сравнивали CAR на основе 14g2a и huK666 в формате второй генерации, поскольку он является наиболее широко используемым форматом CAR, который используют в клинических исследованиях. Авторы изобретения обнаружили, что T-клетки с huK666 CAR высвобождают больше IFN-γ, лучше пролиферируют и более полно уничтожают, чем 14g2a эквиваленты.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к химерному антигенному рецептору (CAR), который содержит дисиалоганглиозид (GD2)-связывающий домен, который содержит

a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит определяющие комплементарность области (CDR) со следующими последовательностями:

CDR1 - SYNIH (SEQ ID № 1);

CDR2 - VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID № 2)

CDR3 - RSDDYSWFAY (SEQ ID № 3); и

b) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит CDR со следующими последовательностями:

CDR1 - RASSSVSSSYLH (SEQ ID № 4);

CDR2 - STSNLAS (SEQ ID № 5)

CDR3 - QQYSGYPIT (SEQ ID № 6).

GD2-связывающий домен может содержать VH домен, который имеет последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 9 или SEQ ID № 10; или VL домен, который имеет последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 11 или SEQ ID № 12, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, который сохраняет способность i) связывать GD2 и ii) индуцировать передачу T-клеточных сигналов.

GD2-связывающий домен может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 7 или SEQ ID № 8 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, который сохраняет способность i) связывать GD2 и ii) индуцировать передачу T-клеточных сигналов.

Трансмембранный домен может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 13, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, который сохраняет способность i) связывать GD2 и ii) индуцировать передачу T-клеточных сигналов.

GD2-связывающий домен и трансмембранный домен можно соединять с помощью спейсера.

Спейсер может содержать одно из следующего: Fc домен IgG1 человека; шарнир IgG1; шарнир IgG1-стебель CD8; или стебель CD8.

Спейсер может содержать шарнир IgG1-стебель CD8 или стебель CD8.

Спейсер может содержать Fc домен IgG1 или его вариант.

Спейсер может содержать Fc домен IgG1, который содержит последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 23 или SEQ ID № 24, или ее вариант, который обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей.

CAR может содержать или быть ассоциированным с внутриклеточным доменом передачи T-клеточных сигналов.

Внутриклеточный домен передачи T-клеточных сигналов может содержать один или несколько из следующих эндодоменов: эндодомен CD28; эндодомен OX40 и CD3-ζ.

Внутриклеточный домен передачи T-клеточных сигналов может содержать все из следующих эндодоменов: эндодомен CD28; эндодомен OX40 и CD3-ζ.

CAR может содержать последовательность, представленную в виде любой из SEQ ID № с 26 до 35 или ее варианта, который обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, но сохраняет способность i) связывать GD2 и ii) индуцировать передачу T-клеточных сигналов.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует CAR согласно первому аспекту изобретения.

Последовательность нуклеиновой кислоты может иметь оптимизированные кодоны.

Последовательность нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 25 или ее вариант, обладающий по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей.

Нуклеиновая кислота также может кодировать ген самоубийства.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения.

В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к клетке, которая экспрессирует CAR согласно первому аспекту изобретения. Клетка может представлять собой цитолитическую клетку иммунной системы, такую как T-клетка или естественная киллерная (NK) клетка.

Клетка может совместно экспрессировать CAR согласно первому аспекту изобретения и ген самоубийства.

Ген самоубийства может представлять собой, например, iCasp9 или RQR8.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения клетки согласно четвертому аспекту изобретения, который включает стадию введения нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения в клетку.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит вектор согласно третьему аспекту изобретения или клетку согласно второму аспекту изобретения вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли, который включает стадию введения вектора согласно третьему аспекту изобретения или клетки согласно четвертому аспекту изобретения субъекту.

Злокачественная опухоль может представлять собой нейробластому.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к вектору согласно третьему аспекту изобретения или клетке согласно четвертому аспекту изобретения для применения в лечении злокачественной опухоли.

В девятом аспекте настоящее изобретение относится к применению согласно третьему аспекту изобретения или клетке согласно четвертому аспекту изобретения в получении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли.

В десятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения GD2-экспрессирующей клетки, который включает стадию введения нуклеиновой кислоты, кодирующей GM3-синтазу, и нуклеиновой кислоты, кодирующей GD2-синтазу, в клетку.

В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к GD2-экспрессирующей клетке, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую GM3-синтазу, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую GD2-синтазу.

В двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу стимуляции клетки согласно четвертому аспекту изобретения in vitro, который включает стадию приведения клетки в контакт с GD2-экспрессирующей клеткой согласно одиннадцатому аспекту изобретения.

В тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к экспрессирующей кассете, которая экспрессирует CAR, который содержит область прикрепления каркаса (SAR).

Экспрессирующая кассета может экспрессировать CAR согласно первому аспекту изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ (CAR)

Химерные антигенные рецепторы (CAR), также известные как химерные T-клеточные рецепторы, искусственные T-клеточные рецепторы и химерные иммунорецепторы, представляют собой сконструированные рецепторы, которые придают произвольную специфичность иммунной эффекторной клетке. В классическом CAR специфичность моноклонального антитела придают T-клетке. CAR-кодирующие нуклеиновые кислоты можно переносить на T-клетки, например, с использованием ретровирусных векторов. Таким образом, можно генерировать большое число T-клеток со специфичностью к злокачественным опухолям для адоптивного переноса клеток. В I фазе клинических исследований этого подхода продемонстрирован эффект.

Связывающий целевой антиген домен в CAR обыкновенно сливают через спейсер и трансмембранный домен с сигнальным эндодоменом. Когда CAR связывает целевой антиген, это ведет к передаче активирующего сигнала на T-клетку, которая его экспрессирует.

CAR по настоящему изобретению содержит GD2-связывающий домен, который основан на моноклональном антителе KM666 (Nakamura et al (2001) Cancer Immunol. Immunother. 50:275-284).

CAR по настоящему изобретению содержит GD2-связывающий домен, который содержит

a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) со следующими последовательностями:

CDR1 - SYNIH (SEQ ID № 1);

CDR2 - VIWAGGSTNYNSALMS (SEQ ID № 2)

CDR3 - RSDDYSWFAY (SEQ ID № 3); и

b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR со следующими последовательностями:

CDR1 - RASSSVSSSYLH (SEQ ID № 4);

CDR2 - STSNLAS (SEQ ID № 5)

CDR3 - QQYSGYPIT (SEQ ID № 6).

Может быть возможно вводить одну или несколько мутаций (замен, добавлений или делеций) в или каждый CDR, не оказывая отрицательного влияния на GD2-связывающую активность. Каждый CDR, например, может иметь одну, две или три аминокислотных мутации.

CAR по настоящему изобретению может содержать одну из следующих аминокислотных последовательностей:

SEQ ID № 7 (последовательность KM666 мыши)

QVQLKESGPVLVAPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLQMNSLQTDDTAMYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLVTVSASGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKVWIYSTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPITFGAGTKVEVKR

SEQ ID № 8 (последовательность гуманизированного KM666)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGKAPKVWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPITFGQGTKVEIKR

CAR по настоящему изобретению может содержать одну из следующих последовательностей VH:

SEQ ID № 9 (последовательность VH из KM666 мыши)

QVQLKESGPVLVAPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLQMNSLQTDDTAMYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLVTVSA

SEQ ID № 10 (последовательность VH гуманизированного KM666)

QVQLQESGPGLVKPSQTLSITCTVSGFSLASYNIHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTNYNSALMSRLTISKDNSKNQVFLKMSSLTAADTAVYYCAKRSDDYSWFAYWGQGTLVTVSS

CAR по настоящему изобретению может содержать одну из следующих последовательностей VL:

SEQ ID № 11 (последовательность VL из KM666 мыши)

ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKVWIYSTSNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPITFGAGTKVEVK

SEQ ID № 12 (последовательность VH гуманизированного KM666)

ENQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGKAPKVWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSGYPITFGQGTKVEIK

CAR по изобретению может содержать вариант последовательности, которая представлена в виде SEQ ID № 7, 8, 9, 10, 11 или 12, обладающий по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью последовательностей, при условии, что вариант последовательности сохраняет способность связывать GD2 (когда в сочетании с комплементарным доменом VL или VH, если уместно).

Процентная доля идентичности между двумя полипептидными последовательностями можно легко определять с помощью программ, таких как BLAST, которая свободно доступна по адресу http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.

ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕН

CAR по изобретению также может содержать трансмембранный домен, который пронизывает мембрану. Он может содержать гидрофобную альфа-спираль. Из CD28 можно извлекать трансмембранный домен, который дает хорошую стабильность рецептора.

Трансмембранный домен может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 13.

SEQ ID № 13

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ДОМЕН T-КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ (ЭНДОДОМЕН)

Эндодомен представляет собой часть CAR, которая передает сигнал. После распознавания антигена рецепторы образуют кластер и происходит передача сигнала в клетку. Наиболее широко используемым эндодоменным компонентом является таковой из CD3-ζ, который содержит 3 ITAM. Это передает активационный сигнал в T-клетку после связывания антигена. CD3-ζ может не предоставлять полностью компетентный активационный сигнал и может быть необходима передача дополнительного костимуляторного сигнала. Например, химерный CD28 и OX40 можно использовать с CD3-ζ для того, чтобы передавать пролиферативный сигнал/сигнал выживаемости или все три можно использовать вместе.

Эндодомен CAR по настоящему изобретению может содержать эндодомен CD28 и OX40 и CD3-ζ эндодомен.

Трансмембранный и внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации (эндодомен) в CAR по настоящему изобретению может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 14, 15, 16, 17 или 18, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей.

SEQ ID № 14 (эндодомен CD28)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY

SEQ ID № 15 (эндодомен CD40)

RSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI

SEQ ID № 16 (эндодомен CD3ζ)

RSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID № 17 (CD28Z)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID № 18 (CD28OXZ)

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Вариант последовательности может иметь по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательностей с SEQ ID № 13, 14, 15, 16, 17 или 18, при условии, что последовательность предусматривает эффективный трансмембранный домен/внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации.

СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД

CAR по настоящему изобретению может содержать сигнальный пептид с тем, чтобы когда CAR экспрессируют внутри клетки, такой как T-клетка, направлять синтезированный белок к эндоплазматическому ретикулуму и впоследствии к клеточной поверхности, где он будет экспрессирован.

Сердцевина сигнального пептида может содержать длинный участок из гидрофобных аминокислот, которые обладают склонностью к формированию одной альфа-спирали. Сигнальный пептид может начинаться коротким положительно заряженным участком аминокислот, который помогает укрепить надлежащую топологию полипептида во время транслокации. В конце сигнального пептида типично имеет место участок из аминокислот, который распознает и расщепляет сигнальная пептидаза. Сигнальная пептидаза может расщеплять или во время или после завершения транслокации для того, чтобы создавать свободный сигнальный пептид и зрелый белок. Затем специфичные протеазы расщепляют свободные сигнальные пептиды.

Сигнальный пептид может находиться на аминоконце молекулы.

CAR по изобретению может иметь общую формулу:

Сигнальный пептид - GD2-связывающий домен - спейсерный домен - трансмембранный домен - внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации.

Сигнальный пептид может содержать SEQ ID № 19 или ее вариант, который имеет 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотную мутацию (инсерции, замены или добавления) при условии, что сигнальный пептид все еще функционирует для того, чтобы обуславливать экспрессию CAR на клеточной поверхности.

SEQ ID № 19: METDTLLLWVLLLWVPGSTG

Сигнальный пептид из SEQ ID № 19 является компактным и высоко эффективным. Предсказано, что он дает приблизительно 95% расщепление после концевого глицина, давая эффективное удаление с помощью сигнальной пептидазы.

СПЕЙСЕР

CAR по настоящему изобретению может содержать спейсерную последовательность для того, чтобы соединять GD2-связывающий домен с трансмембранным доменом и пространственно отделять GD2-связывающий домен от эндодомена. Гибкий спейсер позволяет ориентировать GD2-связывающий домен в различных направлениях, чтобы сделать возможным связывание GD2.

Спейсерная последовательность, например, может содержать Fc-область IgG1, шарнир IgG1 или стебель CD8 или их сочетание. Альтернативно спейсер может содержать альтернативную последовательность, которая имеет схожую длину и/или свойства разнесения доменов, как Fc-область IgG1, шарнир IgG1 или стебель CD8.

Спейсер из IgG1 человека можно изменять для того, чтобы удалять мотивы связывания Fc.

Примеры аминокислотных последовательностей для этих спейсеров приведены далее:

SEQ ID № 20 (шарнир-CH2CH3 из IgG1 человека)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD

SEQ ID № 21 (стебель CD8 человека):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI

SEQ ID № 22 (шарнир IgG1 человека):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK

SEQ ID № 23 (шарнир-Fc IgG1)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

SEQ ID № 24 (шарнир IgG1-Fc, модифицированный для того, чтобы удалять мотивы распознавания Fc рецептора)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVA*GPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

Модифицированные остатки подчеркнуты; * обозначает делецию.

GD2

GD2 представляет собой дисиалоганглиозид, экспрессируемый на опухолях нейроэктодермального происхождения, включая нейробластому и меланому человека, при этом экспрессия на нормальных тканях крайне ограничена, у человека главным образом мозжечком и периферическими нервами.

Относительно опухолеспецифичная экспрессия GD2 делает его подходящей мишенью для иммунотерапии.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Второй аспект изобретения относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует CAR по первому аспекту изобретения.

Последовательность нуклеиновой кислоты может быть способна кодировать CAR, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в виде любой из SEQ ID №№ 26-35.

Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой или содержать следующую последовательность:

SEQ ID № 25 ДНК последовательность ретровирусной кассеты, содержащей CAR против GD2, совместно экспрессированный с геном самоубийства RQR8 с рамкой с оптимизированными кодонами и областью SAR для усиления экспрессии

Последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать ту же аминокислотную последовательность, которую кодирует SEQ ID № 25, но может иметь другую последовательность нуклеиновой кислоты, из-за вырожденности генетического кода. Последовательность нуклеиновой кислоты может обладать по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичностью с последовательностью, которая представлена в виде SEQ ID № 25, при условии, что она кодирует CAR, как определено в первом аспекте изобретения.

ГЕНЫ САМОУБИЙСТВА

Поскольку T-клетки являются пересаженными и автономными, средство избирательного удаления CAR T-клеток у реципиентов T-клеток с CAR против GD2 является желаемым. Гены самоубийства представляют собой генетически кодируемые механизмы, которые ведут к избирательному разрушению инфузированных T-клеток в присутствии приемлемой токсичности. Самым ранним клиническим опытом с генами самоубийства является тимидинкиназа вируса герпеса (HSV-TK), которая делает T-клетки восприимчивыми к ганцикловиру. HSV-TK представляет собой высокоэффективный ген самоубийства. Однако предварительно сформированный иммунный ответ может ограничивать ее использование в клинической ситуации существенной иммуносупрессии, такой как трансплантация гаплоидентичных стволовых клеток. Индуцибельная каспаза 9 (iCasp9) представляет собой ген самоубийства, сконструированный посредством замены активирующего домена каспазы 9 на модифицированный FKBP12. iCasp9 активируют с помощью в остальном инертного низкомолекулярного химического индуктора димеризации (CID). iCasp9 в последнее время тестировали в ситуации гаплоидентичной HSCT, и он может останавливать GvHD. Наибольшим ограничением iCasp9 является зависимость от доступности проприетарного CID для клинического применения. Как iCasp9, так и HSV-TK представляют собой внутриклеточные белки, так что при использовании в качестве единственного трансгена, их следует экспрессировать совместно с маркерным геном для того, чтобы сделать возможным отбор трансдуцированных клеток.

iCasp9 может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 36 или ее вариант, обладающую по меньшей мере 80, 90, 95 или 98% идентичностью последовательностей.

SEQ ID № 36

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS

Авторы настоящего изобретения в последнее время описали новый маркер/ген самоубийства, известный как RQR8, который можно обнаруживать с использованием антитела QBEnd10 и экспрессирующих клеток, лизированных терапевтическим антителом ритуксимаб.

RQR8 может содержать последовательность, которая представлена в виде SEQ ID № 37 или ее варианта, обладающей по меньшей мере 80, 90, 95 или 98% идентичностью последовательностей.

SEQ ID № 37

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV

Ген самоубийства можно экспрессировать в виде одного полипептида с CAR, например, с использованием саморасщепляющегося пептида между двумя последовательностями.

ВЕКТОР

Настоящее изобретение также относится к вектору, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Такой вектор можно использовать для того, чтобы вводить последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина с тем, чтобы она экспрессировала и продуцировала молекулу согласно первому аспекту изобретения.

Вектор, например, может представлять собой плазмиду или вирусный вектор, такой как ретровирусный вектор или лентивирусный вектор.

Вектор может быть способен к трансфекции или трансдукции T-клетки.

Вектор также может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген самоубийства, такой как iCasp9 или RQR8.

КЛЕТКА-ХОЗЯИН

Изобретение также относится к клетке-хозяину, которая содержит нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением. Клетка-хозяин может быть способна экспрессировать CAR согласно первому аспекту изобретения.

Клетка-хозяин может представлять собой цитолитическую клетку иммунной системы, такую как T-клетка или естественная киллерная (NK) клетка человека.

T-клетку, способную экспрессировать CAR в соответствии с изобретением, можно создавать посредством трансдукции или трансфекции T-клетки CAR-кодирующей нуклеиновой кислотой.

CAR T-клетку можно создавать ex vivo. T-клетка может быть из образца мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от пациента или донора. T-клетки можно активировать и/или размножать перед трансдукцией CAR-кодирующей нуклеиновой кислотой, например, посредством обработки моноклональным антителом против CD3.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вектор или CAR-экспрессирующую T-клетку по изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом и необязательно один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Такой состав может быть, например, в форме, подходящей для внутривенной инфузии).

СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ

T-клетки, экспрессирующие молекулу CAR по настоящему изобретению, способны уничтожать клетки злокачественной опухоли, такие как клетки нейробластомы. CAR-экспрессирующие T-клетки можно создавать или ex vivo или из собственной периферической крови пациента (первая сторона) или в ситуации трансплантата гематопоэтических стволовых клеток из периферической крови донора (вторая сторона) или из периферической крови от несвязанного донора (третья сторона). Альтернативно, CAR T-клетки можно получать через дифференциацию индуцибельных клеток-предшественников или эмбриональных клеток-предшественников в T-клетки ex vivo. В этих случаях CAR T-клетки создают посредством введения ДНК или РНК, кодирующей CAR, с помощью одного из многих средств, включая трансдукцию вирусным вектором, трансфекцию ДНК или РНК.

T-клетки, экспрессирующие молекулу CAR по настоящему изобретению, можно использовать для лечения злокачественного заболевания, в частности, злокачественного заболевания, связанного с экспрессией GD2.

Злокачественная опухоль может представлять собой эктодермальную опухоль.

Примеры злокачественных опухолей, которые коррелируют с повышенными уровнями экспрессии GD2, представляют собой: нейробластому, меланому, медуллобластому, саркомы мягких тканей, остеосаркому и мелкоклеточные злокачественные опухоли легких, такие как NSCLC.

Способ лечения заболевания относится к терапевтическому использованию вектора или T-клетки по изобретению. В этом отношении, вектор или T-клетку можно вводить субъекту, обладающему существующим заболеванием или состоянием для того, чтобы уменьшать, снижать или улучшать по меньшей мере один симптом, связанный с заболеванием, и/или замедлять, снижать или блокировать прогрессирование заболевания. Способ по изобретению может вызывать или ускорять опосредованное T-клетками уничтожение GD2-экспрессирующих клеток, таких как клетки злокачественной опухоли.

GD2-ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ КЛЕТКА

Изобретение также относится к способу получения GD2-экспрессирующей клетки, который включает стадию введения нуклеиновой кислоты, кодирующей GM3-синтазу, и нуклеиновой кислоты, кодирующей GD2-синтазу, в клетку.

Нуклеиновую кислоту можно вводить, например, посредством трансфекции или трансдукции, с использованием вектора, такого как плазмида или вирусный вектор.

Изобретение также относится к GD2-экспрессирующей клетке, которая содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая кодирует GM3-синтазу, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, которая кодирует GD2-синтазу.

Нуклеиновая кислота может быть «гетерологичной» в том смысле, что она обычно не присутствует в клетке. Она представляет собой искусственно введенную рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты.

Клетка может быть из клеточной линии.

Клетку можно использовать для стимуляции GD2CAR T-клеток в культуре, таких как T-клетки по настоящему изобретению.

Далее изобретение дополнительно описано в виде примеров, которые предназначены помогать специалисту в данной области при осуществлении изобретения и не предназначены для того, чтобы каким-либо образом ограничивать объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Использование гуманизированного антитела huK666 в качестве связывающего средства

CAR конструировали с scFvs, используя последовательности или из антитела KM666 мыши или из его гуманизированной версии huK666, как описано у Nakamura et al (2001 - выше) (варианты (a) и (b) выше на фиг. 2). Эти рецепторы сравнивали по экспрессии/стабильности и обнаружили, что они равны для обоих рецепторов. Затем тестировали уничтожение, высвобождение цитокинов и пролиферацию T-клеток, трансдуцированных этими рецепторами, когда стимулировали целевыми клетками, или не экспрессирующими или экспрессирующим GD2. Пришли к заключению о том, что уничтожение у обоих рецепторов было схожим, но рецептор, основанный на гуманизированном scFv, приводил к превосходящему продуцированию IL-2 и пролиферации (фиг. 3).

Пример 2 - Тестирование эффектов различных форматов спейсеров, оказываемых на экспрессию и функцию

Создавали CAR против GD2 с Fc спейсером, шарниром, шарниром-стеблем CD8 и стеблем CD8 (фиг. 2 (b), (d), (e) и (f) соответственно). Эти CAR совместно экспрессировали с маркерным геном, усеченным CD34, обязательным образом 1:1 с саморасщепляющимся пептидом 2A ящура для того, чтобы сделать возможным точное сравнение (фиг. 4a). Кроме того, scFv huK666 помечали аминоконцевой меткой HA для того, чтобы сделать возможным сравнение экспрессию CAR трансгенным вирусом.

Проточный цитометрический анализ T-клеток нормального донора, трансдуцированных этими конструкциями, демонстрировал более яркую экспрессию CAR в следующем порядке: Fc > шарнир-стебель=стебель > шарнир (фиг. 4b).

Уничтожение GD2-положительных мишеней по отношению к GD2-отрицательным мишеням сравнивали с использованием анализа высвобождения хрома. Он демонстрировал эффективность уничтожения в следующем порядке: Fc > шарнир-стебель=стебель > шарнир (фиг. 4c).

Высвобождение интерферона-γ и высвобождение IL-2 сравнивали, когда CAR T-клетки стимулировали GD2-положительными или -отрицательными мишенями. Высвобождение интерферона-γ схоже у CAR с Fc, шарниром-стеблем и стеблем, но меньше в варианте с шарниром. Высвобождение IL-2 обнаруживали в следующем порядке: Fc, стебель, шарнир-стебель, шарнир (фиг. 4d и e).

Наконец, пролиферацию CAR T-клеток сравнивали, когда CAR T-клетки стимулировали GD2-положительными или -отрицательными мишенями. Пролиферацию обнаруживали в следующем порядке: стебель, шарнир-стебель, Fc, шарнир (фиг. 4d и e)

Пример 3 - Мутации FcR устраняют неспецифичную активность

Совокупные данные из приведенных выше примеров подсказывают, что спейсер Fc работает лучше всего. Однако Fc домен in vivo может вести к неспецифической активации от клеток, которые экспрессируют Fc рецепторы. Чтобы устранять этот эффект вводили мутации в Fc-область, как показано на фиг. 5(a). Эти мутации не оказывали нежелательных эффектов на экспрессию CAR, как показано на фиг. 5(b).

Кроме того, показано, что эти мутации не оказывали эффекта на функцию уничтожения CAR (фиг. 5(c)). Наконец, показано, что эти мутации оказывали желаемый эффект в отношении неспецифичного уничтожения FcR-экспрессирующих мишеней (моноцитоидная линия, называемая THP1) и высвобождения IL-1β этими моноцитами (фиг. 5e).

Пример 4 - Оптимизация экспрессирующей кассеты

Ввиду оптимизации экспрессии рецептора тестировали следующее: (a) включение области прикрепления каркаса (SAR) в кассету; (b) включение инсулятора хроматина β-гемоглобина курицы (CHS4) в 3ʹLTR и (c) оптимизацию кодонов открытой рамки считывания (фиг. 6a). Показано, что включение SAR усовершенствовало свойства экспрессии, как делала оптимизация кодонов, тогда как CHS4 оказывал небольшой эффект (фиг. 6b). Объединение SAR и оптимизации кодонов аддитивно усовершенствовало экспрессию (фиг. 6c)

Пример 5 - Сравнение различных эндодоменов

Создавали конструкции с тремя различными эндодоменами: трансмембранный домен CD28 с эндодоменом CD3-ζ (CD28tmZ); трансмембранный домен CD28 с эндодоменом CD28 и эндодоменом CD3-ζ (CD28Z) и трансмембранный домен CD28, эндодомен CD28, эндодомен OX30 и эндодомен CD3-ζ (CD28OXZ) с CAR в формате с Fc спейсером. Отмечали увеличение пролиферации, высвобождения IFN-γ и высвобождения IL-2 в порядке CD28tmZ < CD28Z < CD28OXZ (фиг. 7).

Пример 6 - Коэкспрессия с геном самоубийства iCasp9

Ген самоубийства iCasp9 совместно экспрессировали с CAR против GD2 (фиг. 8a - CAR был в формате Fc-спейсера, CD28OXZ выбирали произвольно, чтобы продемонстрировать функцию). CAR мог быть хорошо экспрессирован, несмотря на коэкспрессию с iCasp9 (фиг. 8b). Активация iCasp9 с использованием низкомолекулярного димеризатора вела к удалению CAR положительных T-клеток (фиг. 8b). T-клетки iCasp9-GD2CAR, которые подвергали воздействию этого димеризатора, теряли свою GD2-специфичность, когда на них воздействовал димеризатор (фиг. 8c).

Пример 7 - Коэкспрессия с геном самоубийства RQR8

CAR против GD2 совместно экспрессировали с геном самоубийства наподобие RQR8 (фиг. 9a - CAR был в формате Fc-спейсера, CD28Z выбирали произвольно для того, чтобы продемонстрировать функцию). Было возможно совместно экспрессировать рецептор и CAR (фиг. 9b). Активация функции гена самоубийства RQR8 с использованием ритуксимаба и комплемента приводила к удалению трансдуцированных T-клеток и утрате распознавания GD2 (фиг. 9 c и d).

Пример 8 - Экспрессия GD2-синтазы и GM3-синтазы ведет к экспрессии GD2 в любой клеточной линии

Для того чтобы стимулировать T-клетки GD2CAR в культуре, чтобы иметь идеальные GD2- или GD2+ мишени и иметь возможность создавать сигненные клетки для моделей на небольших животных, желательно иметь возможность трансгенной экспрессии GD2 на клеточной линии. GD2 не является белком и требует синтеза с помощью сложного набора ферментов. Здесь показано, что трансгенная экспрессия только двух ферментов - GM3-синтазы и GD2-синтазы - ведет к яркой экспрессии GD2 во всех клеточных линиях, трансдуцированных до настоящего момента (фиг. 10).

Пример 9 - Функция CAR против GD2 in vivo

Конструировали клеточную линию CT26 для того, чтобы экспрессировать GD2, как описано выше (обозначена CT26 клон #7 или кратко CT25#7). Или 2×10⁵ клеток дикого типа или GD2-положительных CD26 клеток инокулировали в бока мышей C57BL/6 (сингенные с CT26). Через 10 суток после опухолевого стимула получали трансдуцированные имитатором и трансдуцированные CAR против GD2 сингенные спленоциты. Мышей делили на следующие 4 когорты: мыши с GD2-экспрессирующими CT26 опухолями, получающие спленоциты с CAR против GD2; GD2-экспрессирующие CT26 опухоли, получающие трансдуцированные имитатором спленоциты; GD2-отрицательные (дикого типа) CT26 опухоли со спленоцитами с CAR против GD2; и GD2-экспрессирующие CT26 опухоли, не получающие спленоциты. Опухоль измеряли с использованием цифрового штангенциркуля в 3 измерениях и при этом оценивали объем. На фиг. 11 представлены кривые роста опухолей. Только GD2-положительные опухоли у мышей, получающих T-клетки с CAR против GD2, имели небольшой или нулевой рост.

Пример 10 - Сравнение функций CAR, содержащих антигенсвязывающие домены, основанные на huK666 и 14g2a

Антигенсвязывающий домен CAR может влиять на его функцию. В этом исследовании функция CAR по изобретению с антигенсвязывающим доменом на основании huK666 с CAR сравнивали с эквивалентным CAR, имеющим антигенсвязывающий домен на основании 14g2a.

Антитело 14g2a можно рассматривать в качестве золотого стандарта антитела против GD2, поскольку его используют в качестве терапевтического mAb и оно является единственным scFv, который тестировали в исследовании CAR.

CAR второй генерации конструировали и экспрессировали на основании huK666 или 14g2a. Их структура представлена на фиг. 14a.

Ретровирусы получали посредством временной трансфекции клеток 293T плазмидами, кодирующими GD2 CAR, gag/pol и оболочечный белок RD114. После 3 суток супернатанты собирали и использовали для того, чтобы трансдуцировать PHA/IL-2-активированные PBMC с использованием равных титров ретровируса на чашках, покрытых ретронектином. CAR различались только их антигенсвязывающим доменом. В обоих случаях связывающие домены были соединены с мембраной с использованием Fc сегмента IgG и содержали внутриклеточные активирующие мотивы из CD28 и CD3-ζ. Через шесть суток после трансдукции CAR-экспрессию подтверждали с помощью проточной цитометрии и PBMC культивировали в соотношении 1:1 к GD2-положительными клетками Lan1 (GD2-положительная клеточная линия) или GD2-отрицательными клетками A204 (GD2-отрицательная клеточная линия рабдомиосаркомы). После одних суток супернатанты из этих совместных культур анализировали на уровни интерферона-γ с помощью ELISA и оценивали T-клеточную пролиферация с помощью проточной цитометрии после 6 суток.

Результаты представлены на фиг. 14 и 15. На 24 часа в супернатанте измеряли интерферон-γ. Показано, что T-клетки с huK666 CAR продуцируют больше IFN-γ (фиг. 14b). После одной недели T-клетки считали и было показано, что huK666 CAR имеет более высокую пролиферацию (фиг. 14c).

После одной недели совместной культуры с клеточной линией нейробластомы LAN1, клетки собирали и анализировали посредством проточной цитометрии. Экспрессия CD45 делала возможно дифференциацию лимфоидных клеток и нелимфоидных клеток с CD45- клетками, которые представляют собой клетки LAN-1. Кроме того, окрашивание с использованием CD3/QBEND/10 делало возможным подсчет T-клеток с CAR. Обнаружено, что T-клетки с huK666 CAR пролиферируют лучше и уничтожают более полно, чем 14g2a эквиваленты (фиг. 15).

Все публикации, упомянутые выше в описании, включены в настоящий документ посредством ссылки. Специалистам в данной области будут видны различные модификации и вариации описанных способов и системы по изобретению, не отступающие от объема и сущности изобретения. Несмотря на то, что изобретение описано применительно к конкретным предпочтительным вариантам осуществления, следует понимать, что изобретение, как заявлено, не следует чрезмерно ограничивать такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в молекулярной биологии или связанных областях, предназначены для включения в объем следующей формулы изобретения.

1. Химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий:

i) дисиалоганглиозид (GD2)-связывающий домен, который содержит

a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую VH домен, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10, и

b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую VL домен, который имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12;

ii) спейсерный домен;

iii) трансмембранный домен; и

iv) внутриклеточный домен T-клеточной сигнализации.

2. CAR по п.1, в котором GD2-связывающий домен содержит последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 8.

3. CAR по п.1, который содержит трансмембранный домен, который содержит последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 13, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей.

4. CAR по п.1, в котором GD2-связывающий домен и трансмембранный домен соединены с помощью спейсера.

5. CAR по п.4, в котором спейсер содержит одно из следующего: Fc домен IgG1 человека; шарнир IgG1; шарнир IgG1-стебель CD8 или стебель CD8.

6. CAR по п.5, в котором спейсер содержит шарнир IgG1 - стебель CD8 или стебель CD8.

7. CAR по п.5, в котором спейсер содержит Fc домен IgG1 или его вариант.

8. CAR по п.7, в котором спейсер содержит Fc домен IgG1, который содержит последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 24, или ее вариант, обладающий по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей.

9. CAR по п.1, который содержит внутриклеточный домен передачи T-клеточных сигналов.

10. CAR по п.9, в котором внутриклеточный домен передачи T-клеточных сигналов содержит один или несколько из следующих эндодоменов: эндодомен CD28; эндодомен OX40 и CD3-ζ.

11. CAR по п.10, в котором внутриклеточный домен передачи T-клеточных сигналов содержит все из следующих эндодоменов: эндодомен CD28; эндодомен OX40 и CD3-ζ.

12. CAR по п.1, который содержит последовательность, представленную в виде любой из SEQ ID NO:NO: 27-35.

13. Нуклеиновая кислота, которая кодирует CAR по любому из пп. 1-12.

14. Нуклеиновая кислота по п.13, в которой оптимизированы кодоны.

15. Нуклеиновая кислота по п.13, которая содержит последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 25.

16. Нуклеиновая кислота по п.13, которая также кодирует ген самоубийства.

17. Вектор экспрессии, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 13-16.

18. T-клетка, способная уничтожать клетку-мишень, экспрессирующую GD2, причем Т-клетка экспрессирует CAR по любому из пп. 1-12 и получена путем трансфекции или трансдукции вектором по п.17.

19. T-клетка, способная уничтожать клетку-мишень, экспрессирующую GD2, причем Т-клетка совместно экспрессирует CAR по любому из пп. 1-12 и ген самоубийства и получена путем трансфекции или трансдукции вектором по п.17.

20. T-клетка по п.19, в которой ген самоубийства представляет собой iCasp9 или RQR8.

21. Способ получения T-клетки по любому из пп. 18-20, который включает стадию введения в T-клетку вектора по п.17.

22. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей GD2, которая содержит T-клетку по любому из пп. 18-20 вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом.

23. Способ лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей GD2, который включает стадию введения T-клетки по любому из пп. 18-20 пациенту.

24. Способ по п.23, в котором злокачественная опухоль представляет собой нейробластому.

25. T-клетка по любому из пп. 18-20 для применения в лечении злокачественной опухоли.

26. Применение T-клетки по любому из пп. 18-20 в получении лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей GD2.