Среды и способы ферментации для производства полисахаридов в бактериальной клеточной культуре

Авторы патента:

ЛАСКО Дэниэл Р. (US)

ЛОТВИН Джейсон Арнольд (US)

ДЕСАИ Сунил Гурурао (US)

ХЭНСОН Майкл Аллен (US)

КИНРОСС Джонатан Патрик (US)

ЛОМБЕРК Скотт Эллис (US)

ПАТЕЛ-БРАУН Суджата Каушибхай (US)

СУНЬ Вэйцян (US)

ТОМАСЕЛЛО Питер Энтони (US)

C12R1/46 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

C12P19/04 - полисахариды, т.е. соединения, содержащие более пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

Владельцы патента RU 2761633:

ПФАЙЗЕР ИНК. (US)

Группа изобретений относится к полисахарид-продуцирующей бактериальной среде для культивирования Streptococcus pneumoniae или Streptococcus agalactiae и ее использованию. Предложена полисахарид-продуцирующая бактериальная среда для культивирования Streptococcus pneumoniae или Streptococcus agalactiae, содержащая общую концентрацию аминокислоты по меньшей мере 60 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток, общую концентрацию глицина от 1,5 мМ и 60 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток, общую концентрацию хлорида калия от 0,3 до 24 г/л и источник глюкозы. При этом указанная общая концентрация аминокислоты содержит аминокислоту, выбранную из аргинина, аспарагина, цистеина, глутамина, глицина, серина и тирозина. Указанную среду используют в способе культивирования бактерий, производящих полисахариды, выбранных из Streptococcus pneumoniae и Streptococcus agalactiae. Группа изобретений обеспечивает улучшение роста и продукции капсулярного полисахарида Streptococcus pneumoniae или Streptococcus agalactiae при культивировании. 2 н. и 32 з.п. ф-лы, 29 табл., 17 пр.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к средам и способам ферментации для производства полисахаридов в бактериальной клеточной культуре. В одном из аспектов, изобретение относится к сложной среде для культивирования, включающей растительный гидролизат, экстракт дрожжей и источник углерода. В другом аспекте изобретение относится к средам определенного состава с общей концентрацией аминокислот, больше чем приблизительно 50 мМ. Дополнительный аспект изобретения относится к использованию способов культивирования с подпиткой и способов перфузионной ферментации для культивирования бактерий, производящих полисахариды.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Полисахарид клеточной поверхности относится к полисахариду, имеющему, по меньшей мере, часть, расположенную на самой внешней мембране бактериальной клетки или бактериальной клеточной поверхности, включая слой пептидогликанов, клеточную стенку, и капсулу. Полисахариды клеточной поверхности, в частности, капсулярные полисахариды, становятся все более важными в качестве терапевтических средств. Как правило, полисахарид клеточной поверхности связан с возникновением иммунного ответа in vivo. Некоторые примеры полисахаридных вакцин включают PNEUMOVAX^®23, которая представляет собой 23-валентную вакцину для профилактики инвазивного заболевания, такого как пневмония, фебрильная бактериемия, и менингит, вызываемого Streptococcus pneumoniae; MENCEVAX^®, представляет собой квадривалентную вакцину для профилактики инвазивного заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis; TYPHERIX^® и TYPHIM VI^®, которые предотвращают брюшной тиф, вызываемый Salmonella typhi Vi.

Хотя полисахариды иммуногенны по своей природе, конъюгация полисахаридов с белковыми носителями была использована для улучшения иммуногенности, особенно у младенцев и пожилых людей. Химическое связывание полисахарида и белка-носителя вызывает иммунный ответ против бактерий, демонстрирующих полисахариды, содержащиеся в вакцине, на их поверхности, таким образом, предотвращая заболевание. Таким образом, вакцинация с использованием полисахаридов из патогенных бактерий является потенциальной стратегией повышения иммунитета хозяина.

В настоящее время существует несколько доступных вакцин с конъюгатом полисахарид-белок и еще несколько разрабатываются для решения неудовлетворенных потребностей в терапевтических областях. Например, существуют три пневмококковые конъюгатные вакцины, используемые для защиты от инвазивного пневмококкового заболевания, доступные на мировом рынке: PREVNAR^® (в некоторых странах называется PREVENAR^®) (гептавалентная вакцина), SYNFLORIX^® (декавалентная вакцина) и PREVNAR 13^® (тридекавалентная вакцина). MENINGITEC^®, MENJUGATE^® и NEISVAC-C^® представляют собой вакцины с конъюгатом менингококковой серогруппы C, в то время как MENVEO^®, MENACTRA^® и NIMENRIX^® представляют собой квадривалентные вакцины с менингококковым конъюгатом, которые защищают против серогрупп A, C, Y и W-135 N. meningitidis. HIBERIX^® предотвращает заболевание, вызываемое Haemophilus influenzae типа b.

Отдельные моновалентные конъюгаты полисахарид-белок Streptococcus agalactiae, также известного как стрептококк группы B (GBS), серотипов Ia, Ib, II, III, и V оценивали в фазах 1 и 2 клинических испытаний у не-беременных взрослых (Brigtsen, A.K., et al., Journal of Infectious Diseases, 185(9):1277-1284 (2002); Baker, C.J., et al., J. Infect. Dis., 188(1):66-73 (2003); Baker, C.J., et al., J. Infect. Dis., 189(6):1103-1112 (2004); Baker, C.J., et al., Vaccine, 25(1):55-63 (2007)). Также были исследованы бивалентные вакцины с гликоконъюгатами II-TT и III-TT и тривалентная вакцина, содержащая гликоконъюгаты Ia-CRM₁₉₇, Ib-CRM₁₉₇ и III-CRM₁₉₇ (Baker JID 2003; Clicaltrials.gov NCT01193920, NCT01412801, и NCT01446289). Однако ни одна из вакцин GBS еще не одобрена.

Также разрабатывается вакцина, содержащая конъюгат капсулярного полисахарида и белка, для профилактики инфицирования послеоперационной раны, вызываемого Staphylococcus aureus (Anderson, A.S., et al., Hum. Vaccin. Immunother., 8(11):1585-1594 (2012)).

Таким образом, существует необходимость в развитии улучшенных систем для производства полисахаридов бактериальной клеточной культурой.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Чтобы удовлетворить эти и другие потребности, настоящее изобретение относится к средам и способам ферментации для получения полисахаридов в бактериальной клеточной культуре и включает изобретение, раскрытое в предварительной заявке США № 62/256347, поданной 17 ноября 2015 года, таким образом, включенной в качестве ссылки по всей полноте. В следующих разделах описываются некоторые аспекты и варианты осуществления изобретения.

Один из аспектов изобретения относится к полисахарид-продуцирующей среде для культивирования бактериальных клеток, содержащей растительный гидролизат, экстракт дрожжей и источник углерода. В одном из вариантов осуществления растительный гидролизат может представлять собой соевый гидролизат, такой как HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.), HYPEP 4601 (Kerry Group Services Ltd.), HYPEP 5603 (Kerry Group Services Ltd.), HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.), AMI-SOY (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY BL4 (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY BL7 (Kerry Group Services Ltd.), SHEFTONE D (Kerry Group Services Ltd.), SE50M, SE50MK, соевый пептон, BACTO Soytone (Difco Laboratories Inc.), NUTRISOY 2207 (Archer Daniels Midland Company (ADM)), NUTRISOY (ADM), NUTRISOY FLOUR (ADM), или жмых соевых бобов. В другом варианте осуществления концентрация соевого гидролизата может составлять приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 75 г/л, такая как приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 50 г/л, или приблизительно от 28 г/л.

В дополнительном варианте осуществления экстракт дрожжей может представлять собой дрожжевой аутолизат, ультрафильтрованный экстракт дрожжей или синтетический экстракт дрожжей. В конкретном варианте осуществления экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей, такой как AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.), BD DIFCO (BD Biosciences), HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.), или ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.). В еще одном варианте осуществления концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно от 1 г/л до приблизительно 50 г/л, такая как приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л, или приблизительно 10 г/л.

В одном из вариантов осуществления источник углерода может представлять собой глюкозу, декстрозу, маннит, лактозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, рафинозу, ксилозу или маннозу. В конкретном варианте осуществления источник углерода представляет собой глюкозу. В дополнительном варианте осуществления концентрация источника углерода составляет приблизительно от 25 г/л до приблизительно 100 г/л, такая как приблизительно от 50 г/л до приблизительно 90 г/л, или приблизительно 80 г/л.

В одном из вариантов осуществления среда дополнительно содержит фосфат-содержащий ингредиент, такой как Na₂HPO₄, K₂HPO₄или KH₂PO₄.

В другом варианте осуществления среда дополнительно содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, витамин, нуклеозид или неорганическую соль.

Другой аспект изобретения относится к химически-определенной полисахарид-продуцирующей среде для культивирования бактериальных клеток с общей концентрацией аминокислот, больше чем приблизительно 50 мМ. В одном из вариантов осуществления среда содержит общую концентрацию глицина приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 60,0 мМ, такую как приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, или приблизительно 7,5 мМ. В другом варианте осуществления среда содержит общую концентрацию аргинина приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, такую как приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, или приблизительно 4,0 мМ. В дополнительном варианте осуществления среда содержит общую концентрацию цистеина приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, такую как приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, или приблизительно 0,4 мМ. В еще одном варианте осуществления среда содержит общую концентрацию серина приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 75,0 мМ, такую как приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, или приблизительно 7,5 мМ. В другом варианте осуществления среда содержит общую концентрацию глутамина приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, такую как приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно 20,0 мМ, или приблизительно 4,0 мМ. В дополнительном варианте осуществления среда содержит общую концентрацию тирозина приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, такую как приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, или приблизительно от 2,9 мМ и приблизительно до 3,0 мМ. В еще одном варианте осуществления среда содержит общую концентрацию аспарагина приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, такую как приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, или приблизительно 20,0 мМ. В конкретном варианте осуществления среда не содержит аспарагин.

В одном из вариантов осуществления среда дополнительно содержит калиевую соль, такую как хлорид калия или сульфат калия. В варианте осуществления, общая концентрация калиевой соли составляет приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 25 г/л, такая как приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, или приблизительно 0,9 г/л.

В одном из вариантов осуществления среда дополнительно содержит источник углерода, такой как глюкоза, декстроза, маннит, лактоза, сахароза, фруктоза, галактоза, рафиноза, ксилоза, или манноза. В конкретном варианте осуществления источник углерода представляет собой глюкозу. В варианте осуществления, общая концентрация источника углерода может составлять приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 100 г/л, такая как приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л, или приблизительно 50 г/л.

В одном из вариантов осуществления среда дополнительно содержит бикарбонат натрия. В варианте осуществления, концентрация бикарбоната натрия может составлять приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 20 г/л, такая как приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, или приблизительно 0,84 г/л.

В одном из вариантов осуществления среда дополнительно содержит экстракт дрожжей, такой как дрожжевой аутолизат, ультрафильтрованный экстракт дрожжей или синтетический экстракт дрожжей. В конкретном варианте осуществления экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей, такой как AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.), BD DIFCO (BD Biosciences), HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.), или ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.). В дополнительном варианте осуществления концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно от 1 г/л до приблизительно 50 г/л, такая как приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л, или приблизительно 10 г/л.

В конкретном варианте осуществления среда содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ аминокислот, калиевую соль, источник углерода, и необязательно, экстракт дрожжей.

В другом варианте осуществления среда содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ аминокислот, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ глицина, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л калиевой соли, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 100 г/л источника углерода, и приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л экстракта дрожжей.

В дополнительном варианте осуществления среда содержит, по меньшей мере, приблизительно 60 мМ аминокислот, приблизительно 7,5 мМ глицина, приблизительно 0,9 г/л хлорида калия, 50 г/л глюкозы, и приблизительно 10 г/л ультрафильтрованного экстракта дрожжей.

Дополнительный аспект изобретения относится к способу культивирования бактерий, производящих полисахариды, включающему a) добавление среды по изобретению в биореактор, b) засевание среды бактериями, производящими полисахариды, и c) культивирование бактерий путем ферментирования, где указанное культивирование включает добавление питательного вещества в среду с постоянной скоростью. В одном из вариантов осуществления питательное вещество представляет собой источник углерода, такой как глюкоза. В одном из вариантов осуществления культивирование проводят до тех пор, пока бактерии не будут иметь плотность клеток, при измерении оптической плотности (OD) при 600 нм, по меньшей мере, 9,0. В другом варианте осуществления культивируемые бактерии имеют плотность клеток, определенную путем OD при 600 нм, по меньшей мере, 9,0. В другом варианте осуществления культивирование проводят до тех пор, пока бактерии не будут иметь концентрацию полисахарида, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л. В другом варианте осуществления культивируемые бактерии имеют концентрацию полисахарида, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л. В дополнительном варианте осуществления бактерии, производящие полисахариды, выбраны из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, и Enterococcus faecalis.

Еще один аспект изобретения относится к способу культивирования бактерий, производящих полисахариды, включающему a) добавление среды, как описано выше, в биореактор, b) засевание среды бактериями, производящими полисахариды, и c) культивирование бактерий путем перфузии, где культивирование содержит (i) удаление использованной среды из культуры, (ii) добавление свежей среды, и (iii) сохранение бактерий. В одном из вариантов осуществления скорость перфузии составляет приблизительно от 0,07 объема подачи на начальный объем культуры на час (VVH) до приблизительно 2,00 VVH, такая как приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 1,33 VVH, или приблизительно 1,20 VVH. В другом варианте осуществления скорость перфузии варьирует. Например, в одном из вариантов осуществления перфузия начинается с первой скоростью, и скорость повышается до второй скорости. В другом варианте осуществления перфузия начинается с первой скоростью, и скорость снижается до второй скорости.

В одном из вариантов осуществления длительность перфузии составляет приблизительно от 1 часа и приблизительно до 15 часов, такая как приблизительно от 1 часа и приблизительно до 10 часов, или приблизительно 7 часов.

В другом варианте осуществления рост клеток культивированных бактерий, по меньшей мере, в два раза больше, чем рост клеток в системе периодической ферментации. В одном из вариантов осуществления культивирование проводят до тех пор, пока бактерии не достигнут плотности клеток, при измерении оптической плотности (OD) при 600 нм, по меньшей мере, 20,0. В дополнительном варианте осуществления культивируемые бактерии имеют плотность клеток, определенную путем OD при 600 нм, по меньшей мере, 20,0. В еще одном варианте осуществления культивирование проводят до тех пор, пока бактерии не достигнут концентрации полисахарида, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л. В еще одном варианте осуществления культивируемые бактерии имеют концентрацию полисахарида, по меньшей мере, приблизительно от 600 мг/л.

В дополнительном варианте осуществления бактерии, производящие полисахариды, выбраны из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, и Enterococcus faecalis.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к средам и способам для производства полисахаридов бактериальной клеточной культурой. В частности, изобретение относится к системам, которые максимально увеличивают выработку капсулярного полисахарида инкапсулированных бактерий.

Перед тем как будут описаны настоящая композиция и способы, следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения

Хотя в практическом осуществлении или тестировании по изобретению можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные, описываемым в настоящем документе, сейчас описаны предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в настоящем документе, в полном объеме включены в качестве ссылки.

Термины, применяемые в настоящем документе, имеют значение, в котором их знают и понимают специалисты в данной области, однако, для удобства и полноты, конкретные термины и их значения изложены ниже и на всем протяжении описания.

Как применяют в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на "способ" включает один или несколько способов, и/или этапов типа, описываемого в настоящем документе, и/или который будет понятен специалистам в данной области при чтении данного описания и т.д.

Термин "приблизительно" или "приблизительный" означает в статистически значимом диапазоне значения. Такой диапазон может быть в пределах порядка величины, как правило, в пределах 20%, еще более типично в пределах 10%, и еще более типично в пределах 5% от данной величины или диапазона. Допустимое изменение, охватываемое термином "приблизительно" или "приблизительный" зависит от конкретной исследуемой системы, и может быть легко оценено специалистом в данной области. Всякий раз, когда в этой заявке указывается диапазон, каждое целое число в пределах диапазона также рассматривается как вариант осуществления изобретения.

Как применяют в настоящем документе, термин «периодическая культура» относится к способу культивирования клеток, при котором все компоненты, которые в конечном итоге будут использоваться при культивировании клеток, в том числе среда, а также клетки сами по себе, предоставляются в начале процесса культивирования. Периодическую культуру, как правило, останавливают в какой-то точке, и клетки и/или компоненты в среде собирают и необязательно очищают.

Как применяют в настоящем документе, термин «биореактор» относится к любому сосуду, используемому для роста бактериальной клеточной культуры. Биореактор может быть любого размера при условии, что он подходит для культивирования бактериальных клеток. Как правило, биореактор будет, по меньшей мере, размером 1 литр и может быть 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров или больше, или любого промежуточного объема. Внутренние условия биореактора, включая в качестве неограничивающих примеров, pH и температуру, как правило, контролируют во время периода культивирования. Биореактор может состоять из любого материала, который подходит для хранения бактериальных клеточных культур, суспендированных в среде при условиях культивирования по настоящему изобретению, включая стекло, пластик или металл. Как применяют в настоящем документе, термин «производственный биореактор» относится к окончательному биореактору, применяемому для производства полисахарида, представляющего интерес. Объем производственного крупномасштабного биореактора для клеточной культуры составляет, как правило, по меньшей мере, 500 литров и может быть 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 литров и больше, или любого промежуточного объема. Специалист в данной области имеет представление и способен выбрать подходящие биореакторы для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения.

Термин «капсулярный полисахарид» или "капсульный полисахарид" относится к гликополимеру, который включает повторяющиеся единицы из одного или нескольких моносахаридов, соединенных гликозидными связями. Капсулярный полисахарид, как правило, образует капсулоподобный слой вокруг бактериальной клетки.

Как применяют в настоящем документе, термин «плотность клеток» относится к числу клеток, присутствующих в данном объеме среды.

Как применяют в настоящем документе, термин «жизнеспособность клеток» относится к способности клеток выживать в культуре при данном наборе условий культивирования или экспериментальных вариациях. Термин, как применяют в настоящем документе, также относится к той части клеток, которая является живой конкретное время по отношению к общему числу клеток, живых и мертвых, в культуре в это время.

Термины, такие как "содержит", "содержащий", "включенный", "включает", "состоящий" и т.п. могут иметь значение, которое приписывается им в патентном законе США; например, они могут означать "включает", "включенный", "включающий" и т.п. Такие термины относятся к включению конкретных ингредиентов или набора ингредиентов, без исключения любых других ингредиентов.

Термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, предписанное им патентном законе США; а именно, что эти термины являются закрытыми. Таким образом, эти термины относятся к включению конкретных ингредиентов или набора ингредиентов и исключению всех остальных ингредиентов.

Термины, такие как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, приписываемое им в патентном законе США, например, они допускают включение дополнительных ингредиентов или этапов, которые не преуменьшают новых или основных характеристик по изобретению, т.е. они исключают дополнительные неперечисленные ингредиенты или этапы, которые преуменьшают новые или основные характеристики по изобретению, и они исключают ингредиенты или этапы известного уровня техники, такие как документы в данной области, которые цитируются в настоящем документе или включены посредством ссылки в настоящем документе, тем более что целью данного документа является определение вариантов осуществления, которые являются патентоспособными, например, новыми, неочевидными, изобретательскими, превосходящими известный уровень техники, например, превосходящими документы, цитируемые в настоящем документе или включенные посредством ссылки в настоящем документе.

Термины «культура», «клеточная культура» и «бактериальная клеточная культура», как применяют в настоящем документе, относятся к популяции бактериальных клеток, которую суспендируют в среде в условиях, подходящих для выживания и/или роста клеточной популяции. Как будет очевидно специалистам в данной области, эти термины, как применяют в настоящем документе, могут относиться к комбинации, включающей популяцию бактериальных клеток и среду, в которой популяцию суспендируют.

Как применяют в настоящем документе, термин "дисахарид" относится к полисахариду, состоящему из двух моносахаридных единиц или групп, связанных вместе гликозидной связью.

Как применяют в настоящем документе термин «периодическая культура с подпиткой» относится к способу культивирования клеток, при котором дополнительные компоненты предоставляются культуре через некоторое время после начала процесса культивирования. Предоставляемые компоненты, как правило, содержат питательные добавки для клеток, которые были исчерпаны во время процесса культивирования. Периодическую культуру с подпиткой, как правило, останавливают в какой-то точке, и клетки и/или компоненты в среде собирают и необязательно очищают.

Эти термины «среда», «среда для культивирования клеток», «среда для культивирования бактерий», и «среда для культивирования», как применяют в настоящем документе, относятся к раствору, содержащему питательные вещества, которые питают растущие бактериальные клетки. Как правило, эти растворы обеспечивают заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды, и микроэлементы, необходимые клетке для минимального роста и/или выживания. Раствор может также содержать компоненты, которые повышают рост и/или выживаемость выше минимальной скорости, в том числе гормоны и факторы роста. Раствор предпочтительно составляют с pH и концентрацией солей, оптимальными для выживания и пролиферации клеток. Среда может также быть «средой определенного состава» - бессывороточной средой, которая не содержит белков, гидролизатов или компонентов с неизвестной композицией. Среды определенного состава свободны от компонентов животного происхождения, и все компоненты имеют известную химическую структуру.

Как применяют в настоящем документе, термин «продукт обмена веществ» относится к соединениям, производимым клеточной культурой в результате нормальных или нарушенных метаболических процессов, которые в какой-то мере наносят ущерб клеточной культуре, особенно в отношении продукции капсулярного полисахарида. Например, продукт обмена веществ могут вредить росту или жизнеспособности клеточной культуры или могут снижать количество производимого капсулярного полисахарида. Примеры продуктов обмена веществ включают лактат, который производится в результате метаболизма глюкозы, и аммоний, который производится в результате метаболизма глутамина. Одной из целей по настоящему изобретению является замедление продукции, уменьшение или даже удаление продуктов обмена веществ в бактериальных клеточных культурах.

«Моносахарид», как применяют в настоящем документе, относится к одному остатку сахара в олигосахариде.

«Олигосахарид», как применяют в настоящем документе, относится к соединению, содержащему две или более моносахаридных единицы или группы. В контексте олигосахарида, отдельная мономерная единица или компонент является моносахаридом, который связан или может быть связан через гидроксильную группу с другой моносахаридной единицей или группой. Олигосахариды можно получать или путем химического синтеза из защищенного отдельного остатка сахара или путем химической деградации биологически произведенных полисахаридов. Альтернативно, олигосахариды можно получать ферментативными способами in vitro.

Как применяют в настоящем документе, термин «перфузионная культура» относится к способу культивирования клеткок, при котором дополнительные компоненты предоставляются в культуру непрерывно или на полунепрерывной основе после начала процесса культивирования. Предоставляемые компоненты, как правило, содержат питательные добавки для клеток, которые были исчерпаны во время процесса культивирования. Часть клеток и/или компоненты в среде, такие как продукты обмена веществ, как правило, собирают на непрерывной или полунепрерывной основе и необязательно очищают.

Термин «полисахарид» (PS) относится к линейному или разветвленному полимеру, по меньшей мере, из 5 моносахаридных единиц или групп. Для ясности, большое число повторяющихся единиц, где n больше чем приблизительно 5, такое как, больше чем приблизительно 10, будет относится в настоящем документе к полисахариду.

Как применяют в настоящем документе, термин "сахарид" относится к группе отдельного сахара или моносахаридной единице, а также к комбинациям двух или более групп отдельных сахаров или моносахаридных единиц, ковалентно связанным для образования дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов. Термин "сахарид" можно использовать взаимозаменяемо с термином «углевод».

Как применяют в настоящем документе термин «засеивание» относится к процессу обеспечения клеточной культуры в биореактор или другой сосуд. Клетки могут быть выращены ранее в другом биореакторе или сосуде. Альтернативно, клетки могут быть заморожены и разморожены непосредственно перед помещением их в биореактор или сосуд. Термин относится к любому числу клеток, в том числе к одной клетке.

Как применяют в настоящем документе, термин «титр» относится к общему количеству полисахарида, произведенного бактериальной клеточной культурой, деленному на данную величину объема среды. Титр, как правило, выражают в миллиграммах полисахарида на литр среды.

Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые используют взаимозаменяемо, относятся к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, одну иммуногенную композицию, которая индуцирует иммунный ответ у животного.

Бактерии

Любые бактерии с клеточной полисахаридной стенкой можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительном варианте осуществления бактерии представляют собой инкапсулированные бактерии. Неограничивающие примеры инкапсулированных бактерий, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением включают виды Streptococcus, такие как S. agalactiae и S. pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, и Enterococcus faecalis. В более предпочтительном варианте осуществления бактерии имеют сложные питательные требования к росту. Разборчивые бактерии в качестве неограничивающих примеров включают, виды Streptococcus (например, S. agalactiae и S. pneumoniae).

Существует десять различных серотипов S. agalactiae, также известных как стрептококки группы В (GBS), каждый из которых можно использовать в настоящем изобретении. Эти серотипы включают Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, и IX. Все капсулярные полисахариды GBS имеют разветвленную повторяющуюся структуру с концевой α2-3-связанной сиаловой кислотой, которая необходима для бактериальной вирулентности. Некоторые примеры штаммов GBS, предназначенные для использования в настоящем изобретении, в качестве неограничивающих примеров включают, 090, A909 (Номер доступа ATCC BAA-1138), 515 (Номер доступа ATCC BAA-1177), B523, CJB524, MB 4052 (Номер доступа ATCC 31574), H36B (Номер доступа ATCC 12401), S40, S42, MB 4053 (Номер доступа ATCC 31575), M7091337357, PFEGBST0267, MB 4055 (Номер доступа ATCC 31576), 18RS21 (Номер доступа ATCC BAA-1175), S16, S20, V8 (Номер доступа ATCC 12973), DK21, DK23, UAB, 5401, PFEGBST0708, MB 4082 (Номер доступа ATCC 31577), M132, 110, M781 (Номер доступа ATCC BAA-22), D136C(3) (Номер доступа ATCC 12403), M782, S23, 120, MB 4316 (M-732; Номер доступа ATCC 31475), M132, K79, COH1 (Номер доступа ATCC BAA-1176), PFEGBST0563, 3139 (Номер доступа ATCC 49446), CZ-NI-016, PFEGBST0961, 1169-NT1, CJB111(Номер доступа ATCC BAA-23), CJB112, 2603 V/R (Номер доступа ATCC BAA-611), NCTC 10/81, CJ11, PFEGBST0837, 118754, 114852, 114862, 114866, 118775, B 4589, B 4645, SS1214, CZ-PW-119, 7271, CZ-PW-045, JM9130013, JM9130672, IT-NI-016, IT-PW-62, и IT-PW-64.

Существует более чем 90 различных серотипов S. pneumoniae, любой из которых предназначен для использования в настоящем изобретении. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7A, 7C, 7F, 8, 9N, 9 л, 9V, 10A, 10B, 11A, 11F, 12A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 17A, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F 35, 38, 39, 40, и 42. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать серотипы S. pneumoniae 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F или 33F. В другом варианте осуществления настоящего изобретения можно использовать серотипы S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F и 23F.

Аналогично, в настоящем изобретении можно использовать любой инкапсулированный штамм S. aureus. Предпочтительно, предполагаются штаммы S. aureus strains, производящие капсулярные полисахариды серотипа 5 или 8, такие как Reynolds, Becker, Newman, PS80, JL278, и JL812.

Любой штамм N. meningitidis серогрупп A, C, Y, и W-135 можно использовать в настоящем изобретении.

Любой штамм E. coli можно использовать в настоящем изобретении.

Любой штамм S. typhi Vi можно использовать в настоящем изобретении.

Любой штамм H. influenza типа b можно использовать в настоящем изобретении.

Любой штамм K. pneumoniae можно использовать в настоящем изобретении.

E. faecalis можно использовать в настоящем изобретении.

Примеры штаммов E. Faecium, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают штаммы, перечисленные в таблице 1.

Таблица 1. Штаммы *E. faecium*
Штаммы	Штамм
E1162 (номер доступа Genome GenBank ABQJ00000000)	U0317 (номер доступа Genome GenBank ABSW00000000)
E0510	E1728
E1760	E1731
E1679 (номер доступа Genome GenBank ABSC00000000)	E1794 (штамм DO; штамм TX0016) (номер доступа Genome GenBank ACIY00000000)
E1644	E1360
E1716	E1674
E1717	E1675
E1441	E1643
E1435	E1850
E0734	E0005
E1652	E0321
E0745	E0322
E0470	E0027
E1340	E1149
E0013	E1147
E0300	E0802
E0155	E0849
E0161	E1316
E1132	E1554
E1263	E1133
E1250	E1764
E1283	E1766
E1284	E1485
E1734	E1590
E1467	E0060
E1500	E0128
E1737	E0135
E1463	E1002
E1499	E1039 (номер доступа Genome GenBank ACOS00000000)
E1735	E0980 (номер доступа Genome GenBank ABQA00000000)
E0380	E1071 (номер доступа Genome GenBank ABQI00000000)
E1391	E1759
E1403	E1628
E1421	E1630
E1423	E1573
E0333	E0172
E1292	E0211
E1620	E0466
E1621	E1574
E1623	E0463
E1625	E1607
E1636 (номер доступа Genome GenBank ABRY00000000)	E1619
E0073	E1576
E0125	E1781
E0772	E0685
E1172	E0144
E1302	E0045
E1307	E0429
E1308	E1622
E1721

Дополнительно, любое число бактерий, доступных коммерческим и не коммерческим образом, с полисахаридами клеточной стенки могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Специалисту в данной области будет очевидно, что некоторые бактерии имеют различные пищевые требования и/или могут требовать различных условий культивирования для оптимального роста, и он будет способен изменять условия по мере необходимости.

Во многих случаях будут выбраны или сконструированы штаммы бактерий для получения высоких уровней полисахарида. В некоторых вариантах осуществления бактериальные клетки является генетически сконструированными для выработки высоких уровней полисахарида.

Среды для культивирования клеток

Настоящее изобретение относится к ряду составов сред, которые максимально повышают продукцию полисахарида в бактериальных клеточных культурах.

Сложные среды

Бактериальные клеточные культуры, в частности, бактерии со сложными питательными потребностями и/или бактерии, часто растут на сложных средах, таких как колумбийский бульон, бульон Лурия-Бертани (LB), бульон Тодда-Гевитта, среда с мясным бульоном, кровяной бульон или бульон с сердечно-мозговым экстрактом. Таким образом, сложные среды были разработаны для максимизации бактериального роста и выработки полисахаридов. В одном из аспектов, изобретение относится к сложной среде для культивирования, содержащей растительный гидролизат, экстракт дрожжей и источник углерода.

Подходящие растительные гидролизаты в качестве неограничивающих примеров включают, HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.), HYPEP 4601 (Kerry Group Services Ltd.), HYPEP 5603 (Kerry Group Services Ltd.), HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.), AMI-SOY (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY (Quest), N-Z-SOY BL4 (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY BL7 (Quest), SHEFTONE D (Kerry Group Services Ltd.), SE50M, SE50MK, соевый пептон, сойтон BACTO (Difco Laboratories Inc.), NUTRISOY 2207 (ADM), NUTRISOY (ADM), NUTRISOY flour (ADM), и жмых сосевых бобов. В предпочтительном варианте осуществления растительный гидролизат представляет собой соевый гидролизат. Предпочтительно, соевый гидролизат представляет собой HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.).

Концентрации растительного гидролизата в среде для культивирования могут находиться в диапазоне приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 75 г/л, такие как приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 65 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 55 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 45 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 35 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 70 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 60 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 75 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 65 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 55 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 45 г/л, приблизительно от 20 г/л и приблизительно до 70 г/л, приблизительно от 20 г/л и приблизительно до 60 г/л, или приблизительно от 20 г/л и приблизительно до 50 г/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация растительного гидролизата в среде для культивирования составляет приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 50 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 28 г/л.

Экстракты дрожжей, подходящие для использования в настоящем изобретении могут включать дрожжевой аутолизат, ультрафильтрованный экстракт дрожжей или синтетический экстракт дрожжей. В одном из аспектов, экстракт дрожжей представляет собой BD BBL (BD Biosciences), BD BACTO (BD Biosciences), HY YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.), HY YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.), или HY YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.). В другом аспекте экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей, такой как AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.), BD DIFCO (BD Biosciences), HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), или ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.). В дополнительном аспекте, экстракт дрожжей представляет собой синтетический экстракт дрожжей, такой как BD RECHARGE (BD Biosciences). Наиболее предпочтительно, экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей, такой как AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp).

Концентрации экстракта дрожжей в среде для культивирования могут находиться в диапазоне приблизительно от 1 г/л до приблизительно 50 г/л, так как приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 25 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 10 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 25 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 35 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 25 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 30 г/л, или приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 25 г/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация экстракта дрожжей в среде для культивирования составляет приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 10 г/л.

Любой источник углерода можно использовать в среде для культивирования по настоящему изобретению. Подходящие источники углерода включают глюкозу, декстрозу, маннит, лактозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, рафинозу, ксилозу и/или маннозу. Предпочтительно, источник углерода в среде для культивирования представляет собой глюкозу.

Концентрации источника углерода в среде для культивирования могут находиться в диапазоне приблизительно от 25 г/л до приблизительно 100 г/л, такие как приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 90 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 70 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 60 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 100 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 90 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 80 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 70 г/л, приблизительно от 60 г/л и приблизительно до 100 г/л, приблизительно от 60 г/л и приблизительно до 90 г/л, приблизительно от 60 г/л и приблизительно до 80 г/л, приблизительно от 70 г/л и приблизительно до 100 г/л, или приблизительно от 70 г/л и приблизительно до 90 г/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация источника углерода в среде для культивирования составляет приблизительно от 50 г/л до приблизительно 90 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 80 г/л.

Таким образом, авторы изобретения открыли, что комбинация растительного гидролизата, экстракта дрожжей и источника углерода помогает поддерживать максимальные рост бактерий и выработку полисахарида. В одном из аспектов, изобретение относится к среде для культивирования, включающей растительный гидролизат, экстракт дрожжей и источник углерода. Растительный гидролизат может быть любым подходящим растительным гидролизатом, известным в данной области, таким как вышеописанные. Предпочтительно, гидролизат является соевым гидролизатом. Более предпочтительно, соевый гидролизат является HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.). Можно использовать любой экстракт дрожжей, известный в данной области, такой как вышеописанные. В предпочтительном варианте осуществления экстракт дрожжей представляет собой AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.).

В одном из аспектов, сложная среда для культивирования по настоящему изобретению может включать фосфат-содержащие ингредиенты, такие как Na₂HPO₄, K₂HPO_4,или KH₂PO₄.

В другом аспекте среды для культивирования могут включать другие различные факторы, известные в данной области для повышения роста, такие как аминокислоты, витамины, нуклеозиды и неорганические соли.

В еще одном аспекте культивирование проводят с использованием любого из способов, описываемых в настоящем документе, до тех пор пока плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, бактериальной клеточной культуры с использованием сложной среды по изобретению составляет, по меньшей мере, 15,0, такая как, по меньшей мере, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 или 30,0. В предпочтительном варианте осуществления культивирование проводят до тех пор, пока плотность клеток не будет составлять, по меньшей мере, 15,0. В еще одном аспекте плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, бактериальной клеточной культуры с использованием сложной среды по изобретению может быть, по меньшей мере, 15,0, такой как, по меньшей мере, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 или 30,0. В предпочтительном варианте осуществления плотность клеток составляет, по меньшей мере, 15,0.

Выход полисахарида у GBS можно определять, измеряя концентрацию сиаловой кислоты. Сиаловая кислота высвобождается из полисахарида, связанного с клетками, путем расщепления осадка клеток способами, хорошо известными в данной области. Расщепление можно оценивать путем анионообменной хроматографии (AEX) посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию полисахарида затем определяют, умножая величину сиаловой кислоты на коэффициент веса повторяющейся единицы. Например, коэффициент для каждого серотипа GBS является следующим: Ia, Ib, и II=3,24; II и V=4,29; и IV=3,77. Количественную оценку полисахарида для S. pneumoniae или других инкапсулированных бактерий проводят сначала высвобождая капсулярный полисахарид из клеточной стенки путем обработки детергентом, таким как натрий дезоксихолевая кислота (DOC) или N-лаурил-саркозин натрия (NLS); кислотной обработки при высокой температуре; обработки основанием и/или механическим лизисом. Высвобожденный полисахарид в неочищенном лизате затем оценивают против аутентичного стандарта с использованием гель-фильтрации ВЭЖХ.

В одном из аспектов, культивирование проводят с использованием любого из способов, описываемых в настоящем документе, до тех пор пока концентрация полисахарида, определенная по концентрации сиаловой кислоты, в бактериальной клеточной культуре с использованием сложной среды по изобретению составляет приблизительно 200 мг/л, такая как, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л; 300 мг/л; 350 мг/л; 400 мг/л, 450 мг/л; 500 мг/л; 550 мг/л; 600 мг/л; 650 мг/л; или 700 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления культивирование проводят до тех пор пока концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л. В одном из аспектов, концентрация полисахарида, определенная по концентрации сиаловой кислоты, в бактериальной клеточной культуре с использованием сложной среды по изобретению может быть, по меньшей мере, приблизительно 200 мг/л, такой как, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л; 300 мг/л; 350 мг/л; 400 мг/л, 450 мг/л; 500 мг/л; 550 мг/л; 600 мг/л; 650 мг/л; или 700 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л.

Среды определенного состава

Ввиду потенциальной несогласованности сложных сред, однако, были исследованы химические среды определенного состава для максимизации бактериального роста и производства полисахарида. Неожиданно было обнаружено, что разработанная заявителем среда для культивирования клеток млекопитающих, раскрытая в патенте США № 7294484, которая полностью включена в настоящий документ в качестве ссылки, обеспечивала как неожиданно высокий рост клеток, так и производство полисахарида. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что среда определенного состава, имеющего общую концентрацию аминокислот больше чем приблизительно 50 мМ, обеспечивала как неожиданно высокий рост клеток, так и производство полисахарида. Примерная среда для культивирования клеток млекопитающих показана в таблице 2 ниже. Традиционные составы сред начинаются с относительно низкого общего уровня аминокислот по сравнению с составами сред по настоящему изобретению. Например, традиционная среда для культивирования клеток, известная как DME-F12 (смесь 50:50 модифицированной Дульбекко среды Игла и среды Ham F12), имеет общее содержание аминокислот 7,29 мМ и традиционная среда для культивирования клеток, известная как RPMI-1640 имеет общее содержание аминокислот 6,44 мМ (см., например, HJ Morton, In Vitro, 6: 89-108 (1970), RG Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. (USA), 53: 288 -293 (1965), GE Moore и др., J. Am. Medical Assn., 199: 519-24 (1967), все включены в настоящий документ в качестве ссылки).

Таблица 2. Пример среды для культивирования клеток млекопитающих
Аминокислоты	мг/л	мМ	Микроэлементы	мкг/л	нМ
аланин	17,80	0,20	Селенит натрия	69,16	400,00
аргинин	696,00	4,00	Fe(NO₃)₃⋅9H₂O	50,00	123,76
аспарагин⋅H₂O	3000,00	20,00	CuSO₄	10,24	64,00
аспарагиновая кислота	219,45	1,65	CuSO₄⋅5H₂O	99,88	400,00
цистеин⋅HCl⋅H₂O	70,40	0,40	FeSO₄⋅7H₂O	4170	15000
цистеин⋅2HCl	468,75	1,50	ZnSO₄⋅7H₂O	2640	9200
мононатриевый глутаминат	33,80	0,20	MnSO₄⋅H₂O	33,80	200,00
глутамин	584,00	4,00	Na₂SiO₃⋅9H₂O	284,07	1000
глицин	115,50	1,54	(NH₄)₆Mo₇O₂₄⋅4H₂O	247,20	200,00
гистидин⋅HCl⋅H₂O	474,60	2,26	NH₄VO₃	2,34	20,00
изолейцин	70,73	4,36	NiSO₄⋅6H₂O	5,26	20,00
лейцин	1030,70	7,87	SnCl₂⋅2H₂O	0,90	4,00
лизин⋅HCl	1401,40	7,70	AlCl₃⋅6H₂O	0,97	4,00
метионин	387,40	2,60	KBr	0,48	4,00
фенилаланин	507,00	3,07	CrCl₃	15,83	100,00
пролин	539,50	4,69	NaF	0,17	4,00
серин	1052,00	10,02	GeO₂	0,42	4,00
треонин	564,80	4,75	KI	33,20	200,00
триптофан	274,16	1,34	RbCl	0,48	4,00
тирозин⋅2Na⋅2H₂O	745,75	2,86	H₃BO₃	12,37	200,00
валин	749,00	6,40	LiCl	0,17	4,00

Витамины	мг/л	мМ	Другие компоненты	мкг/л	нМ
биотин	2,68	0,01	Гидрокортизон	540,00	1,49
Пантотенат кальция	21,92	0,05	Путресцин⋅2HCl	15000	93,11
Хлорид холина	158,46	1,14	линолевая кислота	290,00	1,04
фолиевая кислота	25,93	0,06	тиоктацид	716,00	3,48
инозитол	163,98	0,91
никотинамид	26,23	0,22	Другие компоненты	мг/л	мМ
пиридоксаль⋅HCl	2,03	0,01	D-глюкоза (Декстроза)	15000,00	83,33
пиридоксин⋅HCl	36,13	0,18	ПВС	2560,00
рибофлавин	2,41	0,01	Нуцеллин™	50,00
тиамин⋅HCl	39,43	0,12	Пируват натрия	55,00	0,50
витамин B12	21,17	0,02

Неорганические соли	мг/л	мМ
CaCl₂	116,55	1,05
KCl	312,90	4,19
Na₂HPO₄	56,60	0,40
NaCl	1100,00	18,80
NaH₂PO₄⋅H₂O	645,84	4,68
MgSO₄	138,00	1,15
MgCl₂	28,50	0,30
NaHCO₃	2000,00	23,81

Таким образом, настоящее изобретение относится к средам для культивирования клеток с общей концентрацией аминокислот, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ, такой как, по меньшей мере, приблизительно 55 мМ, по меньшей мере, 60 мМ, по меньшей мере, 70 мМ, и, по меньшей мере, 75 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация аминокислот составляет, по меньшей мере, 60 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация глицина в бактериальных средах для культивирования клеток может находиться в диапазоне приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 60,0 мМ, таком как приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 7,5 мМ, приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 60,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 7,5 мМ, приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 60,0 мМ, приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, или приблизительно от 7,5 мМ и приблизительно до 10,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация глицина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 7,5 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация аргинина в бактериальных средах для культивирования клеток может находиться в диапазоне приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, таком как приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 7,5 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 7,5 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, или приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация аргинина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 4,0 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация цистеина в бактериальных средах для культивирования клеток может быть приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, такая как приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 4,5 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 4,0 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,0 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 2,5 мМ, приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 4,5 мМ, приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 4,0 мМ, приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 3,0 мМ, приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 2,5 мМ, или приблизительно от 0,4 мМ и приблизительно до 2,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация цистеина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 0,4 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация серина в бактериальных средах для культивирования клеток может быть приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 75,0 мМ, такая как приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 75,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 75,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, или приблизительно до от 20,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация серина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 7,5 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация глутамина в бактериальных средах для культивирования клеток может находиться в диапазоне приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, таком как приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 7,5 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 4,0 мМ и приблизительно до 7,5 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, или приблизительно до от 15,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация глутамина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 4,0 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация тирозина в бактериальных средах для культивирования клеток может находиться в диапазоне приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, так как приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 4,5 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 4,0 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,0 мМ, приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 2,5 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 5,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 4,5 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 4,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 3,0 мМ, приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 2,5 мМ, или приблизительно до от 1,0 мМ и приблизительно до 2,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация тирозина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 3,5 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 2,9 мМ или приблизительно до 3,0 мМ.

В одном из аспектов изобретения, общая концентрация аспарагина в бактериальных средах для культивирования клеток может быть приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, такой как приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 10,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 40,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, приблизительно от 15,0 мМ и приблизительно до 25,0 мМ, или приблизительно до от 15,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация аспарагина в бактериальных средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 20,0 мМ.

В другом аспекте по изобретению, среды для культивирования клеток не содержат аспарагин.

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что калий является благоприятной солью для продукции полисахаридов, которая не зависит от роста. Таким образом, в одном из аспектов изобретения, среды для культивирования клеток содержат калиевую соль, такую как хлорид калия или сульфат калия.

В одном из вариантов осуществления концентрация калиевой соли в средах для культивирования клеток может быть приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 25 г/л, такой как приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 10 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 5 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 1,5 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,9 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,8 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,7 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,6 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,5 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,5 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 0,9 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 0,8 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 0,7 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 0,6 г/л, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 0,5 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 1,5 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 0,9 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 0,8 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 0,7 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 0,6 г/л, приблизительно от 0,3 г/л и приблизительно до 0,5 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 1,5 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, или приблизительно до от 0,5 г/л и приблизительно до 1,0 г/л. В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация калиевой соли в средах для культивирования клеток составляет приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 0,9 г/л.

В одном из аспектов изобретения, среды для культивирования клеток по настоящему изобретению содержат источник углерода. Подходящие источники углерода включают глюкозу, декстрозу, маннит, лактозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, рафинозу, ксилозу и/или маннозу. В предпочтительном варианте осуществления источник углерода является глюкозой.

Общая концентрация источника углерода в бактериальных средах для культивирования клеток может находиться в диапазоне приблизительно от 25 г/л до приблизительно 100 г/л, таком как приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 90 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 70 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 60 г/л, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 100 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 90 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 80 г/л, приблизительно от 50 г/л и приблизительно до 70 г/л, приблизительно от 60 г/л и приблизительно до 100 г/л, приблизительно от 60 г/л и приблизительно до 90 г/л, приблизительно от 60 г/л и приблизительно до 80 г/л, приблизительно от 70 г/л и приблизительно до 100 г/л, или приблизительно до от 70 г/л и приблизительно до 90 г/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация источника углерода в среде для культивирования составляет приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 50 г/л.

В другом аспекте среды для культивирования клеток модифицированы для удовлетворения потребностей в бикарбонате натрия для бактерий, растущих анаэробно. Некоторые примеры бактерий, производящих полисахариды, которых выращивают анаэробно, включают S. agalactiae и S. pneumoniae. В одном из вариантов осуществления в среду добавляют приблизительно от 0,1 г/л до приблизительно 20 г/л бикарбоната натрия. Например, концентрация бикарбоната натрия может быть приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 10 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 5,0 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 3,0 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 2,0 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,9 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,8 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,7 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,6 г/л, приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 0,5 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 10 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 5,0 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 3,0 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 2,0 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 0,9 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 0,8 г/л, приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 0,7 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 10 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 5,0 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 3,0 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 2,0 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 1,25 г/л, приблизительно от 0,75 г/л и приблизительно до 1,0 г/л, или приблизительно до от 0,75 г/л и приблизительно до 0,9 г/л. Предпочтительно, концентрация бикарбоната натрия составляет приблизительно 0,84 г/л, или приблизительно от 1,8 г/л и приблизительно до 2,4 г/л.

В одном из аспектов изобретения, определенные бактериальные среды для культивирования клеток содержат экстракт дрожжей. Экстракты дрожжей, подходящие для использования в настоящем изобретении могут включать дрожжевой аутолизат, ультрафильтрованные экстракты дрожжей или синтетические экстракты дрожжей. В одном из аспектов, экстракт дрожжей представляет собой BD BBL (BD Biosciences), BD BACTO (BD Biosciences), HY YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.), HY YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.), или HY YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.). В другом аспекте экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей, такой как AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.), BD DIFCO (BD Biosciences), HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), или ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.). В дополнительном аспекте, экстракт дрожжей представляет собой синтетический экстракт дрожжей, такой как BD RECHARGE (BD Biosciences). Наиболее предпочтительно, экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей, такой как AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp).

Концентрации экстракта дрожжей в среде для культивирования могут составлять приблизительно от 1 г/л до приблизительно 50 г/л, такие как приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 25 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 1 г/л и приблизительно до 10 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 25 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 15 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 35 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 30 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 25 г/л, приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 20 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 50 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 40 г/л, приблизительно от 15 г/л и приблизительно до 30 г/л, или приблизительно до от 15 г/л и приблизительно до 25 г/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация экстракта дрожжей в среде для культивирования составляет приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л, наиболее предпочтительно приблизительно 10 г/л.

Один из аспектов изобретения относится к средам с определенным составом для культивирования клеток, содержащим, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ аминокислот, калиевую соль, источник углерода, и необязательно, экстракт дрожжей.

В одном из вариантов осуществления среда для культивирования клеток содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ аминокислот, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ глицина, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л калиевой соли, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л источника углерода, и приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л экстракта дрожжей.

В предпочтительном варианте осуществления среда для культивирования клеток содержит, по меньшей мере, приблизительно, 60 мМ аминокислот, приблизительно 7,5 мМ глицина, приблизительно 0,9 г/л хлорида калия, 50 г/л глюкозы, и приблизительно до 10 г/л ультрафильтрованного экстракта дрожжей.

Кроме того, специалисту в данной области будет ясно, что любое из вышеперечисленных условий можно использовать или по отдельности или в различных комбинациях с остальными условиями. При использовании состава среды с одной, несколькими или всеми вышеописанными характеристиками, специалист в данной области сможет оптимизировать рост и/или жизнеспособность клеток и максимизировать продукцию полисахарида.

Любые из этих составов сред, описанные в настоящем изобретении, могут быть необязательно дополнены по мере необходимости конкретными ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний, и фосфат), буферами, витаминами, микроэлементами (неорганическими соединениями, как правило, присутствующими в очень низких конечных концентрациях), аминокислотами, липидами, белковыми гидролизатами, или глюкозой или другими источниками энергии. Эти необязательные дополнительные компоненты можно добавлять в начале культивирования или можно добавлять позднее, для того чтобы восполнить потраченные питательные вещества или по другой причине. Специалисту в данной области известны любые желательные или необходимые дополнительные вещества, которые можно включать в описанные составы сред.

В другом аспекте культивирование проводят любым способом, описываемым в настоящем документе, до тех пор пока плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, в бактериальной клеточной культуре с использованием сред определенного состава по изобретению, не составит, по меньшей мере, 9,0, такая как, по меньшей мере, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, или 20,0. В предпочтительном варианте осуществления культивирование проводят любым способом, описываемым в настоящем документе, до тех пор пока плотность клеток не составит, по меньшей мере, 9,0.

В одном из аспектов, культивирование проводят с использованием любого из способов, описываемых в настоящем документе, до тех пор пока концентрация полисахарида, определенная по концентрации сиаловой кислоты, в бактериальной клеточной культуре с использованием среды определенного состава по изобретению не составит, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л, такая как, по меньшей мере, приблизительно 300 мг/л, 350 мг/л, 400 мг/л, 450 мг/л, 500 мг/л, 550 мг/л, 600 мг/л, 650 мг/л, 700 мг/л, 750 мг/л, 800 мг/л, 900 мг/л, 1000 мг/л, 1200 мг/л, 1500 мг/л или 2000 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления культивирование проводят с использованием любого из способов, описываемых в настоящем документе, до тех пор пока концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л. В одном из аспектов, концентрация полисахарида, определенная по концентрации сиаловой кислоты, в бактериальной клеточной культуре с использованием среды определенного состава по изобретению может быть, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л, такая как, по меньшей мере, приблизительно 300 мг/л, 350 мг/л, 400 мг/л, 450 мг/л, 500 мг/л, 550 мг/л, 600 мг/л, 650 мг/л, 700 мг/л, 750 мг/л, 800 мг/л, 900 мг/л, 1000 мг/л, 1200 мг/л, 1500 мг/л или 2000 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л.

Способы ферментации

Настоящее изобретение относится к способам ферментации для культивирования бактерий, производящих полисахариды. В одном из аспектов, способы культивирования по настоящему изобретению применяют в комбинации со сложными средами и средами определенного состава, описываемыми в настоящем документе, для максимальной продукции полисахарида.

Рост засева

В одном из вариантов осуществления рост бактерий, производящих полисахариды в способах по изобретению, проходит, по меньшей мере, две фазы: рост засева и ферментацию. Культуру для посева сначала выращивают путем засева исходной культурой, например, из рабочего банка клеток. Засев применяют или для засева второй культуры для посева или для засева относительно большой культуры для ферментации. Как очевидно в данной области, число используемых культур для посева может зависеть, например, от размера и объема этапа ферментации.

Таким образом, в одном из аспектов, изобретение относится к способу культивирования бактерий, производящих полисахариды. Способ включает культивирование полисахарид-продуцирующей бактериальной клетки в первой среде для культивирования в условиях, которые способствуют росту клетки; засев второй среды для культивирования всей или частью указанной первой среды после указанного первого культивирования; культивирование указанной засеянной второй среды в условиях, которые способствуют росту клеток и/или продукции полисахарида. Способ может дополнительно включать выделение полисахарида из указанной второй среды. В одном из вариантов осуществления бактерии, производящие полисахариды, выращивают в первой среде для культивирования, обозначаемой как культура для посева. В одном из вариантов осуществления культура для посева включает среду для культивирования, как описано выше, и засев из исходной культуры, который выращивали в среде. В одном из вариантов осуществления первая и вторая среды для культивирования являются одинаковыми. В другом варианте осуществления первая и вторая среды для культивирования являются разными.

Фазу роста засева (или фазы), как правило, проводят для увеличения количества микроорганизма из хранимой культуры, таким образом, чтобы его можно было использовать в качестве засева для фазы ферментации. Объем и количество жизнеспособных клеток, используемых для засева культуры для ферментации можно контролировать более точно, если их брать из активно растущей культуры (например, культуры для посева), чем из хранящейся культуры.

Кроме того, можно использовать более чем одну фазу роста засева (например, две или три) для увеличения количества бактерий, производящих полисахариды, для засева ферментационной среды. Альтернативно, рост бактерий, производящих полисахариды, в фазе ферментации можно производить при желании непосредственно из хранящейся культуры путем прямого засева.

Для начала фазы ферментации, часть или всю культуру для посева, содержащую бактерии, производящие полисахариды, можно использовать для засева ферментационной среды для культивирования. Специалисты в данной области могут определять подходящие концентрации культуры для посева, чтобы использовать для засева ферментационных сред.

Ферментацию можно использовать для получения максимального клеточного роста и/или продукции полисахаридов в крупномасштабном производстве. В одном из вариантов осуществления бактерии, производящие полисахариды, выращивают в виде культуры для ферментации. В одном из вариантов осуществления культуру для ферментации засеивают из культуры для посева, которую выращивали в первой среде, и культуру для ферментации выращивают на второй среде. В одном из вариантов осуществления вторая среда может быть сложной или средой определенного состава, как описано выше. В другом варианте осуществления первая среда и вторая среда являются одинаковыми.

Способ периодической ферментации с подпиткой

В одном из вариантов осуществления полисахарид-продуцирующую бактериальную клетку культивируют в культуральной системе с периодической подпиткой с использованием сложных сред и сред определенного состава, описанных выше. В системе с периодической подпиткой, культивирование начинается с засева клетками, дополненного, по меньшей мере, одним питательным веществом, добавляемым в процессе культивирования, и заканчивается однократным сбором клеток. В одном из вариантов осуществления питательное вещество добавляют с постоянной скоростью.

В одном из аспектов, источник углерода является питательным веществом, добавляемым в процессе культивирования. Источник углерода может быть любым источником углерода, описанным выше для сложных сред и/или сред определенного состава. В предпочтительном варианте осуществления источник углерода представляет собой глюкозу.

В одном из аспектов изобретения, количество загружаемого источника углерода/количество подаваемого источника углерода может быть приблизительно 10%/90%, 15%/85%, 20%/80%, 25%/75%, или 30%/70%. Например, в предпочтительном варианте осуществления 20% общей концентрации источника углерода загружается сразу и оставшиеся 80% поступают с постоянной скоростью в процессе культивирования. В другом варианте осуществления 20% общей концентрации источника углерода загружается сразу и оставшийся источник углерода может также поступать с непостоянной скоростью в процессе культивирования.

В еще одном аспекте способ периодической ферментации с добавлением субстрата проводят до тех пор пока плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, в бактериальной клеточной культуре составляет, по меньшей мере, 9,0, такая как, по меньшей мере, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, или 20,0. В предпочтительном варианте осуществления способ периодической ферментации с добавлением субстрата проводят до тех пор, пока плотность клеток составляет, по меньшей мере, 9,0.

В еще одном аспекте плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, в бактериальной клеточной культуре путем системы культивирования с периодической подпиткой может быть, по меньшей мере, 9,0, такой как, по меньшей мере, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, или 20,0. В предпочтительном варианте осуществления плотность клеток составляет, по меньшей мере, 9,0

Для полисахаридов, которые содержат сиаловую кислоту, таких как у GBS, выход полисахарида можно определять, измеряя концентрацию сиаловой кислоты. Сиаловая кислота высвобождается из полисахарида, связанного с клетками, путем расщепления осадка клеток способами, хорошо известными в данной области. Расщепление оценивают путем анионообменной хроматографии (AEX) посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию полисахарида затем определяют, умножая величину сиаловой кислоты на коэффициент веса повторяющейся единицы. Например, коэффициент для каждого серотипа для каждого серотипа GBS является следующим: Ia, Ib, и II=3,24; II и V=4,29; и IV=3,77. Выход полисахарида для S. или других инкапсулированных бактерий можно оценивать количественно сначала высвобождая капсулярный полисахарид из клеточной стенки путем обработки детергентом, таким как натрий дезоксихолевая кислота (DOC) или N-лаурил-саркозин натрия (NLS); кислотной обработки при высокой температуре; обработки основанием и/или механическим лизисом. Высвобожденный полисахарид в неочищенном лизате затем оценивают против аутентичного стандарта с использованием гель-фильтрации ВЭЖХ.

В одном из аспектов, способ периодической ферментации с добавлением субстрата проводят до тех пор, пока концентрация полисахарида, определенная по концентрации сиаловой кислоты, в бактериальной клеточной культуре составляет, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л, такая как, по меньшей мере, приблизительно 300 мг/л, 350 мг/л, 400 мг/л, 450 мг/л, 500 мг/л, 550 мг/л, 600 мг/л, 650 мг/л, 700 мг/л, 750 мг/л, 800 мг/л, 900 мг/л, 1000 мг/л, 1200 мг/л, 1500 мг/л или 2000 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления способ периодической ферментации с добавлением субстрата проводят до тех пор пока концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л.

В одном из аспектов, концентрация полисахарида, определенная при помощи гель-фильтрации ВЭЖХ, в бактериальной клеточной культуре путем системы культивирования с периодической подпиткой может быть, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л, такой как, по меньшей мере, приблизительно 300 мг/л, 350 мг/л, 400 мг/л, 450 мг/л, 500 мг/л, 550 мг/л, 600 мг/л, 650 мг/л, 700 мг/л, 750 мг/л, 800 мг/л, 900 мг/л, 1000 мг/л, 1200 мг/л, 1500 мг/л или 2000 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л.

Способ перфузионной ферментации

В одном из вариантов осуществления полисахарид-продуцирующую бактериальную клетку культивируют в культуральной системе с перфузией. Авторы изобретения открыли, что максимальную выработку полисахарида можно получать в перфузионной культуре с использованием сложных сред и сред определенного состава, описанных выше. Преимуществом перфузионной системы является то, что свежую среду можно добавлять непрерывно. Кроме того, продукты обмена веществ можно удалять во время продукции, с одновременным поддержанием жизнеспособности клеток в системе.

Система перфузионной культуры может включать обеспечение свежей среды клеткам с одновременным удалением использованной среды, которая по существу свободна от клеток или содержит по существу более низкую концентрацию клеток, чем в биореакторе. В перфузионной культуре, клетки можно сохранять, например, фильтрацией, ультразвуковой фильтрацией, центрифугированием или осаждением.

В одном из вариантов осуществления использованную среду отделяют от клеток и удаляют, с одновременным сохранением клеток в биореакторе или с возвращением клеток в биореактор. Этап разделения может представлять собой обычный поточный фильтр и/или тангенциальный поточный фильтр. В одном из вариантов осуществления указанная система фильтрации содержит фильтр с полыми волокнами. В другом варианте осуществления указанная система фильтрации содержит кассету с плоскими листами. В другом варианте осуществления клетки отделяют от использованной среды посредством этапа центрифугирования. В другом варианте осуществления клетки отделяют от использованной среды посредством этапа ультразвукового разделения. В другом варианте осуществления клетки отделяют от использованной среды посредством системы осаждения.

В одном из вариантов осуществления скорость перфузии может составлять приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 2,00 VVH, такая как приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 1,33 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 1,20 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 1,07 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 0,93 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 0,80 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 0,67 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 0,53 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 0,40 VVH, приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 0,27 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 2,00 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 1,33 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 1,20 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 1,07 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 0,93 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 0,80 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 0,67 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 0,53 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 0,40 VVH, приблизительно от 0,13 VVH до приблизительно 0,27 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 2,00 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 1,33 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 1,20 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 1,07 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 0,93 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 0,80 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 0,67 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 0,53 VVH, приблизительно от 0,27 VVH до приблизительно 0,40 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 2,00 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 1,33 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 1,20 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 1,07 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 0,93 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 0,80 VVH, приблизительно от 0,40 VVH до приблизительно 0,67 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 2,00 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 1,33 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 1,20 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 1,07 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 0,93 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 0,80 VVH, приблизительно от 0,53 VVH до приблизительно 0,67 VVH, приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 2,00 VVH, приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 1,33 VVH, приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 1,20 VVH, приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 1,07 VVH, приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 0,93 VVH, или приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 0,80 VVH. В одном из вариантов осуществления скорость перфузии составляет приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 1,33 VVH, предпочтительно приблизительно 1,20 VVH.

В одном из аспектов, длительность перфузионного культивирования может составлять приблизительно от 1 часа и приблизительно до 15 часов, такая как приблизительно от 1 часа и приблизительно до 14 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 13 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 12 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 11 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 10 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 9 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 8 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 7 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 6 часов, приблизительно от 1 часа и приблизительно до 5 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 15 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 14 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 13 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 12 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 11 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 10 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 9 часов, приблизительно от 5 часов и приблизительно до 8 часов, или приблизительно до от 5 часов и приблизительно до 7 часов. В одном из вариантов осуществления длительность перфузионного культивирования составляет приблизительно от 1 часа и приблизительно до 10 часов, предпочтительно приблизительно 7 часов.

В одном из конкретных аспектов, скорость перфузии может варьировать (повышаться или снижаться) в процессе культивирования. В одном из вариантов осуществления перфузионная система стартует с первой скоростью, и скорость повышается до второй скорости. В другом варианте осуществления перфузионная система стартует с первой скоростью, и скорость снижается до второй скорости. В дополнительном варианте осуществления скорость перфузии может меняться несколько раз.

В одном из аспектов, скорость перфузии сохраняется постоянной в процессе культивирования.

В другом аспекте по изобретению, рост клеток в перфузионной системе может быть, по меньшей мере, в 1,1 раза, такой как в 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 или 2,5 раза больше, чем в системе ферментации с периодической подпиткой. В предпочтительном варианте осуществления рост клеток в перфузионной системе, по меньшей мере, в два раза больше, чем в системе ферментации с периодической подпиткой.

В еще одном аспекте способ перфузионного ферментирования проводят до тех пор пока плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, в бактериальной клеточной культуре составляет, по меньшей мере, 20,0, такая как, по меньшей мере, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 50,0, 55,0, или 60,0. В предпочтительном варианте осуществления способ перфузионного ферментирования проводят до тех пор пока плотность клеток составляет, по меньшей мере, 20,0.

В еще одном аспекте плотность клеток, определенная путем оптической плотности (OD) при 600 нм, в бактериальной клеточной культуре с перфузионной системой по изобретению может быть, по меньшей мере, 20,0, такой как, по меньшей мере, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 50,0, 55,0, или 60,0. В предпочтительном варианте осуществления плотность клеток составляет, по меньшей мере, 20,0.

В другом аспекте по изобретению, концентрация полисахарида в перфузионной системе, по меньшей мере, в 1,5 раза, такая как, по меньшей мере, в 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, или 3,5 раз больше, чем в системе ферментации с периодической подпиткой. В предпочтительном варианте осуществления концентрация полисахарида в перфузионной системе, по меньшей мере, в 2 раза больше, чем в системе ферментации с периодической подпиткой.

Для полисахаридов, которые содержат сиаловую кислоту, таких как у GBS, выход полисахарида можно определять, измеряя концентрацию сиаловой кислоты. Сиаловая кислота высвобождается из полисахарида, связанного с клетками, путем расщепления осадка клеток способами, хорошо известными в данной области. Расщепление оценивают путем анионообменной хроматографии (AEX) посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Концентрацию полисахарида затем определяют, умножая величину сиаловой кислоты на коэффициент веса повторяющейся единицы. Например, коэффициент для каждого серотипа для каждого серотипа GBS является следующим: Ia, Ib, и II =3,24; II и V=4,29; и IV=3,77. Выход полисахарида для S. или других инкапсулированных бактерий можно оценивать количественно сначала высвобождая капсулярный полисахарид из клеточной стенки путем обработки детергентом, таким как натрий дезоксихолевая кислота (DOC) или N-лаурил-саркозин натрия (NLS); кислотной обработки при высокой температуре; обработки основанием и/или механическим лизисом. Высвобожденный полисахарид в неочищенном лизате затем оценивают против аутентичного стандарта с использованием гель-фильтрации ВЭЖХ.

В одном из аспектов, способ перфузионной ферментации проводят до тех пор пока концентрация полисахарида, определенная по концентрации сиаловой кислоты, в бактериальной клеточной культуре составляет, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л, такая как, по меньшей мере, приблизительно 650 мг/л; 700 мг/л; 750 мг/л; 800 мг/л, 850 мг/л; 900 мг/л; 950 мг/л; 1000 мг/л; 1500 мг/л; или 2000 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления способ перфузионной ферментации проводят до тех пор пока концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л.

В одном из аспектов, концентрация полисахарида, определенная путем гель-фильтрации ВЭЖХ, в бактериальной клеточной культуре с перфузионной системой по изобретению может быть, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л, такая как, по меньшей мере, приблизительно 650 мг/л; 700 мг/л; 750 мг/л; 800 мг/л, 850 мг/л; 900 мг/л; 950 мг/л; 1000 мг/л; 1500 мг/л; или 2000 мг/л. В предпочтительном варианте осуществления концентрация полисахарида составляет, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры демонстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не претендуют на полноту в отношении условий и объема по настоящему изобретению. Следует понимать, что когда приведены типичные условия реакции (например, температура, время реакции, и т.д.), также можно использовать условия выше и ниже указанных диапазонов, хотя они, как правило, менее удобны. Все части и проценты, упомянутые в настоящем документе, приведены на основании массы, и все температуры выражены в градусах Цельсия, если не указано иное.

Кроме того, следующие примеры проводили с использованием стандартных способов, которые хорошо известны и являются рутинными для специалистов в данной области, за исключением иных случаев, описанных подробно. Как указано выше, следующие примеры представлены с иллюстративной целью, и никоим образом не должны истолковываться как ограничивающие объем по настоящему изобретению.

Пример 1: A Среда определенного состава по изобретению

Среда определенного состава для культивирования клеток млекопитающих («R17»), являющаяся авторской разработкой заявителей, была модифицирована для роста Streptococcus pneumoniae с получением «модифицированной среды AS3» (также упоминаемой как «mAS3»). Модифицированную среду AS3 составляют из компонентов из таблицы 3 ниже. Среды, приготовленные для серотипов 4, 5, 6A, 6B, 14, и 23F формулируют с 30г/л декстрозы и 0,6 г/л сульфата магния. В случае серотипов 1, 3, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, и 19F, 30 г/л декстрозы добавляли к среде в реакторе.

Таблица 3: Модифицированная среда AS3
Компонент	Концентрация (г/л)
Сухой порошок R-17	15,56 г/л
L-тирозина динатриевая соль, дигидрат	0,643 г/л
Декстроза безводная	25 г/л
Хлорид натрия	1,1 г/л
300 мМ стока кислого цистина	3,75 мл/л
L-Аспарагина моногидрат	2,25 г/л
L-Глутамин	1,17 г/л
1 мМ стока сульфата железа	15 мл/л
Микроэлементы E	1 мл/л
Сульфат магния, гептагидрат	1,23 г/л

Полный состав композиции по аминокислотам, витаминам и солям в порошке R17 приведен в таблице 4 ниже.

Таблица 4. Композиция порошка R17
Аминокислоты	г/л	мМ	Микроэлементы	мкг/л	нМ
аланин	0,02	0,20	Селенит натрия	69,16	400,00
аргинин	0,70	4,00	CuSO₄	10,24	64,00
аспарагиновая кислота	0,22	1,65	CuSO₄⋅5H₂O	99,88	400,00
цистеин⋅HCl⋅H₂O	0,07	0,40	FeSO₄⋅7H₂O	4170	15000
мононатриевый глутаминат	0,03	0,20	MnSO₄⋅H₂O	33,80	200,00
глицин	0,12	1,54	Na₂SiO₃⋅9H₂O	284,07	1000
гистидин⋅HCl⋅H₂O	0,47	2,26	(NH₄)₆Mo₇O₂₄⋅4H₂O	247,20	200,00
изолейцин	0,57	4,36	NH₄VO₃	2,34	20,00
лейцин	1,03	7,87	NiSO₄⋅6H₂O	5,26	20,00
лизин⋅HCl	1,40	7,70	SnCl₂⋅2H₂O	0,90	4,00
метионин	0,39	2,60	AlCl₃⋅6H₂O	0,97	4,00
фенилаланин	0,51	3,07	KBr	0,48	4,00
пролин	0,54	4,69	CrCl₃	15,83	100,00
серин	1,05	10,02	NaF	0,17	4,00
треонин	0,56	4,75	GeO₂	0,42	4,00
триптофан	0,27	1,34	KI	33,20	200,00
валин	0,75	6,40	RbCl	0,48	4,00
			H₃BO₃	12,37	200,00
			LiCl	0,17	4,00
Другие компоненты	г/л	нМ
линолевая кислота	0,0003	1,04	Витамины	г/л	мМ
тиоктацид	0,0007	3,48	биотин	0,003	0,01
D-глюкоза (Декстроза)	5,00	83,33	Пантотенат кальция	0,02	0,05
Пируват натрия	0,06	0,50	холина хлорид	0,16	1,14
			фолиевая кислота	0,03	0,06
Неорганические соли	г/л	мМ	инозитол	0,16	0,91
CaCl₂	0,12	1,05	никотинамид	0,03	0,22
KCl	0,31	4,19	пиридоксаль⋅HCl	0,002	0,01
Na₂HPO₄	0,06	0,40	пиридоксин⋅HCl	0,004	0,18
NaH₂PO₄⋅H₂O	0,65	4,68	рибофлавин	0,002	0,01
MgCl₂	0,03	0,30	тиамин⋅HCl	0,04	0,12
MgSO₄	0,14	1,15	витамин B12	0,02	0,02

Ферментацию с периодической подпиткой проводили в двухлитровом биореакторе с контролем температуры при 36°C и контролем pH при 7,0 с NaOH, используемым в качестве основного титрующего вещества. Ферментер наполняли инертной атмосферой с подачей N₂ для серотипов 1, 3, 4, 6A, 6B, 7F, 9V, 18C, 19A, и 19F и с подачей воздуха для серотипов 6B(2), 14 и 23F; никакой подачи не применяли для серотипа 5. Ферментацию перемешивали при 200 об./мин. Результаты показаны в таблице 5 ниже.

Таблица 5. Рост и выработка полисахарида *S. pneumoniae* в модифицированной среде AS3
Серотип	Рост OD600	Полисахарид (г/л)
1	9,1	1,38
3	11,5	3,19
4	9,5	0,50
5	7,5	0,40
6A	6,6	1,10
6B	6,0	2,00
6B(2)	6,3	1,20
7F	8,0	0,70
9V	7,4	0,54
14	6,8	1,10
18C	7,0	0,97
19A	5,0	2,40
19F	5,5	0,86
23F	6,5	1,10

Тринадцать серотипов S. pneumoniae успешно выросли в культуре с подпиткой с использованием химически измененной модифицированной среды AS3.

Пример 2: Сравнение коммерчески доступной среды определенного состава со средой определенного состава по изобретению

Минимальную поддерживающую среду Игла (EMEM), коммерчески доступную среду определенного состава для культивирования клеток, тестировали в сравнении R17 с использованием различных серотипов GBS. Состав каждой из них был модифицирован в отличие от приложенной инструкции для удовлетворения потребностей в бикарбонате натрия для GBS, растущих анаэробно. Каждая среда была также дополнена высокой концентрацией глюкозы для поддержания более высокой плотности клеток, достигаемой в бактериальных культурах. Состав для EMEM, модифицированный как бактериальная среда («бактериальная EMEM») был следующим: 20,2 г/л порошка EMEM, 1,17 г/л L-глутамина, 0,84 г/л бикарбоната натрия и 80 г/л глюкозы. Композиция mAS3 для GBS (как описано в примере 1) была адаптирована для роста GBS (далее в настоящем документе «GBS mAS3») следующим образом: 0,21 г/л L-цистеина HCl (вместо 300 мМ стока кислого цистина), 2 мл/л (вместо 1 мл/л) микроэлемента E 1000X, 0,84 г/л бикарбоната натрия и 80 г/л глюкозы (вместо 25 г/л безводной декстрозы).

Ферментацию проводили в масштабе 10-литрового биореактора с контролем температуры при 37°C и контролем pH при 7,0 с NaOH, используемым в качестве основного титрующего вещества. Ферментер наполняли инертной атмосферой с подачей N₂ при 0,1 об/об/мин относительно объема загрузки; ферментацию перемешивали с покачиванием, достаточным для достижения коэффициента переноса кислорода kLa 1 час^-1. Результаты показаны в таблице 6 ниже

Таблица 6. Сравнение бактериальной EMEM и GBS mAS3
	Рост OD₆₀₀	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	Бактериальная EMEM	GBS mAS3	Бактериальная EMEM	GBS mAS3
Ia	3,9	8,9	70	750
Ib	3,6	8,3	90	270
II	3,1	9,7	60	190
III	3,7	5,1	210	270
IV	3,6	8,2	70	260
V	3,8	9,6	50	220

Среда GBS mAS3 показала неожиданное преимущество над бактериальной средой EMEM и в росте, и в концентрации полисахарида.

Пример 3: Сравнение сложной среды со средой определенного состава по изобретению

Модифицированную среду AS3, как описано в примере 1, и сложную среду на основе соевого гидролизата (BPDv3) сравнивали для различных серотипов S. pneumoniae. BPDv3 состояла из 28 г/л HYPEP1510 (Kerry Group Services Ltd.), 54 г/л глюкозы, 3,5 г/л NaCl, 0,7 г/л KH₂PO₄, 0,0182 г/л CaCl_2,2H₂O, 1 г/л MgSO_4,7H₂O, 0,84 г/л NaHCO₃, 3 г/л хлорида аммония, 0,25 г/л уридина, 0,25 г/л аденозина, 0,03 г/л ниацинамида, 0,03 г/л пиридоксина HCl, 0,0075 г/л пантотеновой кислоты и 0,003 г/л PABA. Среда для серотипа 12F была дополнена 1 г/л мононатриевого глутамината, и среда для серотипа 8 была модифицирована содержанием 0,5 г/л хлорида аммония и 36 г/л глюкозы. Хотя титр полисахарида не был стабильно улучшен в модифицированной среде AS3 по сравнению со сложной средой, модифицированная среда AS3 показала улучшенный рост почти для всех серотипов (см. Таблица 7).

Таблица 7. Сравнение модифицированной среды R17 и сложной среды
	Рост(OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип S. pneumoniae	Модифицированная AS3	BPDv3	Модифицированная AS3	BPDv3
8	9,2	5,2	2630	2310
10A	12,9	8,1	790	890
11A	14,8	7,3	1210	1140
12F	9,4	10,0	910	2130
15B	12,5	7,8	1170	1900
22F	14,4	6,4	1740	1350
33F	14,4	11,5	2580	3430

Пример 4: Потребление аминокислот

Анализ потребления аминокислот во время ферментации серотипа III GBS проводили для того чтобы определить, исчерпываются ли аминокислоты. Анализ концентрации аминокислот для mAS3 GBS (как в Примере 2) до засева и при сборе клеток представлен в таблице 8.

Таблица 8. Потребление аминокислот

Аминокислота	Начальная (мМ)	При сборе клеток (мМ)
Аланин	0	0,6
Аргинин	3,6	0
Аспарагиновая кислота	1,8	1,8
Аспарагин	16,7	14,9
Цистеин	<	<
Глутаминовая кислота	0,3	1,5
Глутамин	9,8	6,2
Глицин	1,4	0,2
Гистидин	2,3	2,2
Изолейцин	4,6	4
Лейцин	8,6	8
Лизин	9,3	6,2
Метионин	2,9	2,6
Фенилаланин	3,4	3,1
Пролин	5,1	5,1
Серин	10,8	0
Треонин	5,8	6,2
Триптофан	1,5	1,5
Тирозин	1,8	1,9
Валин	6,9	6,1

Хотя предсказанные требуемые аминокислоты не были исчерпаны, были исчерпаны четыре аминокислоты, для которых S. agalactiae предположительно являются прототрофами. Аргинин, глицин, и серин были исчерпаны ниже лимита количественной оценки. Цистеин, который трудно измерять способом ВЭЖХ, не был выявлен ни в одном временном образце. Все остальные аминокислоты при сборе клеток все еще были в избытке.

Четыре исчерпанных аминокислоты затем добавляли к среде GBS mAS3 при ферментации различных серотипов GBS в 4× концентрации в отношении основного состава порошка R17 (16 мМ arg, 1,6 мМ cys, 6 мМ gly, и 40 мМ ser). Результаты показаны в таблице 9 ниже.

Таблица 9. Сравнение GBS mAS3 и GBS mAS3, дополненной исчерпанными аминокислотами
	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	GBS mAS3	Дополненная CGRS	GBS mAS3	Дополненная CGRS
Ia	9,6	10,0	670	430
Ib	9,0	17,8	230	360
II	8,6	13,9	110	140
III	5,1	10,8	260	340
IV	7,4	10,7	330	270
V	9,4	16,4	140	210

Значимое улучшение роста наблюдали для всех шести серотипов, тестируемых со средой, дополненной CGRS. Хотя титры полисахарида не были повышены для всех серотипов, улучшение роста стимулировало к дальнейшему исследованию.

Пример 5: Дополнительный анализ исчерпанных аминокислот

Важность каждой из исчерпанных аминокислот для улучшения роста оценивали в эксперименте с использованием в качестве модели серотипа V GBS, в котором каждую из четырех аминокислот последовательно удаляли из среды. Было неожиданно обнаружено, что глицин является единственным источником улучшения роста (см. таблицу 10).

Таблица 10. Последовательное удаление добавляемых аминокислот
Добавленные аминокислоты	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)
Ни одной	9,7	240
CGRS	15,2	330
GRS	15,6	330
CRS	9,6	200
CGS	14,4	350
CGRS	15,1	360

Это подтвердили в последующем исследовании, в котором каждую из четырех аминокислот добавляли индивидуально, снова с использованием в качестве модели серотипа V GBS. Исследование подтвердило, что глицин был единственной аминокислотой из четырех исчерпанных аминокислот, которая улучшала рост и продукцию полисахарида (см. таблицу 11).

Таблица 11. Добавление отдельных аминокислот
Добавленная аминокислота/аминокислоты	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)
Ни одной	9,7	240
CGRS	15,2	330
Только G	13,1	440
Только A	8,8	280
Только C	9,0	310
Только S	9,3	280
Таблица 12. Сравнение GBS mAS3, GBS mAS3, дополненной всеми четырьмя аминокислотами, и GBS mAS3, дополненной только глицином
	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	GBS mAS3	Дополненная CGRS	Глицин	GBS mAS3	Дополненная CGRS	Глицин
Ia	9,6	10,0	12,1	670	430	850
Ib	9,0	17,8	11,1	230	360	480
II	8,6	13,9	12,1	110	140	403
III	5,1	10,8	10,1	260	340	569
IV	7,4	10,7	10,9	330	270	530
V	9,4	16,4	15,7	140	210	290

Важность добавленного глицина как единственного дополнения затем тестировали на нескольких серотипах GBS. Сравнивали параметры в GBS mAS3, GBS mAS3, дополненной всеми четырьмя аминокислотами, и GBS mAS3, дополненной только глицином. Результаты показаны в таблице 12 ниже.

В основном, добавления только глицина было достаточно для улучшения роста, приблизительно эквивалентного добавлению всех четырех аминокислот. Однако добавление только глицина неожиданно привело к более высокому титру полисахарида, чем при GBS mAS3 и добавлении всех четырех аминокислот.

Пример 6: Сравнение концентраций глицина

Ввиду неожиданно высокого производства полисахаридов с добавлением только глицина, проводили эксперимент, чтобы определить, получают ли максимальный рост и титр полисахарида с добавлением 6 мМ глицина в состав GBS mAS3. Эксперимент сравнивал добавление от 0,15 мМ до 123,2 мМ глицина с использованием серотипа V GBS в качестве модели. Данные в таблице 13 ниже показывают, что добавление всего 1,5 мМ глицина или настолько много, как 61,6 мМ, поддерживает такое же улучшение титра полисахарида, которое наблюдают с добавлением 6 мМ глицин.

Таблица 13. Сравнение концентраций глицина
Концентрация глицина (мМ)	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)
0	11,6	334
0,15	11,9	356
1,5	16,1	446
3,1	18,5	521
6,2	19,6	455
15,4	18,4	421
30,8	18,5	396
61,6	19,5	381
123,2	0	0

Пример 7: Определение несущественных компонентов в среде gbs mas3

Состав GBS mAS3 и его глицин-содержащие производные в примере 5-6 содержали 80 г/л глюкозы, чтобы гарантировать избыток источника углерода на всем протяжении и в конце ферментации. В основном, когда прекращались рост и продукция полисахарида, приблизительно 30 г/л глюкозы оставалось не потребленной (данные не показаны). Таким образом, проводили эксперимент для определения того, можно ли получить более эффективную среду. Глицин-дополненную среду GBS mAS3 с концентрациями глюкозы 80 г/л, 70 г/л, 60 г/л, и 50 г/л тестировали с серотипом V GBS в качестве модели. Данные в таблице 14 ниже показывают, что концентрация глюкозы 50 г/л не оставляет остаточной глюкозы, но также и не снижает титр полисахарида.

Таблица 14. Сравнение концентраций глюкозы
Загруженная глюкоза (г/л)	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)	Остаточная глюкоза (г/л)
80	17,6	410	28
70	18,2	420	17
60	18,8	430	10
50	19,4	420	0

Аналогично, исследовали важность всех аминокислот и солей, добавленных к порошку R17, не включая каждый из них, по одному за раз, в эксперименте с исключением. Работу проводили с серотипом V GBS в глицин-дополненной среде GBS mAS3. Данные в таблице 15 ниже указывают, что тирозин, глутамин, и цистеин необходимы для роста, в отличие от аспарагина, и все соли являются несущественными.

Таблица 15. Исключение аминокислот и солей
Удаленный компонент	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)
Ни одного	12,7	570
Asn	12,5	600
Gln	1,0	40
Tyr	0,2	10
Cys	6,2	290
Ни одного	13,2	510
Сульфат магния	13,5	540
Сульфат железа	12,3	510
Микроэлементы E	13,1	500
Хлорид натрия	13,1	520

Пример 8: Потребление витаминов и солей/микроэлементов

Проводили оценку остатков витаминов и солей/микроэлементов по сравнению с начальными концентрациями в глицин-дополненной среде GBSmAS3 с использованием серотипа III GBS в качестве модели. Было исследовано 13 витаминов: биотин, холин цианокобаламин, фолиевая кислота, ниацин, ниациламид, никотинамид, п-аминобензойная кислота, пантотеновая кислота, пиридоксаль, пиридоксамин, пиридоксин, рибофлавин и тиамин. Двенадцать из них не показали значительного изменения концентрации во время ферментации. Было обнаружено, что ниацинамид истощается до нуля в течение ферментации, но сопровождающее накопление ниацина указывает на то, что это семейство витаминов не истощается (данные не показаны).

Анализировали тридцать две соли и микроэлемента. Восемнадцать из них были ниже предела детекции. Эти 18 являются следующими: серебро, алюминий, мышьяк, бериллий, кадмий, хром, медь, ртуть, литий, марганец, никель, свинец, рубидий, селен, олово, титан, таллий и ванадий. Из 14 обнаруживаемых солей и микроэлементов 12 не показали существенного снижения концентрации от первоначального засева среды до сбора клеток (см. таблицу 16). Фосфор и калий показали снижение концентрации. Снижение концентрации фосфора было ожидаемым, поскольку он потребляется для роста клеток, но ограничения роста не было, поскольку фосфор оставался в избытке при сборе клеток. Снижение концентрации калия, однако, было неожиданным.

Таблица 16. Потребление солей и микроэлементов
	Начальная (мг/л)	При сборе (мг/л)
Бор	1,5	1,6
Барий	4,4	4,0
Кальций	36,1	23,4
Кобальт	0,9	0,8
Железо	0,8	0,7
Калий	292,0	22,0
Магний	138,0	121,0
Молибден	0,1	0,1
Натрий	1134,0	10851,0
Фосфор	159,0	44,0
Сера	303,0	349,0
Кремний	0,0	1,9
Стронций	0,1	0,1
Цинк	4,1	4,4

Данные повлекли за собой два исследования, в которых исследовали эффект добавления дополнительного 2-кратного количества хлорида калия (от 0,6 г/л до 0,31 г/л в порошок R17) в глицин-дополненные среды GBS mAS3 при ферментации серотипа III GBS. Результаты, показанные в таблице 17, указывают, что увеличение концентрации KCl было выгодно для титра полисахарида независимо от роста.

Таблица 17. Добавление KCl
№ исследования	Концентрация KCl (г/л)	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)
1	0,31	11,4	434
0,91	11,2	594
2	0,31	10,6	612
0,91	12,2	755

В дополнительном исследовании изучался более полный диапазон концентраций KCl (от 0,03 г/л до 24 г/л) в дополнение к 0,31 г/л KCl, содержащемся в исходном порошке R17) для их влияния на рост и синтез полисахарида. Результаты показаны в таблице 18, которые указывают, что концентрации KCl от 0,3 до 24 г/л дополнительно к порошку R17 способствуют улучшению роста и продукции полисахарида.

Таблица 18. Дополнение глицин-содержащего R17 диапазоном концентраций KCl
Дополнительно добавленный KCl (г/л)	Рост (OD600)	Полисахарид (мг/л)
0	12,3	308
0,03	15,3	347
0,3	17,8	382
0,6	18,2	387
1,2	19,5	406
3,0	19,7	402
17,0	19,7	432
12,0	17,1	370
24,0	17,9	382

Пример 9: Состав среды mas3opt50

Среда была построена так, чтобы включать увеличение глицина и KCl, снижение концентрации глюкозы, и отсутствие магния, аспарагина, и NaCl («mAS3opt50») в среде GBS mAS3. Новый состав тестировали в сравнении со средой GBS mAS3 для шести серотипов GBS. Как показано в таблице 19, переформулированная среда дает по существу улучшенный рост и сопутствующие титры полисахарида.

Таблица 19. Сравнение GBS mAS3 и mAS3opt50
	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	GBS mAS3	mAS3opt50	GBS mAS3	mAS3opt50
Ia	8,9	18,6	750	930
Ib	8,3	19,3	270	560
II	9,7	17,0	190	440
III	5,1	13,9	270	750
IV	8,2	10,4	260	360
V	9,6	18,0	220	390

Пример 10: Вклад глицина и kcl в выход полисахарида в mas3opt50

Подход исключения применяли, чтобы продемонстрировать важность добавления глицина и KCl для выхода полисахарида в среде mAS3opt50. Данные, показанные в таблице 20, ясно указывают, что каждый из них важен для поддержания высокого выхода.

Таблица 20. Исключение глицина и KCl в mAS3opt50
	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	mAS3opt50	-глицин	-KCl	mAS3opt50	-глицин	-KCl
Ia	18,6	13,2	15,6	930	780	840
Ib	17,5	8,4	12,2	580	300	440
II	12,9	8,8	12,3	375	206	311
III	13,5	10,5	12,1	770	400	550
IV	9,3	8,7	11,5	375	305	331
V	19,3	10,4	13,9	428	265	328

Пример 11: Сравнение mas3opt50 со сложной средой и сложной средой, дополненной дрожжевым экстрактом

Начальная сложная среда («HP») представляла собой состав на основе соевого гидролизата: 28 г/л HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.), 3,5 г/л NaCl, 0,7 г/л KH₂PO₄, 0,0182 г/л CaCl_2,2H₂O, 1 г/л MgSO_4,7H₂O, 0,84 г/л NaHCO₃, и 80 г/л глюкозы. Ферментация шести серотипов GBS в этой среде давала рост и титры, которые были по существу ниже, чем в mAS3opt50. Таким образом, HP была дополнена 10 г/л AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.) («HPYE»), ультрафильтрованным экстрактом дрожжей. Среда HPYE по существу не улучшила плотности клеток и титры полисахарида по сравнению со средой HP. Хотя HPYE показала повышенный рост почти для всех серотипов по сравнению с mAS3opt50, титры полисахарида были несколько меньше в среде HPYE. Все данные показаны в таблице 21 ниже.

Таблица 21. Сравнение mAS3opt50 со сложной средой и сложной средой, дополненной дрожжами
	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	mAS3opt50	P	HPYE	mAS3opt50	HP	HPYE
Ia	18,6	9,8	17,9	930	410	770
Ib	19,3	8,1	22,7	560	120	460
II	17,0	13,1	19,1	440	150	230
III	13,9	11,4	19,3	750	440	630
IV	10,4	18,4	16,5	360	120	280
V	18,0	11,6	20,5	390	170	390

Пример 12: Титрование экстракта дрожжей в сложной среде

Титрование проводили для определения концентрации дополнения экстрактом дрожжей для достижения оптимального роста и продукции полисахарида. В качестве модели использовали серотип V GBS для оценки влияния добавки экстракта дрожжей с AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.) при 0 г/л, 2,5 г/л, 5 г/л, 10 г/л, 20 г/л и 40 г/л. Как показано в таблице 22, Данные указывают, что добавки с 2,5 г/л дрожжей было достаточно для стимуляции роста и продукции капсулярного полисахарида. Однако оптимальная концентрация добавки экстракта дрожжей составила 10 г/л, поскольку добавление больших количеств уже не давало дополнительных преимуществ.

Таблица 22. Влияние титра экстракта дрожжей на рост и продукцию полисахарида в сложной среде
Концентрация экстракта дрожжей (г/л)	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
0	10,9	64
2,5	18,0	259
5,0	19,6	291
10,0	20,4	320
20,0	20,7	282
40,0	23,5	279

Пример 13: Добавка экстракта дрожжей в среды определенного состава

Учитывая положительное влияние добавок с экстрактом дрожжей на титр полисахарида в сложной среде, проводили эксперименты, которые исследовали добавление в GBS mAS3 AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.). GBS mAS3, дополненную ультрафильтрованным экстрактом дрожжей («R17YE»), сравнивали с GBS mAS3 и mAS3opt50. Добавка экстракта дрожжей к R17 резко улучшила титр полисахарида по сравнению с GBS mAS3 и mAS3opt50 (см. таблицу 23).

Таблица 23. Сравнение GBS mAS3 с добавкой экстракта дрожжей, GBS mAS3 и mAS3opt50
	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	GBS mAS3	R17YE	mAS3opt50	GBS mAS3	R17YE	mAS3opt50
Ia	8,9	20,0	18,6	750	750	930
Ib	8,3	18,8	19,3	270	690	560
II	9,7	18,2	17,0	190	350	440
III	5,1	16,5	13,9	270	750	750
IV	8,2	16,2	10,4	260	560	360
V	9,6	18,8	18,0	220	470	390

Затем было проведено исследование для сравнения добавок с различной концентрацией ультрафильтрованного экстракта дрожжей с добавкой с изменяющейся концентрацией коммерчески доступного «синтетического» экстракта дрожжей от BD Biosciences (BD RECHARGE). В качестве модели применяли серотип V GBS. Данные, показанные в таблице 24, указывают, что, хотя 20 г/л экстракта дрожжей (либо ультрафильтрованного, либо синтетического) придает улучшение роста, отсутствует соответствующее увеличение титра полисахарида. Добавка с синтетическим экстрактом дрожжей улучшает рост по сравнению с контрольной GBS mAS3, но не дает максимальный титр, который достигается с помощью ультрафильтрованного экстракта дрожжей.

Таблица 24. Сравнение различных концентраций ультрафильтрованного экстракта дрожжей и синтетического экстракта дрожжей
Добавка к GBS mAS3	Рост (OD₆₀₀)	Полисахарид (мг/л)
Отсутствует	9,8	240
5 г/л AMBERFERM 5902	15,5	440
10 г/л AMBERFERM 5902	18,1	470
20 г/л AMBERFERM 5902	26,2	480
10 г/л BD RECHARGE	18,0	320
20 г/л BD RECHARGE	19,2	320

Пример 14: Анализ ферментации с постоянной подачей глюкозы

Постоянную подачу глюкозы исследовали на ее воздействие на поддержание титров полисахарида со средой mAS3opt50 с использованием в качестве модели различных серотипов GBS serotypes. Сравнение исходной загрузки 50 г/л глюкозы и ферментации с подачей глюкозы (10 г/л глюкоза исходно и оставшиеся 40 г/л подаются с постоянной скоростью в течение 7 часов, начиная через 3-4 часа истекшего времени ферментации (EFT) указывает на то, что сопоставимый рост и титры полисахарида были достигнуты у всех серотипов (см. таблицу 25). Контрольные параметры ферментации во всем остальном были теми, что представлены в примере 2.

Таблица 25. Ферментация с периодической подпиткой глюкозой со средой mAS3opt50
	Рост OD₆₀₀	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	Загрузка	Подпитка	Загрузка	Подпитка
Ia	11,0	13,5	610	790
Ib	15,3	17,6	530	460
II	15,1	14,4	270	300
III	11,7	13,2	590	660
IV	9,7	9,3	330	340
V	15,2	15,0	280	360

Пример 15: Ферментация с периодической подпиткой глюкозой со средами HPYE и GBS MAS3

Ферментацию с периодической подпиткой также исследовали для сред HPYE и GBS MAS3 с использованием в качестве модели серотипа V GBS. Ферментацию начинали с загрузки 10 г/л глюкозы, а затем 70 г/л глюкозы добавляли в течение 5 часов через 3-4 часа EFT. Ферментация во всем остальном были устроена, как в примере 2. Данные, представленные в таблице 26, указывают, что подход с периодической подпиткой дает примерно эквивалентную продуктивность для GBS MAS3 по сравнению с подходом с загрузкой. Подход с подпиткой поддерживает продукцию полисахарида в HPYE, но с несколько более низкой продуктивностью, чем подход с загрузкой.

Таблица 26. Сравнение роста и продукции полисахарида серотипа V с загрузкой глюкозы в один прием или с периодической подпиткой в средах mAS3opt50, HPYE и GBS mAS3
	Рост (OD₆₀₀)	полисахарид (мг/л)
минимальная среда	загрузка	подпитка	загрузка	подпитка
MAS3OPT50	15,1	15,0	280	360
HPYE	19,8	23,4	390	334
GBS MAS3	9,7	10,1	175	182

Пример 16: Перфузионная ферментация

Эксперименты с перфузией с использованием модифицированной среды AS3, описанной в примере 1, проводили на 13 серотипах S. pneumoniae. Среду засевали и растили периодическим способом в двухлитровом биореакторе в течение приблизительно 4-10 часов, пока OD₆₀₀ не достигала 3-7. Культура затем циркулировала через перфузионную систему, где удаляли использованную среду и продукты обмена, и культуральный объем поддерживали добавлением свежей среды. Перфузия начиналась с начальной скороти 0,13 VVH и постепенно нарастала до 0,80 VVH в течение 3-5 часов, в этой точке период перфузии заканчивался. Данные, показанные в таблице 27 ниже, указывают на значимое увеличение уровней биомассы с соответствующим увеличением произведенного полисахарида по сравнению с периодической ферментацией в примере 1.

Таблица 27. Рост и продукция полисахарида у *S. pneumoniae* при перфузионной ферментацией по сравнению с периодической ферментацией
	Перфузия	Периодическая
Серотип	Рост OD600	Полисахарид (г/л)	Рост OD600	Полисахарид (г/л)
1	36	3,4	9,1	1,38
3	20	2,4	11,5	3,19
4	51	2,4	9,5	0,50
5	32	2,7	7,5	0,40
6A	42	5,3	6,6	1,10
6B	30	3,5	6,0	2,00
7F	51	5,6	8,0	0,70
9V	37	5,1	7,4	0,54
14	30	2,2	6,8	1,10
18C	35,5	5,5	7,0	0,97
19A	26	4,9	5,0	2,40
19F	55	5,4	5,5	0,86
23F	37	4,4	6,5	1,10

Пример 17: Сравнение способов перфузионной и периодической ферментации в трех различных средах

Проводили эксперименты с перфузией с использованием GBS mAS3 или HPYE в качестве основной среды. 1× среду (содержащую 0,5× глюкозы) засевали и периодическим способом (рабочий объем 5 литров) в течение приблизительно 3 часов. Когда OD достигала 1-5 OD, начинали перфузию с 0,5× средой с начальной скоростью 0,13 VVH в течение приблизительно одного часа. Скорость увеличивали до 1,20 VVH в течение 6-7 часов, и в этой точке период перфузии заканчивали. Данные для перфузии с GBS mAS3, показанные в таблице 28 ниже, указывают на приблизительно в 1,4-2 раза повышение плотности клеток по сравнению с периодической ферментацией, с сопутствующим повышением титра полисахарида.

Таблица 28.
	Рост OD₆₀₀	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	Периодическая	Перфузия	Периодическая	Перфузия
Ia	18,6	25,6	930	1300
Ib	19,3	41,6	560	740
II	17,0	27,7	440	860
III	13,9	32,3	750	1770
IV	8,2	ND	260	ND
V	18,0	28,1	390	730

*ND=тест не делали.

Данные для перфузии на основе сложной среды HPYE показаны в таблице 29 ниже. В основном, перфузия приводит более чем к 2-кратному повышению плотности клеток по сранению с периодической ферментацией и от 2 до 3,5-кратного улучшения по титру полисахарида.

Таблица 29.
	Рост OD₆₀₀	Полисахарид (мг/л)
Серотип GBS	Периодическая	Перфузия	Серотип GBS	Периодическая
Ia	17,9	50,6	770	1940
Ib	22,7	27,9	460	1100
II	19,1	44,0	230	820
III	19,3	39,7	630	1150
IV	16,5	ND	280	ND
V	20,5	50,0	390	680

*ND=тест не делали.

Перфузию в среде на основе mAS3opt50 проводили аналогично с использованием в качестве модели серотипа IV. OD600 при сборе клеток составило 16,7; продукция полисахарида составила 667 мг/л. Для сравнения, mAS3opt50 с периодической ферментацией, представленная в Примере 8, дала плотность клеток 10,4 и величину продукции полисахарида 360 мг/л, что свидетельствовало о повышении продуктивности примерно в 1,9 раза.

Подводя итоги, перфузионная ферментация привела приблизительно к двукратной или лучшей продукции полисахарида по сравнению с периодическим культивированием во всех трех использованных средах.

Аспекты изобретения

Следующие пункты описывают дополнительные варианты осуществления изобретения:

C1. Полисахарид-продуцирующая бактериальная среда для культивирования клеток, содержащая растительный гидролизат, экстракт дрожжей и источник углерода.

C2. Среда по C1, где растительный гидролизат представляет собой соевый гидролизат.

C3. Среда по C2, где соевый гидролизат выбран из группы, состоящей из HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.), HYPEP 4601 (Kerry Group Services Ltd.), HYPEP 5603 (Kerry Group Services Ltd.), HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.), AMI-SOY (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY (Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY BL4 ( Kerry Group Services Ltd.), N-Z-SOY BL7 (Kerry Group Services Ltd.), SHEFTONE D (Kerry Group Services Ltd.), SE50M, SE50MK, соевого пептона, сойтона BACTO (Difco Laboratories Inc.), NUTRISOY 2207 (ADM), NUTRISOY (ADM), NUTRISOY flour (ADM), и жмыха соевых бобов.

C4. Среда по C3, где соевый гидролизат представляет собой HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.).

C5. Среда по любому из C1-C4, где концентрация растительного гидролизата составляет приблизительно от 5 г/л и приблизительно до 75 г/л.

C6. Среда по C5, где концентрация растительного гидролизата составляет приблизительно от 10 г/л и приблизительно до 50 г/л.

C7. Среда по C6, где концентрация растительного гидролизата составляет приблизительно 28 г/л.

C8. Среда по любому из C1-C7, где экстракт дрожжей представляет собой дрожжевой аутолизат, ультрафильтрованный экстракт дрожжей или синтетический экстракт дрожжей.

C9. Среда по C8, где экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей.

C10. Среда по C9, где ультрафильтрованный экстракт дрожжей представляет собой AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.), BD DIFCO (BD Biosciences), HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.) или HY-YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.).

C11. Среда по любому из C1-C10, где концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно от 1 г/л до приблизительно 50 г/л.

C12. Среда по C11, где концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л.

C13. Среда по C12, где концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно 10 г/л.

C14. Среда по любому из C1-C13, где источник углерода выбран из группы, состоящей из глюкозы, декстрозы, манниты, лактозы, сахарозы, фруктозы, галактозы, рафинозы, ксилозы и маннозы.

C15. Среда по C14, где источник углерода представляет собой глюкозу.

C16. Среда по любому из C1-C15, где концентрация источника углерода составляет приблизительно от 25 г/л до приблизительно 100 г/л.

C17. Среда по C16, где концентрация источника углерода составляет приблизительно от 50 г/л до приблизительно 90 г/л.

C18. Среда по C17, где концентрация источника углерода составляет приблизительно 80 г/л.

C19. Среда по любому из C1-C18, где среда содержит соевый гидролизат, ультрафильтрованный экстракт дрожжей и глюкозу.

C20. Среда по любому из C1-C19, где среда дополнительно содержит фосфат-содержащий ингредиент.

C21. Среда по C20, где фосфат-содержащий ингредиент представляет собой Na₂HPO₄, K₂HPO₄ или KH₂PO₄.

C22. Среда по любому из C1-C21, где среда дополнительно содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, витамин, нуклеозид или неорганическую соль.

C23. Полисахарид-продуцирующая бактериальная среда для культивирования клеток с общей концентрацией аминокислот больше чем приблизительно 50 мМ.

C24. Среда по C23, где среда содержит общую концентрацию глицина приблизительно от 1,5 мМ и приблизительно до 60,0 мМ.

C25. Среда по C24, где общая концентрация глицина составляет приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ.

C26. Среда по C25, где общая концентрация глицина составляет приблизительно 7,5 мМ.

C27. Среда по любому из C23-26, где среда содержит общую концентрацию аргинина приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ.

C28. Среда по C27, где общая концентрация аргинина составляет приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ.

C29. Среда по C28, где общая концентрация аргинина составляет приблизительно 4,0 мМ.

C30. Среда по любому из C23-C29, где среда содержит общую концентрацию цистеина приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 5,0 мМ.

C31. Среда по C30, где общая концентрация цистеина составляет приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 3,5 мМ.

C32. Среда по C31, где общая концентрация цистеина составляет приблизительно 0,4 мМ.

C33. Среда по любому из C23-C32, где среда содержит общую концентрацию серина приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 75,0 мМ.

C34. Среда по C33, где общая концентрация серина составляет приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ.

C35. Среда по C34, где общая концентрация серина составляет приблизительно 7,5 мМ, или приблизительно до 10 мМ.

C36. Среда по любому из C23-C35, где среда содержит общую концентрацию глутамина приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ.

C37. Среда по C36, где общая концентрация глутамина составляет приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 20,0 мМ.

C38. Среда по C37, где общая концентрация глутамина составляет приблизительно 4,0 мМ.

C39. Среда по любому из C23-C38, где среда содержит общую концентрацию тирозина приблизительно от 0,1 мМ и приблизительно до 5,0 мМ.

C40. Среда по C39, где общая концентрация тирозина составляет приблизительно от 1,0 мМ и приблизительно до 3,5 мМ.

C41. Среда по C40, где общая концентрация тирозина составляет приблизительно 2,9 мМ или приблизительно до 3,0 мМ.

C42. Среда по любому из C23-C41, где среда содержит общую концентрацию аспарагина приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 50,0 мМ.

C43. Среда по C42, где общая концентрация аспарагина составляет приблизительно от 10,0 мМ и приблизительно до 30,0 мМ.

C44. Среда по C43, где общая концентрация аспарагина составляет приблизительно 20,0 мМ.

C45. Среда по любому из C23-C41, где среда не содержит аспарагин.

C46. Среда по любому из C23-C45, где среда дополнительно содержит калиевую соль.

C47. Среда по C46, где калиевая соль представляет собой хлорид калия или сульфат калия.

C48. Среда по C46 или C47, где общая концентрация калиевой соли составляет приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 25 г/л.

C49. Среда по C48, общая концентрация калиевой соли составляет приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л.

C50. Среда по C49, где общая концентрация калиевой соли приблизительно 0,9 г/л.

C51. Среда по любому из C23-C50, где среда дополнительно содержит источник углерода.

C52. Среда по C51, где источники углерода выбраны из группы, состоящей из глюкозы, декстрозы, маннита, лактозы, сахарозы, фруктозы, галактозы, рафинозы, ксилозы и маннозы.

C53. Среда по C52, где источник углерода представляет собой глюкозу.

C54. Среда по любому из C51-C53, где среда содержит общую концентрацию источника углерода приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 100 г/л.

C55. Среда по C54, где общая концентрация источника углерода составляет приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л.

C56. Среда по C55, где общая концентрация источника углерода составляет приблизительно 50 г/л.

C57. Среда по любому из C23-C56, где среда дополнительно содержит бикарбонат натрия.

C58. Среда по C57, где среда содержит концентрацию бикарбоната натрия приблизительно от 0,1 г/л и приблизительно до 20 г/л.

C59. Среда по C58, где концентрация бикарбоната натрия составляет приблизительно от 0,5 г/л и приблизительно до 1,0 г/л.

C60. Среда по C59, где концентрация бикарбоната натрия составляет приблизительно 0,84 г/л.

C61. Среда по любому из C23-C60, где среда дополнительно содержит экстракт дрожжей.

C62. Среда по C61, где экстракт дрожжей выбран из группы, состоящей из дрожжевого аутолизата, ультрафильтрованного экстракта дрожжей или синтетического экстракта дрожжей.

C63. Среда по C62, где экстракт дрожжей представляет собой ультрафильтрованный экстракт дрожжей.

C64. Среда по C63, где ультрафильтрованный экстракт дрожжей представляет собой AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.), BD DIFCO (BD Biosciences), HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.), HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.), или HY-YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.).

C65. Среда по любому из C61-C64, где концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно от 1 г/л до приблизительно 50 г/л.

C66. Среда по C65, где концентрация концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л.

C67. Среда по C66, где концентрация экстракта дрожжей составляет приблизительно 10 г/л.

C68. Среда по любому из C23-C67, где среда содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ аминокислот, калиевую соль, источник углерода, и необязательно, экстракт дрожжей.

C69. Среда по C68, где среда содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 мМ аминокислот, приблизительно от 5,0 мМ и приблизительно до 15,0 мМ глицина, приблизительно от 0,2 г/л и приблизительно до 1,25 г/л калиевой соли, приблизительно от 25 г/л и приблизительно до 80 г/л источника углерода, и приблизительно от 5 г/л до приблизительно 25 г/л экстракта дрожжей.

C70. Среда по C69, где среда содержит, по меньшей мере, приблизительно 60 мМ аминокислот, приблизительно 7,5 мМ глицина, приблизительно 0,9 г/л хлорида калия, 50 г/л глюкозы, и приблизительно до 10 г/л ультрафильтрованного экстракта дрожжей.

C71. Способ культивирования бактерий, производящих полисахариды, включающий a) добавление среды по любому из C1-C70 в биореактор, b) засев среды бактериями, производящими полисахариды, и c) культивирование бактерий путем ферментации, где указанное культивирование включает добавление питательного вещества с постоянной скоростью к среде.

C72. Способ культивирования по C71, где питательное вещество представляет собой источник углерода.

C73. Способ культивирования по C72, где источник углерода представляет собой глюкозу.

C74. Способ культивирования по любому из C71-C73, где культивированные бактерии имеют плотность клеток, по меньшей мере, 9,0.

C75. Способ культивирования по любому из C71-C74, где культивированные бактерии имеют концентрацию полисахарида, по меньшей мере, приблизительно 250 мг/л.

C76. Способ культивирования по любому из C71-C75, где бактерии, производящие полисахариды, выбраны из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, и Enterococcus faecalis.

C77. Способ культивирования бактерий, производящих полисахариды, включающий a) добавление среды по любому из C1-C70 в биореактор, b) засев среды бактериями, производящими полисахариды, и c) культивирование бактерий путем перфузии, где культивирование включает (i) удаление использованной среды из культуры, (ii) добавление свежей среды, и (iii) сохранение бактерий.

C78. Способ культивирования по C77, где скорость перфузии составляет приблизительно от 0,07 VVH до приблизительно 2,00 VVH.

C79. Способ культивирования по C78, где скорость перфузии составляет приблизительно от 0,67 VVH до приблизительно 1,33 VVH.

C80. Способ культивирования по C79, где скорость перфузии составляет приблизительно 1,20 VVH.

C81. Способ культивирования по C77, где скорость перфузии варьирует.

C82. Способ культивирования по C81, где перфузия начинаетсяя с первой скоростью, и скорость повышается до второй скорости.

C83. Способ культивирования по C81, где перфузия начинаетсяя с первой скоростью, и скорость снижается до второй скорости.

C84. Способ культивирования по любому из C77-C83, где длительность перфузии составляет приблизительно от 1 часа и приблизительно до 15 часов.

C85. Способ культивирования по C84, где длительность перфузии составляет приблизительно от 1 часа и приблизительно до 10 часов.

C86. Способ культивирования по C85, где длительность перфузии составляет приблизительно 7 часов.

C87. Способ культивирования по любому из C77-C86, где рост клеток культивированных бактерий, по меньшей мере, в два раза больше, чем рост клеток в системе с периодической ферментацией.

C88. Способ культивирования по любому из C77-C87, где культивированные бактерии достигают плотности клеток, по меньшей мере, 20,0.

C89. Способ культивирования по любому из C77-C88, где культивированные бактерии достигают концентрации полисахарида, по меньшей мере, приблизительно 600 мг/л.

C90. Способ культивирования по любому из C77-C89, где, бактерии, производящие полисахариды, выбраны из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecium, и Enterococcus faecalis.

1. Полисахарид-продуцирующая бактериальная среда для культивирования Streptococcus pneumoniae или Streptococcus agalactiae, где указанная среда содержит:

общую концентрацию аминокислоты по меньшей мере 60 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток;

общую концентрацию глицина от 1,5 мМ и 60 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток;

общую концентрацию хлорида калия от 0,3 до 24 г/л;

и источник глюкозы;

где указанная общая концентрация аминокислоты содержит аминокислоту, выбранную из аргинина, аспарагина, цистеина, глутамина, глицина, серина и тирозина.

2. Среда по п. 1, где концентрация глюкозы составляет от 25 г/л до 100 г/л.

3. Среда по п. 2, где концентрация глюкозы составляет от 50 г/л до 90 г/л.

4. Среда по п. 3, где концентрация глюкозы составляет 80 г/л.

5. Среда по п. 1, где среда дополнительно содержит фосфат-содержащий ингредиент.

6. Среда по п. 5, где фосфат-содержащий ингредиент представляет собой Na₂HPO₄, K₂HPO₄ или KH₂PO₄.

7. Среда по п. 1, где среда содержит общую концентрацию аргинина от 1,0 мМ и до 30,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

8. Среда по п. 7, где общая концентрация аргинина составляет от 1,0 мМ и до 20,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

9. Среда по п. 8, где общая концентрация аргинина составляет 4,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

10. Среда по п. 1, где среда содержит общую концентрацию цистеина от 0,1 мМ и до 5,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

11. Среда по п. 10, где общая концентрация цистеина составляет от 0,1 мМ и до 3,5 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

12. Среда по п. 11, где общая концентрация цистеина составляет 0,4 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

13. Среда по п. 1, где среда содержит общую концентрацию серина от 5,0 мМ и до 75,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

14. Среда по п. 13, где общая концентрация серина составляет от 5,0 мМ и до 15,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

15. Среда по п. 14, где общая концентрация серина составляет 7,5 мМ, или 10 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

16. Среда по п. 1, где среда содержит общую концентрацию глутамина от 1,0 мМ и до 30,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

17. Среда по п. 16, где общая концентрация глутамина составляет от 1,0 мМ и до 20,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

18. Среда по п. 17, где общая концентрация глутамина составляет 4,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

19. Среда по п. 1, где среда содержит общую концентрацию тирозина от 0,1 мМ и до 5,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

20. Среда по п. 19, где общая концентрация тирозина составляет от 1,0 мМ и до 3,5 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

21. Среда по п. 20, где общая концентрация тирозина составляет 2,9 мМ или до 3,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

22. Среда по п. 1, где среда содержит общую концентрацию аспарагина от 5,0 мМ и до 50,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

23. Среда по п. 22, где общая концентрация аспарагина составляет от 10,0 мМ и до 30,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

24. Среда по п. 23, где общая концентрация аспарагина составляет 20,0 мМ из расчета на 1 л среды культуры клеток.

25. Среда по п. 1, где общая концентрация глюкозы составляет от 25 г/л и до 80 г/л.

26. Среда по п. 25, где общая концентрация глюкозы составляет 50 г/л.

27. Среда по п. 1, где среда дополнительно содержит бикарбонат натрия в концентрации от 0,1 г/л до 20 г/л.

28. Среда по п. 1, где среда дополнительно содержит экстракт дрожжей, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого аутолизата, ультрафильтрованного экстракта дрожжей или синтетического экстракта дрожжей.

29. Среда по п. 28, где концентрация экстракта дрожжей составляет от 1 г/л до 50 г/л.

30. Среда по п. 1, где среда содержит, по меньшей мере, 60 мМ аминокислот из расчета на 1 л среды культуры клеток, от 5,0 мМ и до 15,0 мМ глицина из расчета на 1 л среды культуры клеток, от 0,3 г/л и до 1,25 г/л хлорида калия, от 25 г/л и до 80 г/л глюкозы, и от 5 г/л до 25 г/л экстракта дрожжей.

31. Среда по п. 30, где среда содержит, по меньшей мере, 60 мМ аминокислот из расчета на 1 л среды культуры клеток, 7,5 мМ глицина из расчета на 1 л среды культуры клеток, 0,9 г/л хлорида калия, 50 г/л глюкозы, и до 10 г/л ультрафильтрованного экстракта дрожжей.

32. Способ культивирования бактерий, производящих полисахариды, выбранных из Streptococcus pneumoniae и Streptococcus agalactiae, включающий a) добавление среды по любому из пп. 1-31 в биореактор, b) засев среды бактериями, производящими полисахариды, и c) культивирование бактерий путем ферментации, где глюкозу добавляют в течение стадии культивирования.

33. Способ культивирования по п. 32, где культивированные бактерии имеют плотность клеток, по меньшей мере, 9,0 при измерении оптической плотности (OD) при 600 нм.

34. Способ культивирования по п. 32, где культивированные бактерии имеют концентрацию полисахарида, по меньшей мере, 250 мг/л.

Изобретение относится к биотехнологии, растениеводству. Предложена технология производства жидкого комбинированного биопрепарата на основе штаммов бактерий рода Bacillus, включающая раздельное, единовременное культивирование штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-13494 и Bacillus megaterium var.

Штамм mycobacterium tuberculosis bn для моделирования латентной туберкулезной инфекции // 2760751

Изобретение относится к аттенуированным микобактериям туберкулеза. Штамм Mycobacterium tuberculosis BN депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» с присвоенным номером B-9359 и может быть использован для моделирования латентной туберкулезной инфекции и разработки противотуберкулезной вакцины.

Штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного белка il-29 // 2760585

Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pet302-NT-His-hIFN-λ1 для экспрессии в клетках E. coli рекомбинантного белка интерферона hIFN-λ1, имеющего последовательность SEQ ID NO:3.

Вариант белка-рецептора цамф и способ получения l-аминокислоты с использованием этого варианта // 2760536

Группа изобретений относится к белку-рецептору цАМФ и его использованию для получения L-аминокислоты. Предложен белок-рецептор цАМФ, который является регулятором транскрипции и в котором аминокислота в позиции 35 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена на аланин.

Питательная среда для культивирования лактобактерий // 2759305

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству. Питательная среда для культивирования микроорганизмов рода Lactobacillus содержит мелассу свекловичную, мелассу кукурузную, K2НРО4, дрожжевой экстракт, пектин яблочный, микроорганизмы рода Lactobacillus и воду в заданном соотношении.

Добавка, содержащая препарат с пробиотической активностью и органические кислоты, к корму для сельскохозяйственных животных и птицы // 2759225

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Добавка содержит лимонную кислоту, молочную кислоту, формиат калия, формиат кальция, штамм бактерий Bacillus mucilaginosus В-4901 и штамм бактерий Bacillus subtilis 1-85 в заданных количествах.

Способ криоконсервации вегетативного посевного материала micromonospora purpurea var. violacea штамма 7r продуцента гентамицина // 2758857

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве гентамицина-антибиотика аминогликозидного ряда с широким спектром действия, как препарат выбора для экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекций. Способ предусматривает приготовление, стерилизацию защитной среды (сахарозо-желатиновой или 0,5% водного раствора бетаина гидрохлорида) и проверку ее на стерильность; выращивание вегетативного посевного материала (ВПМ) Micromonospora purpurea var.

Способ получения коллагенолитического фермента // 2758788

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения коллагенолитического фермента, включающий культивирование базидиальных грибов видов Correna unicolor, Ganoderma lucidum, Trametes ochracea, Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus, Hypsizygus ulmarius, Lentinus edodes, Funalia trogii, Fomes fomentarius или Coprinus lagopides на жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 6,0-10,0 г/л лактозы или 10-15 г/л сухой молочной сыворотки, содержащей 70% лактозы, а в качестве источника азота - 1,5-5,0 г/л мочевины, с последующим отделением мицелия фильтрацией, концентрирования нативного раствора с помощью ультрафильтрации, лиофильной сушки.

Рекомбинантный белок gm, обладающий способностью связывать α2-макроглобулин и его применение в качестве лиганда в аффинной хроматографии для выделения α2-макроглобулина из сыворотки крови человека // 2758604

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным связывающим α2-макроглобулин (α2-М) белкам, и может быть использовано для выделения α2-макроглобулина (α2-М) из плазмы крови человека аффинной хроматографией. Получен рекомбинантный полипептид GM из штамма стрептококка группы G - G4223, способный связывать α2-М, IgG и ЧСА, а также кодирующая его ДНК pGM, рекомбинантная плазмидная ДНК pQE 31-pGM и штамм-продуцент E.coli M15-GM, позволяющий экспрессировать рекомбинантный полипептид GM.

Бактерия lactobacillus rhamnosus для лечения, например, бактериального вагиноза // 2758109

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии, пищевой промышленности и медицины. Описан новый штамм молочнокислой бактерии Lactobacillus rhamnosus для продуцирования молочной кислоты с регистрационным номером CECT 8800.

Биосинтетический гепарин // 2760706

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения предшественников для получения синтетического гепарина в лабораторных условиях, что может быть применимо в медицине. В настоящем изобретении предложен новый подход к получению синтетического гепарина, который может быть биоэквивалентен свиному гепарину натрия USP, из гепаросана через последовательное получение трех промежуточных соединений – гликозаминогликанов с различным содержанием сульфатированных групп (NS-, NS2S-, NS6S- и/или NS2S6S-групп) в своем составе.