Вакцина против eimeria с улучшенной эффективностью

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к композиции, содержащий живые ооцисты Eimeria и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция отличается тем, что содержит агонист TLR3. Композицию можно использовать для получения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза. Вакцину можно наносить, например, в форме крупнокапельной струи на цыплят в возрасте одни сутки. Агонист TLR3 в вакцине позволяет уменьшение дозы ооцист Eimeria вплоть до 4 раз, в то же время получая такой же уровень защиты против заражения, как для вакцины без агониста TLR3. Альтернативно, при использовании общепринятой дозы ооцист Eimeria в вакцине, агонист TLR3 вызывает более раннее начало иммунитета, что приводит к значительному уменьшению оценки в баллах очагов в кишечнике после заражения, уже через 2 вместо 3 недель после вакцинации. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной паразитологии и вакцинологии; более конкретно, изобретение относится к композиции, содержащий живые ооцисты Eimeria и фармацевтически приемлемый носитель, к способу получения композиции, к медицинским применениям композиции в вакцине для домашней птицы против кокцидиоза, и к способам и применениям для вакцин.

Eimeria представляют собой простейших паразитов из филюма Apicomplexa и класса Coccidia, и встречаются по всему миру. При инфекции хозяина, они вызывают комплексное заболевание кишечника, называемое: кокцидиоз. Eimeria имеют сложный жизненный цикл со множеством стадий, где некоторые развиваются вне хозяина. Инфекция Eimeria возникает при проглатывании спорулирующих ооцист и может возникать с первых суток жизни. Затем в кишечнике высвобождаются спорозоиты, которые затем колонизируют участок кишечника хозяина, посредством инвазии эпителиальных клеток кишечника. Репликация приводит к высвобождению на стадиях мерозоитов и разрушению эпителиальных клеток кишечника хозяина. Затем мерозоиты повторно инфицируют дальнейшие эпителиальные клетки, и это продолжается в течение вплоть до четырех следующих циклов по 4-6 суток. Наконец, развиваются половые стадии, образующие ооцисты, которые высвобождаются с фекалиями. После споруляции в окружающей среде цикл начинается снова (Shirley et al., 2005, Adv. in Paras., vol. 60, p. 285).

Симптомы инфекции Eimeria у домашней птицы меняются от потери аппетита, до энтерита и кровавой диареи, до функциональной недостаточности органов из-за образования некротической ткани в кишечнике, и даже до смертности. Последствиями являются падение коэффициента усвоения корма, уменьшение скорости роста, уменьшение производства яиц и чувствительность к вторичным инфекциям; все это вызывает серьезный дискомфорт у пораженных птиц и серьезный экономический ущерб для коммерческих операций с домашней птицей. Обзор кокцидиоза у домашней птицы, см. в руководствах, таких как: «The Merck veterinary manual» (10^th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), или: Swayne et al., eds.: «Diseases of Poultry», 13th ed., Wiley-Blackwell, Ames, IA., USA.

Уменьшение инфекции Eimeria и кокцидиоза можно получать посредством введения антикокцидных лекарственных средств (кокцидиостатиков) через питание, однако возникновение устойчивости и присутствие остатков лекарственного средства в продуктах животного происхождения вызывают постоянные опасения. Таким образом, с инфекцией Eimeria и ассоциированными признаками заболевания у домашней птицы, предпочтительно, борются посредством вакцинации. Поскольку не существует эффективных субъединичных или основанных на рекомбинантной ДНК на основе Eimeria вакцин, большинство используемых для домашней птицы вакцин представляют собой живые вакцины, содержащие спорулирующие ооцисты из одного или нескольких видов Eimeria. Их естественное воспроизведение в кишечнике птиц индуцирует сильный иммунитет, посредством как гуморальных, так и клеточных путей иммунной системы. Полного иммунитета обычно достигают через приблизительно 3 недели после вакцинации. Однократная вакцинация живыми ооцистами в раннем возрасте - с помощью случайных позднейших бустер-инфекций дикого типа - является достаточной для защиты птиц в течение срока их жизни.

Ооцисты живой вакцины могут принадлежать к дикому типу или ослабленному патотипу. Конкретным классом ослабленных Eimeria являются так называемые штаммы с преждевременным развитием. Такие ослабленные штаммы образуют более низкий уровень выхода ооцист и/или меньший уровень повреждения кишечника вакцинированной мишени.

Эффективность вакцины против Eimeria обычно определяют посредством оценки основных критериев инфекции и заболевания после заражения посредством инфекции вирулентным штаммом Eimeria: оценки в баллах очагов в кишечнике, прироста живой массы тела и выхода ооцист. Статья, описывающая важность этих критериев для оценки эффективности вакцины против Eimeria, представляет собой: Williams & Catchpole, (2000, Vaccine, vol. 18, p. 1178-1185).

Как правило, живая птичья вакцина против Eimeria содержит спорулирующие ооцисты из нескольких видов Eimeria, поскольку иммунитет является видоспецифическим. А также различные виды Eimeria инфицируют различные виды домашней птицы, например, кур и индеек. Примерами некоторых коммерческих вакцин против кокцидиоза для домашней птицы являются: Coccivac™, Paracox™ или Fortegra™ (все из MSD Animal Health); Immucox™ (Ceva); и Inovocox™ (Huvepharma).

Такие вакцины обычно вводят способом массовой вакцинации для уменьшения стоимости, например, посредством распыления на птиц или на корм, или через питьевую воду. Поскольку риск полевой инфекции существует с первых суток жизни, таким образом, вакцинацию предпочтительно проводят для птиц, настолько молодых, насколько возможно. Это можно удобным образом осуществлять посредством введения распылением в инкубаторе, когда цыплята только вылупились, и их содержат на открытых поддонах. Этим способом достигают тел птиц, так же как их непосредственного окружения. Затем птицы употребляют вакцину внутрь пероральным, интраназальным и/или внутриглазным путем из-за их тенденции склевывать капельки и чистить свои перья. Для улучшения поглощения распыленной вакцины, ее видимость обычно увеличивают посредством добавления яркой окраски.

В Европейской патентной заявке no. EP 15203012 описана вакцина на основе геля против Eimeria, которую можно вводить птицам посредством опрыскивания. Гель имеет вязкость между приблизительно 200 и приблизительно 4000 мПа.с, которую обеспечивают посредством ксантановой смолы. Можно использовать стандартное оборудование для вакцинации распылением, благодаря свойствам псевдопластичности ксантановой смолы. Таким образом, можно получать бусины из геля размером, который является привлекательным для склевывания птицами. Это приводит к улучшенному поглощению вакцины по сравнению с предшествующими вакцинами для распыления против Eimeria, и быстрому развитию иммунитета.

Основным проблемным моментом в коммерческой и крупномасштабной продукции вакцин из живых ооцист Eimeria является собственно получение ооцист Eimeria: поскольку в настоящее время является невозможным культивирование всех стадий развития Eimeria in vitro, таким образом, ооцисты Eimeria необходимо получать в донорах-хозяевах из числа домашней птицы и выделять из их фекалий. Затем ооцисты Eimeria очищают, обеспечивают споруляцию и составляют в вакцину. Кроме того, из-за отсутствия эффективной перекрестной защиты, может являться необходимым получение 14 различных видов Eimeria, важных для ветеринарии, от птиц-доноров.

Это является таким трудоемким и затратным способом получения вакцины, что до настоящего времени коммерческое получение не может удовлетворить необходимость этих вакцин на рынке. Следовательно, существует необходимость с экономической - так же как с этической точки зрения, для максимизации эффективности таких труднодоступных вакцин из живых ооцист Eimeria.

Иммунные ответы можно усиливать посредством использования адъюванта. Он может представлять собой отдельную молекулу или комплексную композицию, и может стимулировать иммунный ответ мишени специфическим или неспецифическим образом. Как правило, адъюванты используют с инактивированными или субъединичными вакцинами, поскольку они являются малоэффективными без такой иммуностимуляции, но только редко - с вакциной из способного к воспроизведению микроорганизма.

Среди множества возможных адъювантов, иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды являются одной из возможностей. В первых сообщениях описано использование неметилированных CpG-мотивов, присутствующих в бактериальной ДНК, в Krieg et al. (1995, Nature, vol. 374, p. 546). В последующие два десятилетия выявлен лежащий в основе механизм в качестве способа сенсибилизации и ответа на инвазию микроорганизма, посредством узнавания консервативных структурных мотивов, так называемых ассоциированных с патогеном молекулярных паттернов (PAMP), существующих, например, в геномном материале инвазивных микроорганизмов. Для этой цели, врожденная иммунная система использует узнающие специфические паттерны рецепторы, такие как Toll-подобные рецепторы (TLR).

TLR представляют собой трансмембранные гликопротеины типа I, и связывание с агонистическим лигандом приводит к каскаду передачи сигналов в клетках, приводящему к экспрессии интерферонов типа 1 и провоспалительных цитокинов (интерлейкинов и фактора некроза опухолей альфа). Кроме того, это является основой для стимуляции вторичного, приобретенного иммунного ответа. (Kawai & Akira, 2010, Nature Immunol., vol. 11, p. 373).

У кур использование агонистов TLR исследовали по их способности действовать в качестве адъюванта и стимулировать иммунитет против различных микроорганизмов, в основном, вирусов (St. Paul et al., 2013, Vet Imm. & Imm. pathol., vol. 152, p. 191-199; Gupta et al., 2014, Expert Rev. Vaccines, vol. 13, p. 909-925). Однако результаты являются, в лучшем случае, изменчивыми, и ни один отдельный агонист TLR не выделяется преимущественным образом.

У млекопитающих, так же как у птиц, TLR3 предназначен для детекции репликации вируса, посредством детекции промежуточного соединения: двухцепочечной РНК. Обзор этого приведен в Chen et al. (2013, Vet. Research, vol. 44, p. 82). На практике, синтетическую дцРНК, или аналог, можно использовать в качестве агониста TLR3, например, димерный гомополимер полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (поли-I:C) или полиадениловой-полиуридиловой кислоты (поли-A:U). Как поли-I:C, так и поли-A:U, исследовали по их эффекту во множестве моделей инфекции и даже в иммунологии злокачественных опухолей. Например: в EP 344808 описана вакцина против кокцидиоза из рекомбинантного белка Eimeria, где поли-I:C упомянут в качестве потенциального адъюванта. Однако в ее примерах используют антиген 65 кДа в полном адъюванте Фрейнда, или экспрессированный с вектора на основе вируса осповакцины.

В WO 2015/042369 описана вакцина в масляной эмульсии, содержащая поли-I:C и рекомбинантный антиген из Clostridium perfringens, для защиты против инфекции Eimeria maxima.

Коммерческая вакцина Evalon™ (Hipra), представляет собой вакцину из живых ооцист Eimeria для распыления, снабженную в качестве адъюванта масляной суспензией, содержащей минеральное масло монтанид™.

Следовательно, в данной области не существует описания или предположения использования агониста TLR3 с живыми ооцистами Eimeria.

Sumners et al. (2011, Exp. Parasitol., vol. 127, p. 714-718) исследовали изменения профиля экспрессии ряда TLR и противомикробных пептидов у кур в результате инфекции E. praecox. Обнаруженные результаты были изменчивыми и для Ch TLR3 были несогласованными, поскольку присутствовала повышающая регуляция в одном эксперименте, но понижающая регуляция в другом, где использовали более высокую инфекционную дозу. В Sumner предложено включать E. praecox в качестве компонента вакцины, но не выдвинуто предложений использования какого-либо конкретного фактора в качестве адъюванта.

Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление недостатков предшествующего уровня техники и удовлетворение необходимости в данной области посредством предоставления более эффективной вакцины против Eimeria.

Неожиданно обнаружено, что этой цели можно достигнуть, и следовательно, один или несколько недостатков предшествующего уровня техники можно преодолеть, посредством добавления ксантановой смолы и агониста TLR3 в композицию, содержащую живые ооцисты Eimeria. Затем эту композицию можно использовать для получения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза; вакцину можно вводить посредством распыления, и ее затем употребляет внутрь домашняя птица.

В полученной вакцине, агонист TLR3 может позволять уменьшение дозы ооцист Eimeria вплоть до 4 раз, в то же время получая такой же уровень защиты против заражения, как для вакцины без агониста TLR3. Альтернативно, при использовании общепринятой дозы ооцист Eimeria в вакцине, агонист TLR3 вызывает более раннее начало иммунитета, приводящее к значительному уменьшению оценки в баллах очагов в кишечнике после заражения, уже через 2 вместо 3 недель после вакцинации. Оба этих эффекта являются очень значимыми экономически.

Это являлось не полностью однозначным, поскольку авторы изобретения не воспользовались возможностью выбора способа сделать вакцинацию против Eimeria более эффективной: выбор добавления адъюванта был только одной возможностью среди альтернатив, таких как улучшение состава как такового, или дозы, способа или пути введения, и т.д. А также, адъювант не является обычным ингредиентом живой вакцины. Кроме того, при выборе подходящего и эффективного адъюванта из множества возможных для принятия во внимание адъювантов, конкретно, для использования для домашней птицы, PAMP не были наиболее многообещающими кандидатами. И наконец, при выборе из возможных PAMP, агонист TLR является только одной из многих возможностей, и снова, TLR3 является только одним из множества TLR для выбора, и определенно, не тем, который выделяется доказанной эффективностью.

Авторы изобретения были, таким образом, удивлены, обнаружив, что агонист TLR3 являлся настолько успешным для этого типа вакцины. Например, не существовало информации об иммуностимуляции против живого воспроизводящегося паразита, и особенно, информации о стимуляции иммунитета в кишечнике посредством агониста TLR3. Обнаружено, что эта стимуляция является эффективной для живого и воспроизводящегося паразита Eimeria. Кроме того, было очень неожиданным, что агонист TLR3 мог вообще перенести употребление внутрь пероральным путем и прохождение через кишечный тракт.

Несмотря на то, что авторы изобретения не желают быть связанными какой-либо теорией или моделью, которая может объяснить эти обнаружения, они выдвинули предположение, что агонист TLR3 является способным стимулировать иммунный ответ кишечника против воспроизводящегося Eimeria. Это, возможно, приводит к более раннему и/или более сильному ответу на вакцинацию. В полученной вакцине, ксантановая смола облегчает формирование капелек из вакцины после введения распылением, и после проглатывания этих гелевых капелек, ксантановая смола может быть вовлечена в защиту агониста TLR3 в ходе доставки в кишечник.

Это также было неожиданным, поскольку предшествующие исследования с использованием агонистов TLR3 в качестве адъюванта показали, что их невозможно вводить пероральным способом. Таким образом, даже при рассмотрении использования агониста TLR3 в качестве адъюванта для вакцины, не было указаний, можно ли и как можно доставлять его в соответствующий участок действия: кишечник птицы, в сочетании с пероральной вакциной.

Фактически, условия внутри кишечного тракта, совместно с кислой средой желудка, могут благоприятствовать быстрому гидролизу любой формы РНК. Это только усугубляется присутствием РНКаз, как местных, так и секретированных или высвобожденных бактериями микробиома кишечника. Любая голая РНК или аналог РНК, такие как используемые по настоящему изобретению, таким образом, подвержены немедленной деградации, быстрее, чем достижение необходимого участка действия. Это описано также в Zhou et al. (2007, J. of Immunol., vol. 178, p. 4548-4556), где обнаружено, что повреждения слизистой оболочки, наблюдаемого после внутрибрюшинного введения дцРНК, возникающего в результате активации TLR-3, не наблюдали после перорального введения дцРНК.

Подобным образом, в Lantier et al. (2014, J. of Inf. Dis., vol. 209, p. 457-467) описано, что введение поли-I:C помогало индукции защиты мышей от Cryptosporidium parvum. Это присутствовало, однако, только при введении i.p. способом, поскольку для перорального введения не удалось показать какого-либо поддающегося измерению ответа.

Как Zhou, так и Lantier предполагают, что этот эффект обусловлен деградацией РНК или аналога.

Следовательно, авторы изобретения обнаружили способ доставки иммунологически активных количеств агониста TLR3 в участок действия в кишечнике птицы-мишени, с использованием в то же время только относительно низких концентраций агониста, посредством введения агониста TLR3 в пероральную вакцину, содержащую ксантановую смолу.

Таким образом, обнаружено, что комбинация с ксантановой смолой защищает аналог дцРНК, так что его можно в настоящее время вводить пероральным способом, в относительно низких концентрациях, и все еще индуцировать в кишечнике птицы клиническое улучшение защитного ответа, полученного после пероральной вакцинации домашней птицы против Eimeria.

Таким образом в одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей живые ооцисты Eimeria и фармацевтически приемлемый носитель, отличающейся тем, что композиция содержит между приблизительно 0,3 и приблизительно 5% масс./об. ксантановой смолы и агонист TLR3.

Композицию по изобретению можно использовать для получения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза. Детали и предпочтения для вакцины против кокцидиоза, ее изготовления и ее применения, описаны в настоящем описании ниже.

Термин «содержащий» (так же, как варианты, такие как «содержать», «содержит» и «содержащийся»), в рамках изобретения, предназначен для обозначения всех элементов, и в любой возможной комбинации, допустимой по изобретению, охваченной или включенной в раздел, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д., в которых использован этот термин, даже если такие элементы или комбинации не перечислены в явной форме; а не для исключения какого-либо из таких элемента (элементов) или комбинаций.

Таким образом, любой такой раздел, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д., может, таким образом, относиться к одному или нескольким варианту (вариантам) осуществления, где термин «содержащий» (или его варианты) заменены такими терминами, как «состоит из», «состоящий из» или «состоит в основном из».

«Ооцисты» являются хорошо известными микроорганизмами, представляющими собой одну из стадий жизненного цикла апикомплексного паразита, такого как Eimeria.

Ооцисты являются «живыми», когда они являются способными инициировать цикл воспроизведения Eimeria в подходящих условиях, таких как кишечник птицы.

«Eimeria» хорошо известен в данной области как паразит, принадлежащий к семейству Eimeriidae. Эти паразиты и индуцируемые ими заболевания описаны в хорошо известных руководствах (выше). Eimeria проявляет характерные признаки членов своей таксономической группы, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, так же как биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патологическое поведение.

Как известно в данной области, классификация микроорганизма как конкретного «вида» основана на комбинации таких признаков. Изобретение, таким образом, включает также Eimeria, подклассифицированные из них каким-либо образом, например, такие как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип или подгруппа и т.п.

Eimeria по изобретению могут воспроизводиться в видах домашней птицы, и включают, например, виды Eimeria: E. acervulina, E. tenella, E. maxima, E. brunetti, E. mitis, E. mivati, E. necatrix, E. praecox, E. hagani, E. meleagrimitis (типа 1 или типа 2), E. adenoides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua, E. subrotunda или E. meleagridis.

Специалисту в данной области очевидно, что в то время как конкретный Eimeria по изобретению можно в настоящее время приписать конкретному виду и роду, это представляет собой таксономическую классификацию, которая может измениться со временем, поскольку новые открытия могут привести к переклассификации в новую или отличную таксономическую группу. Однако, поскольку это не изменяет собственно микроорганизм или его антигенный репертуар, но только его научное наименование или классификацию, такие переклассифицированные микроорганизмы остаются в объеме изобретения.

Паразитов Eimeria для использования по изобретению можно получать из множества источников, например, таких как полевой изолят из места содержания домашней птицы, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов.

«Фармацевтически приемлемый носитель» представляет собой водную жидкость высокой степени чистоты и, предпочтительно, стерильную, например: воду, физиологический солевой раствор или раствор фосфатно-солевого буфера. Носитель может содержать дополнительные наполнители, такие как стабилизаторы или консерванты.

«Ксантановая смола» представляет собой хорошо известный высокомолекулярный полисахарид, CAS номер 11138-66-2, и, как правило, является коммерчески доступной, в нескольких видах квалификации и чистоты, например, как Keltrol™, Xantural™ или Kelzan™, из CP Kelco. Детали и свойства ксантановой смолы описаны, например, в «Xanthan book», 8^th ed., 2008, cpkelco.com.

В рамках изобретения, «приблизительно» показывает, что количество может меняться между±25% около его указанного значения.

В рамках изобретения, «% масс./об.» относится к проценту в единицах массы на объем. Для этого аспекта изобретения, это относится к объему композиции по изобретению.

«Агонист TLR3» представляет собой любое соединение или вещество, которое может активировать TLR3 (toll-подобный рецептор, типа 3), т.е. которое может индуцировать событие передачи сигнала, опосредованное путем передачи сигнала TLR. В этом смысле, агонист может представлять собой связывающую группу или лиганд, связывающиеся непосредственно с TLR3, альтернативно, активация может являться непрямой, через образование эндогенного или экзогенного лиганда.

Молекула TLR3, так же как ее активация и полученный в результате клеточный каскад, описаны в данной области. Агонистами TLR3 являются, например: природная двухцепочечная РНК (дцРНК); синтетическая дцРНК; и синтетический аналог дцРНК (см., например, Alexopoulou et al., 2001, Nature vol. 413, p. 732-738). Подходящий агонист TLR3 может активировать TLR3 избирательным образом, в том смысле, что он не активирует значительно какой-либо другой TLR.

Примерами подходящих агонистов TLR3 по изобретению являются синтетический аналог дцРНК, такой как поли-I:C, и поли-A:U, или варианты, такие как: поли-I:C12U. Синтетический аналог дцРНК может иметь модифицированный остов, например, посредством: фосфоротиоатной модификации, галогенирования, алкилирования (например, модификации этилом или метилом), и/или фосфодиэфирной модификации.

В данной области альтернативные аннотации также используют для описания этих аналогов; например

Поли-I:C также записывают как: поли-I⋅C; поли-IC; поли-I-поли-C; поли-I:поли-C и т.д. Все это входит в объем изобретения.

Как описано, ксантановая смола позволяет эффективное введение вакцины, которую можно получать из композиции по изобретению, способом массовой вакцинации, например, посредством распыления. Примером является вакцина для распыления на основе геля, как описано в EP 15203012. Для получения такой вакцины, количество ксантановой смолы в композиции может зависеть от соотношения, в котором композицию могут использовать для получения желательной вакцины.

Вакцина для распыления на основе геля, как описано в EP 15203012, содержит ксантановую смолу в количестве между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,5% масс./об. ксантановой смолы, таким образом, % масс./об. в этом случае показывает процент в единицах массы на объем вакцины.

Верхний предел количества ксантановой смолы, которое все еще поддается удобной переработке, составляет приблизительно 5% масс./об. Чтобы позволить разведение композиции по изобретению до кратности приблизительно 4, таким образом, композиция может содержать между 0,3 и 5% масс./об. (композиции) ксантановой смолы.

Предпочтительно, композиция по изобретению предназначена для использования почти в основном для получения вакцины для распыления на основе геля, такой, как описано в EP 15203012. В этом случае, собственно композиция содержит между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,5% масс./об. (композиции) ксантановой смолы.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,5% масс./об. ксантановой смолы.

В одном варианте осуществления, композиция по изобретению содержит 0,4-1,2% масс./об. (композиции) ксантановой смолы. Предпочтительно, композиция содержит 0,5-1% масс./об. ксантановой смолы, 0,5-0,9% масс./об., 0,5-0,8% масс./об., или даже 0,5-0,7% масс./об. ксантановой смолы, в таком порядке предпочтения.

В одном варианте осуществления, композиция по изобретению содержит приблизительно 0,6% масс./об. (композиции) ксантановой смолы.

Предпочтительно, «приблизительно» означает±20% около этого значения, более предпочтительно, «приблизительно» означает±15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% около этого значения, или даже «приблизительно» означает±1% около этого значения, в таком порядке предпочтения.

В сравнительных экспериментах, авторы изобретения обнаружили, что в вакцине, полученной из композиции по изобретению, поли-A:U являлся более эффективным для домашней птицы, и конкретно, для кур, при стимуляции иммунитета кишечника против Eimeria, чем поли-I:C.

Таким образом в одном варианте осуществления композиции по изобретению, агонист TLR3 представляет собой поли-A:U.

Синтетические аналоги дцРНК, такие как поли-I:C или поли-A:U, являются коммерчески доступными от поставщиков тонких химических соединений, например, в форме лиофилизированной натриевой соли из Sigma-Aldrich, CAS номер 24936-38-7.

Количество агониста TLR3, подлежащее использованию в композиции по изобретению, определяют применительно к соотношению, в котором композиция подлежит использованию для получения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза, как описано в настоящем описании, и к количеству вакцины, подлежащему введению домашней птице-мишени.

Как понятно специалисту в данной области, композицию по изобретению или ее части можно получать, поставлять на рынок или хранить в более концентрированной форме, например, концентрированной в 2, 3 или более раз. Концентрат затем разбавляют перед дальнейшим использованием, например, для изготовления вакцины для домашней птицы против кокцидиоза, как описано в настоящем описании. В этих условиях, композиция может содержать более высокие количества агониста TLR3, для достижения предпочтительного количества агониста TLR3 в полученной вакцине.

Специалист в данной области прекрасно способен оптимизировать эти количества, например, в ходе защиты против заражения, на основании оценки в баллах очагов в кишечнике.

Предпочтительно, композиция по изобретению содержит между приблизительно 5 и приблизительно 1000 микрограмм агониста TLR3 на миллилитр.

Этот диапазон позволяет разведение композиции до вакцины вплоть до кратности 4, для достижения количества агониста TLR3 в вакцине между приблизительно 5 и приблизительно 250 агониста TLR3 на миллилитр вакцины. Когда вакцину вводят при приблизительно 0,2 мл вакцины на птицу, это обеспечивает доставку между приблизительно 1 и приблизительно 50 микрограмм агониста TLR3 на дозу для животного.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, агонист TLR3 присутствует в количестве между приблизительно 5 и приблизительно 1000 микрограмм на миллилитр композиции.

Предпочтительно, композицию по изобретению используют почти в основном для получения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза. В этом случае, собственно композиция содержит между приблизительно 5 и приблизительно 250 микрограмм агониста TLR3 на миллилитр композиции.

Термин «почти в основном» относится к ситуации, когда не следует делать никаких добавок или следует добавлять только незначительные дополнительные объемы добавок для получения вакцины из композиции по изобретению; например, менее 10% от объема вакцины.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, композиция по изобретению содержит 5-250 микрограмм агониста TLR3 на миллилитр композиции.

Ооцисты для использования по изобретению можно получать в промышленном масштабе в донорных животных из числа домашней птицы, посредством выделения из их помета хорошо известными способами, такими как соляная флотация, с последующими обеспечением споруляции и стерилизацией, и наконец, с подсчетом посредством световой микроскопии. Споруляцию можно осуществлять, например, с использованием дихромата калия, и стерилизацию можно осуществлять с использованием гипохлорита натрия или бета-пропиолактона. Все это хорошо известно в данной области.

Споруляция обеспечивает быстрое развитие защитной инфекции в кишечнике домашней птицы.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, живые ооцисты Eimeria представляют собой спорулирующие ооцисты.

Для индукции эффективного уровня иммунитета кишечника, ооцисты Eimeria, выбранные для использования в вакцине, которую можно получать из композиции по изобретению, могут иметь определенный уровень вирулентности, например, принадлежать к дикому типу или являться ослабленными. В рамках изобретения, «вирулентность» относится к аспектам Eimeria, определяющим его патологию, в основном, скорость его воспроизведения, уровень разрушения, вызванного в кишечнике инфицированной птицы, эффект на скорость роста и уровень выделения с распространением в популяции. Все это можно оценивать с использованием хорошо известных способов и параметров, таких как оценки в баллах очагов в кишечнике, прирост живой массы тела, и уровни выхода ооцист.

Оценку в баллах очагов, предпочтительно, выполняют, как описано в монографии Европейской фармакопеи 2326. Кратко: при некропсии, симптомам кокцидиоза в кишечнике приписывают оценку в баллах, согласно которой, балл 0 означает отсутствие макроскопических очагов, и баллы 1-4 означают увеличение тяжести утолщения стенки кишечника, увеличение количества крови и уменьшение количества нормальных фекалий. При оценке в баллах очагов 4 могут присутствовать случаи смертности.

Специалист в данной области может оценивать, когда использовать Eimeria какого типа вирулентности; например, в условиях высокого риска полевой инфекции, штамм Eimeria более высокой вирулентности, такой как штамм дикого типа, может обеспечивать преимущества в вакцине, полученной из композиции по изобретению, вместо ослабленного.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, по меньшей мере одна из живых ооцист Eimeria происходит из ослабленного штамма Eimeria.

«Ослабленный Eimeria» определяют как вызывающий меньшие очаги в кишечнике, и/или образующий меньший выход ооцист в фекалиях вакцинированных животных, по сравнению с Eimeria того же самого вида, имеющим более высокую вирулентность; например, по меньшей мере на 10% меньшие оценку в баллах очагов в кишечнике и/или более низкий выход ооцист; более предпочтительно, по меньшей мере 20%, 30%, 40%, или даже по меньшей мере на 50% меньшие оценку в баллах очагов в кишечнике, и/или более низкий выход ооцист, в таком порядке предпочтения.

Ослабление Eimeria можно получать in vitro, например, посредством пассирования через экспериментальных животных и отбора, или посредством технологии рекомбинантной ДНК, все хорошо известно в данной области.

Одной из форм ослабленных Eimeria являются Eimeria с преждевременным развитием.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению, по меньшей мере один из ослабленных Eimeria имеет преждевременное развитие.

Штаммы Eimeria «с преждевременным развитием» представляют собой штаммы, которые - по сравнению с их эквивалентом дикого типа - завершают свой полный жизненный цикл в животном-мишени с меньшим количеством циклов неполового воспроизведения. Например, 3 или 4 цикла вместо обычных 4 или 5 циклов для штамма дикого типа такого же вида. Это обеспечивает им ослабленную вирулентность.

В одном варианте осуществления композиции по изобретению, по меньшей мере один из живых ооцист Eimeria происходит из штамма Eimeria дикого типа.

В рамках изобретения «дикий тип» относится к Eimeria, который не был ослаблен in vitro и который не имеет преждевременного развития. Штаммы дикого типа можно, например, выделять из инфицированной домашней птицы в природе или из мест содержания домашней птицы, не вакцинированных против Eimeria.

В предпочтительном варианте осуществления, композиция по изобретению содержит живые ооцисты Eimeria, которые являются ослабленными, и живые ооцисты Eimeria, которые имеют вирулентность дикого типа.

Композиция по изобретению может содержать ооцисты по меньшей мере из одного вида Eimeria. Предпочтительно, композиция может содержать ооцисты Eimeria из более чем одного вида, чтобы позволять изготовление вакцины, обеспечивающей широкую иммунную защиту. Кроме того, композиция может содержать более одного штамма из конкретного вида Eimeria, для обеспечения даже более широкой иммунной защиты.

В одном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит живые ооцисты Eimeria из более, чем одного вида.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит живые ооцисты Eimeria из более чем одного штамма из одного и того же вида.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит живые ооцисты Eimeria из более чем одного вида, и ооцисты из по меньшей мере одного из этих видов содержат живые ооцисты Eimeria из более, чем одного штамма из этого вида.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит живые ооцисты Eimeria из более чем одного штамма из одного и того же вида, при этом по меньшей мере один из этих штаммов является ослабленным, и по меньшей мере один из этих штаммов имеет вирулентность дикого типа.

В одном варианте осуществления композиции по изобретению, живые ооцисты Eimeria представляют собой одну или несколько, выбранных из группы, состоящей из: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. brunetti, E. praecox, E. mivati, E. hagani, E. meleagrimitis 1, E. meleagrimitis 2, E. adenoeides, E. gallopavonis и E. dispersa.

Эти различные виды Eimeria можно идентифицировать и дифференцировать рядом способов, хорошо известных в данной области. Классическим способом является оценка размера и внешнего вида их ооцист посредством световой микроскопии. Альтернативами являются, например, классификация посредством серологических маркеров, или посредством ПЦР. А также, при тестировании in vivo, различные виды Eimeria характерным образом колонизируют различные области кишечного тракта птиц.

В предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению содержит живые ооцисты из того же самого вида Eimeria, который присутствует в существующих коммерческих вакцинах из живых ооцист Eimeria. Более предпочтительно: те же самые виды и штаммы ооцист, что и в одной или нескольких из коммерческих вакцин против Eimeria: Coccivac, Paracox и Fortegra.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению живые ооцисты Eimeria происходят из 4 видов Eimeria: E. acervulina, E. maxima, E. mitis и E. tenella, в результате чего присутствуют 2 штамма E. maxima.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению живые ооцисты Eimeria происходят из 4 видов Eimeria: E. acervulina, E. maxima, E. mivati и E. tenella, в результате чего присутствуют 2 штамма E. maxima.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению живые ооцисты Eimeria происходят из 7 видов Eimeria: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox и E. tenella, в результате чего присутствуют 2 штамма E. maxima

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению живые ооцисты Eimeria происходят из 6 видов Eimeria: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mivati, E. necatrix и E. tenella.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению живые ооцисты Eimeria происходят из 4 видов Eimeria: E. acervulina, E. maxima, E. mivati и E. tenella, в результате чего присутствуют 2 штамма E. maxima.

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению живые ооцисты Eimeria происходят из 5 видов Eimeria: E. adenoeides, E. dispersa, E. gallopavonis, E. meleagrimitis 1 и E. meleagrimitis 2.

Количества живых ооцист Eimeria, подлежащих использованию в композиции по изобретению, может легко определять специалист в данной области, на основании: соотношения, в котором композиция должна содержаться в вакцине для домашней птицы против кокцидиоза; объема вакцины на домашнюю птицу-мишень; и желательной эффективности вакцинации.

Одним показателем может являться количество живых ооцист Eimeria, используемых в коммерческих вакцинах, которые были доступны в течение длительного времени. Как правило, количество используемых ооцист отличается для каждого из видов Eimeria. Например, Paracox 5 содержит на дозу для животного: приблизительно 500 ооцист E. acervulina, приблизительно 100 и приблизительно 200 ооцист двух штаммов E. maxima, соответственно, приблизительно, 1000 ооцист E. mitis и приблизительно 500 ооцист E. tenella.

При получении композиции по изобретению, ее различные ингредиенты можно комбинировать в порядке, который является удобным, например, с точки зрения эффективности производства. Например, может обеспечивать преимущества стерилизация конкретных растворов, используемых в качестве компонентов композиции; разумеется, такие растворы в это время еще не содержат живые ооцисты.

Такую стерилизацию можно проводить различными способами, например, химически, например, с использованием бета- пропиолактона; или физически, например, посредством облучения или микрофильтрации. Однако, когда стерилизацию раствора, содержащего ксантановую смолу, следует проводить посредством нагревания, является необходимым стабилизировать ксантановую смолу посредством добавления некоторого количества соли металла. Без соли, термическая обработка может нарушить способность ксантановой смолы к обеспечению желательной вязкости.

Как описано в EP 15203012, количество соли ограничивают двумя способами: снизу оно ограничено приблизительно 0,1% масс./об. (композиции) соли металла, что является минимальным количеством, необходимым для стабилизации минимального количества ксантановой смолы. Сверху количество соли ограничено приблизительно 0,4% масс./об. (вакцины), вкусовой привлекательностью целевой вакцины, подлежащей получению из композиции по изобретению. В этом случае вкус является важным, поскольку домашняя птица-мишень должна хотеть проглатывать вакцину.

Фактически, это означает, при объединении этих пределов, и обеспечении разведения композиции по изобретению вплоть до кратности 4, что композиция может содержать между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6% масс./об. (композиции) соли металла.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6% масс./об. соли металла.

Предпочтительно, композиция по изобретению содержит 0,1-1,2% масс./об. соли металла, более предпочтительно, 0,1-0,8%, или даже 0,1-0,4% масс./об. (композиции) соли металла, в таком порядке предпочтения.

Таким образом, части композиции по изобретению, содержащие ксантановую смолу, можно стерилизовать без нарушения модифицирующих вязкость свойств смолы. В рамках изобретения, «стерилизация нагреванием» включает инкубацию в течение по меньшей мере 15 минут при по меньшей мере 100°C.

Соль металла, в принципе, может представлять собой любую соль металла, но предпочтительно, соль металла представляет собой соль из одно- или двухвалентного катиона металла. Более предпочтительным является катион щелочного металла.

Анион соли металла, предпочтительно, представляет собой галоген, сульфат, фосфат, нитрат или ацетат. Более предпочтительным является хлорид.

Даже более предпочтительно, соль металла представляет собой галогеновую соль щелочного металла; даже более предпочтительно, натрия или калия; даже более предпочтительно, соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия.

Чтобы стимулировать проглатывание вакцины, подлежащей получению из композиции по изобретению, можно добавлять краситель. Это будет привлекательным при природной склонности птиц склевывать и проглатывать такие ярко окрашенные капельки. Следовательно, краситель можно включать в композицию по изобретению. Разумеется, краситель не должен отрицательно влиять на другие компоненты композиции по изобретению, конкретно: жизнеспособность или стабильность живых ооцист. А также краситель должен являться фармацевтически приемлемым в качестве ингредиента вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, композиция содержит фармацевтически приемлемый краситель.

Примерами «фармацевтически приемлемого красителя» являются: например, зеленый (например, хлорофилл, E140), красный (например, кармин, E120), или синий (например, бриллиантовый синий, FD&C синий No. 1, E133). Все они легко доступны коммерчески.

Краситель присутствует в композиции по изобретению в количестве, подходящем для придания цвета вакцине, полученной из этой композиции, с подходящей интенсивностью. Обеспечивая разведение композиции по изобретению вплоть до кратности 4, композиция содержит между приблизительно 0,05 и приблизительно 4% масс./об. (композиции) красителя.

Доказано, что красный (кармин) краситель является высокоэффективным для стимуляции поглощения вакцины для распыления на основе геля для домашней птицы, содержащей ооцисты Eimeria.

Таким образом, в одном варианте осуществления композиции по изобретению, фармацевтически приемлемый краситель представляет собой кармин.

В предпочтительном варианте осуществления кармин присутствует в композиции по изобретению в количестве 0,1-0,2% масс./об. (композиции).

В одном варианте осуществления композиции по изобретению, используют одно или несколько, или все из условий, выбранных из группы, состоящей из:

- композиция содержит между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,5% масс./об. (композиции) ксантановой смолы; предпочтительно, композиция содержит приблизительно 0,6% масс./об. ксантановой смолы;

- агонист TLR3 представляет собой поли-I:C или поли-A:U, предпочтительно поли-A:U;

- агонист TLR3 присутствует в количестве между 5 и 1000 микрограмм на миллилитр композиции; предпочтительно, композиция содержит 5-250 микрограмм агониста TLR3 на миллилитр;

- живые ооцисты Eimeria представляют собой спорулирующие ооцисты;

- живые ооцисты Eimeria происходят из ослабленного штамма Eimeria, предпочтительно, ослабленные Eimeria имеют преждевременное развитие;

- живые ооцисты Eimeria происходят из штамма дикого типа Eimeria;

- композиция содержит живые ооцисты Eimeria из более, чем одного штамма из одного и того же вида;

- живые ооцисты Eimeria представляют собой одну или несколько, выбранных из группы, состоящей из: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. brunetti, E. praecox, E. mivati, E, hagani, E. meleagrimitis 1, E. meleagrimitis 2, E. adenoeides, E. gallopavonis и E. dispersa;

- композиция содержит живые ооцисты Eimeria из более, чем одного вида, и по меньшей мере один из этих видов содержит живые ооцисты Eimeria из более, чем одного штамма из этого вида; предпочтительно, при этом по меньшей мере один из этих штаммов является ослабленным, и по меньшей мере один из этих штаммов принадлежит к дикому типу;

- композиция содержит между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6% масс./об. (композиции) соли металла; предпочтительно композиция содержит между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,4% масс./об. соли металла;

- соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия;

- композиция содержит фармацевтически приемлемый краситель; предпочтительно, фармацевтически приемлемый краситель представляет собой кармин; и

- фармацевтически приемлемый краситель присутствует в композиции в количестве между 0,05 и 4% масс./об. (композиции).

В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению, агонист TLR3 представляет собой поли-A:U; агонист TLR3 присутствует в количестве 5-1000 микрограмм на миллилитр композиции; живые ооцисты Eimeria представляют собой спорулирующие ооцисты; ооцисты представляют собой E. acervulina, E. maxima, E. mitis и E. tenella; ооцисты E. maxima происходят из двух штаммов; композиция содержит между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6% масс./об. (композиции) соли металла; соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия; композиция содержит фармацевтически приемлемый краситель в количестве 0,05-4% масс./об. (композиции); и фармацевтически приемлемый краситель представляет собой кармин.

С использованием различных вариантов и предпочтений, как описано в настоящем описании выше, специалист в данной области является способным получить композицию по изобретению.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу получению композиции по изобретению, включающему смешивание живых ооцист Eimeria и фармацевтически приемлемого носителя, с агонистом TLR3.

Способы осуществления такого смешивания хорошо известны в данной области, и могут быть использованы в любом масштабе, который является удобным или целесообразным. Например, когда агонист TLR3 получен в форме порошка, его можно растворять непосредственно в растворе, содержащем живые ооцисты Eimeria и фармацевтически приемлемый носитель. Альтернативно, агонист TLR3 может находиться в собственном растворе, который затем можно добавлять в жидкой форме.

Как описано, композицию по изобретению можно использовать для получения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза, которая является более эффективной, чем общепринятые вакцины из живых ооцист Eimeria.

Таким образом в следующем аспекте, изобретение относится к применению композиции по изобретению для изготовления вакцины для домашней птицы против кокцидиоза.

Детали и предпочтения для вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению описаны в настоящем описании ниже.

«Изготовление» вакцины для домашней птицы против кокцидиоза, в соответствии с применением по изобретению, можно осуществлять с использованием способов, хорошо известных и легко применимых для специалиста в данной области. Например, композицию по изобретению, содержащую живые ооцисты Eimeria, и фармацевтически приемлемый носитель и агонист TLR3 смешивают, необязательно, можно добавлять дополнительные наполнители, и полученную вакцину пропорционально распределяют в контейнеры подходящего размера и упаковывают.

Различные стадии производственного процесса мониторируют посредством адекватных тестов, например, посредством иммунологических тестов на качество и количество ооцист или любых других добавленных антигенов; посредством микробиологических тестов на стерильность (исключая, разумеется, живые ооцисты) и отсутствие посторонних веществ; посредством тестов на биологическую и химическую стабильность; и, в конечном счете, посредством экспериментов in vitro или in vivo для определения эффективности и безопасности вакцины. Все они хорошо известны специалисту в данной области и предписаны в Государственных нормативных актах, таких как Фармакопея, и в руководствах, таких как: «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

Изготовление вакцины для домашней птицы против кокцидиоза включает также варианты осуществления, где композицию по изобретению, или ее части, используют в более или менее концентрированной форме. Например, ооцисты можно получать и хранить до использования в форме, в которой ооцисты Eimeria присутствуют в намного более высоких количествах, чем количества, в которых они должны находиться в вакцине, подлежащей получению из нее. А также, другие части композиции можно получать и хранить в концентрированной форме, такой как раствор, содержащий ксантановую смолу, соль металла и/или краситель. Любое одно из них можно использовать в качестве разбавителя для любого одного из других, любым способом, какой может являться удобным в ходе процесса производства. Специалист в данной области отлично способен рассчитать кратность разведения, которую следует использовать для достижения желательного конечного количества или концентрации активного ингредиента или наполнителя в полученной вакцине.

Как описано, вакцина, которую можно получать с использованием композиции по изобретению, является более эффективной, чем общепринятые вакцины из живых ооцист Eimeria. Этого достигают посредством добавления агониста TLR3.

Таким образом, в следующем аспекте, изобретение относится к композиции по изобретению для использования в качестве вакцины для домашней птицы против кокцидиоза.

А также, в следующем аспекте изобретение относится к вакцине для домашней птицы против кокцидиоза, содержащей композицию по изобретению.

Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, имеющую медицинский эффект. Вакцина содержит иммунологически активный компонент и фармацевтически приемлемый носитель. «Иммунологически активный компонент» представляет собой одну или несколько антигенных молекулу(молекул), в настоящем описании: живые ооцисты Eimeria, узнаваемые иммунной системой домашней птицы-мишени и индуцирующие защитный иммунологический ответ. Этот ответ может происходить из врожденной и/или из приобретенной иммунной системы мишени, и может относиться к клеточному и/или гуморальному типу.

Вакцина, как правило, является эффективной для уменьшения уровня или степени инфекции, например, посредством уменьшения паразитарной нагрузки, или уменьшения длительности воспроизведения паразита в животном-хозяине.

В дополнение к этому или возможно, в результате этого, вакцина, как правило, является эффективной для уменьшения или облегчения (клинических) симптомов заболевания, которые могут быть вызваны такими инфекцией или воспроизведением, или ответом животного на такие инфекцию или воспроизведение.

Эффектом вакцины против кокцидиоза по изобретению является предотвращение или уменьшение у домашней птицы инфекции Eimeria, и/или одного или нескольких признаков кокцидиоза, ассоциированных с такой инфекцией или воспроизведением. В настоящем описании такие (клинические) признаки представляют собой: оценки в баллах очагов в кишечнике, прироста живой массы тела и выхода ооцист.

На вакцину против кокцидиоза, подобную этой, можно ссылаться просто как на вакцину «против» Eimeria или «против» кокцидиоза, или на «вакцину против Eimeria».

Детали и предпочтения для вакцины против кокцидиоза по изобретению описаны в настоящем описании ниже.

«Домашняя птица» относится к птицам, важным для сельского хозяйства, таким как: курица, индейка, утка, гусь, куропатка, павлин, перепелка, голубь, фазан, цесарка или страус. Предпочтительно, домашняя птица представляет собой курицу, индейку, утку или гуся. Более предпочтительно, домашняя птица представляет собой курицу или индейку. Наиболее предпочтительно, домашняя птица представляет собой курицу.

Домашняя птица-мишень может относиться к любому типу, такому как несушки, производители, бройлеры, комбинированные породы или родительские линии для любой из таких пород. Предпочтительный тип домашней птицы представляет собой бройлеров.

«Кокцидиоз» является хорошо известным как комплексное заболевание кишечника, вызванное кокцидиальными паразитами, такими как Eimeria.

В одном варианте осуществления вакцина для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению содержит между приблизительно 5 и приблизительно 250 микрограмм агониста TLR3 на миллилитр вакцины.

Вакцину для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению можно предоставлять в форме, содержащей любой из вариантов осуществления (предпочтительный или нет), как описано в настоящем описании для композиции по изобретению, или любую комбинацию из двух или более из этих вариантов осуществления композиции по изобретению.

Вакцина для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению является наиболее эффективной при использовании в качестве вакцины для распыления на основе геля, как описано в EP 15203012. Таким образом вакцина содержит ксантановую смолу, которая помогает формировать капельки, более эффективно употребляемые внутрь, и которая также помогает в доставке агониста TLR3 в кишечник птиц.

Предпочтительный размер гелевых капелек, сформированных при распылении вакцины по изобретению, составляет между приблизительно 1 и приблизительно 4 мм в диаметре. Для достижения этого, вакцина должна иметь относительно высокую вязкость между приблизительно 200 и приблизительно 4000 мПа.с. Эту вязкость можно обеспечивать при содержании в вакцине по изобретению ксантановой смолы в количестве между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,5% масс./об.; при этом, «масс./об.» в этом случае относится к объему вакцины.

Таким образом, в одном варианте осуществления вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, вакцина содержит 0,3-1,5% масс./об. ксантановой смолы и имеет вязкость между 200-4000 мПа.с.

«Вязкость» по изобретению следует определять с использованием способа вращающегося стержня, при этом образец измеряют после уравновешивания при постоянной температуре. Конкретно: измерения вязкости проводят с использованием ротационного вискозиметра Brookfield™ в соответствии с инструкциями производителя. При измерении используют стержень типа LV4, вращающийся при 100 об/мин, и образец уравновешивают при 25°C в водяной бане.

В одном варианте осуществления вакцина для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению представляет собой пероральную вакцину.

Термин «пероральный» относится к пути употребления внутрь через полость рта. В рамках изобретения это относится к птицам, склевывающим вакцину из гелевых капелек и проглатывающим ее.

Как описано выше, вакцину по изобретению можно изготавливать из композиции по изобретению различными способами, включающими стерилизацию частей композиции, содержащих ксантановую смолу. Такую стерилизацию можно проводить различными способами; в случае, когда раствор, содержащий ксантановую смолу, следует стерилизовать посредством нагревания, тогда ксантановую смолу необходимо защищать посредством добавления соли металла. Как также описано в настоящем описании, существуют верхний и нижний пределы количества соли металла, подлежащего использованию.

Следовательно, когда вакцина по изобретению получена из раствора ксантановой смолы, стерилизованного нагреванием, тогда вакцина может содержать между приблизительно 0,1 и приблизительно 0,4% масс./об. (вакцины) соли металла.

Таким образом, в одном варианте осуществления вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, вакцина содержит 0,1-0,4% масс./об. соли металла.

Предпочтительно, соль металла представляет собой хлорид натрия или хлорид калия.

В вакцине для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, точное количество ооцист Eimeria на дозу не является сильно критическим, поскольку ооцисты могут легко воспроизводиться и колонизировать кишечник хозяина. Доза вакцина только должна являться достаточной для инициации такой продуктивной инфекция. Более высокая доза инокулята вряд ли укорачивает время, занимаемое для достижения оптимальной колонизации в хозяине, и очень высокие дозы не являются привлекательными по экономическим причинам. Кроме того, слишком высокие дозы ооцист вакцины сами могут вызывать некоторые патологии. Очевидно, что слишком низкая доза, несмотря на то, что, возможно, способна приводить к инфекции Eimeria, может занимать слишком много времени для надлежащего возникновения иммунитета.

Предпочтительная доза инокулята, таким образом, составляет между приблизительно 10 и приблизительно 1×10⁵ спорулирующих ооцист видов Eimeria на дозу для животного, более предпочтительно, между 100 и 1×10⁴ ооцист на дозу, между 100 и 5000, или даже между 100 и 1000 ооцист/на дозу для животного, в таком порядке предпочтения.

Как очевидно специалисту в данной области, оптимальная доза вакцины из живых ооцист Eimeria зависит, например, от видов животных-мишеней, и от вида и вирулентности используемого штамма Eimeria, и может, таким образом, отличаться между различными видами Eimeria в одной комбинированной вакцине.

Способы количественной оценки ооцисты Eimeria для использования в вакцине против кокцидиоза по изобретению хорошо известны в данной области.

Объем на дозу для животного вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, можно оптимизировать в соответствии с намеченным способом введения, например, для вакцинации распылением доза может составлять между приблизительно 10 мкл и приблизительно 1 мл на птицу. Предпочтительно, объем вакцины для распыления составляет между 0,1 и 0,5 мл на птицу, более предпочтительно, между 0,1 и 0,3 мл на птицу.

Наиболее предпочтительный объем вакцины для распыления составляет приблизительно 0,2 мл на птицу.

Альтернативно, вакцину можно вводить распылением на корм, или в форме жидкости - в питьевую воду. В этих случаях дозу/птицу можно оптимизировать по количеству съеденного корма или по количеству выпитой воды. Это находится в компетенции специалиста в данной области.

Нахождение оптимального объема и дозы для различных способов введения, посредством определения того, что является иммунологически эффективным количеством ооцист Eimeria на дозу для животного вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, полностью находится в компетенции обычного специалиста в данной области. Это можно, например, осуществлять посредством мониторирования иммунологического ответа после вакцинации или после заражения инфекцией, например, посредством мониторирования признаков заболевания и клинической оценки в баллах у мишени, наиболее значительной: оценки в баллах очагов в кишечнике. Другими критериями могут являться прирост живой массы тела, серологические параметры, или повторное выделение патогена для определения выхода ооцист. Эти результаты можно, например, сравнивать с ответом на вакцинацию-заражение, который наблюдают у животных после ложной вакцинации.

Возраст, масса, пол, иммунологический статус и другие параметры домашней птицы-мишени для вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению не являются критическими, хотя обеспечивает преимущества вакцинация здоровых мишеней и настолько ранняя вакцинация, насколько возможно, для предотвращения (последствий) ранней инфекции патогенным Eimeria.

Таким образом, вакцину для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению предпочтительно вводят на сутки вылупления, т.е. в возрасте 1 сутки.

Когда это обеспечивает преимущества, домашнюю птицу можно подвергать бустер-вакцинации позднее на протяжении жизни.

Как понятно специалисту в данной области, использование лечебного корма для домашней птицы для введения вакцины против кокцидиоза по изобретению, следует использовать с осторожностью. В период около планируемой вакцинации, птицам не следует вводить корм, содержащий антикокцидные лекарственные средства; или по меньшей мере, не вводить корм, содержащий антикокцидные лекарственные средства, к которым ооцисты Eimeria в вакцине являются чувствительными.

Является высоко эффективным составлять вакцину для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению в форме комбинированной вакцины, поскольку этим способом множество иммунологических средств можно вводить за одни раз, что уменьшает дискомфорт птиц-мишеней, и уменьшает затраты на оплату труда. Комбинированная вакцина на основе вакцины по изобретению содержит добавку другого иммунологически активного соединения. В принципе, это может представлять собой любой живой или убитый микроорганизм, или его часть; при сохранении в то же время стабильности и способности к воспроизведению живых ооцист Eimeria. А также, дополнительный иммуноактивный компонент(ы) должен быть совместимым и эффективным в вакцине, подлежащей употреблению внутрь.

Добавленное иммунологически активное соединение может представлять собой антиген, средство для усиления иммунитета и/или вакцину. Альтернативно, собственно вакцину по изобретению можно добавлять в вакцину.

Способы получения комбинированной вакцины по изобретению полностью находится в компетенции обычного специалиста в данной области.

Таким образом, в одном варианте осуществления, вакцина для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению отличается тем, что вакцина содержит один или несколько дополнительный иммуноактивный компонент(ы).

В одном варианте осуществления вакцина для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению представляет собой комбинированную вакцину, содержащую по меньшей мере один дополнительный антиген, происходящий из микроорганизма, который является патогенным для домашней птицы. Дополнительный антиген может представлять собой живой, живой ослабленный или убитый микроорганизм, или его часть.

Предпочтительно, дополнительный антиген из микроорганизма, являющегося патогенным для домашней птицы, представляет собой один или несколько, выбранные из группы, состоящей из:

- Вирусов: вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса болезни Ньюкасла (NDV), аденовируса, вируса синдрома снижения яйценоскости, вируса инфекционного бурсита (IBDV) (т.е. вируса Гамборо), вируса анемии цыплят, вируса энцефаломиелита птиц, поксвируса домашней птицы, вируса ринотрахеита индеек (TRT), вируса чумы уток (вирусного энтерита уток), поксвируса голубей, вируса болезни Марека (MDV), вируса лейкоза птиц, вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV), пневмовируса птиц, вируса гриппа птиц (AIV) и реовируса;

- Бактерий: Escherichia coli, Salmonella, Ornitobacterium rhinotracheale, Haemophilis paragallinarum, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Erysipelas, Mycoplasma, Campylobacter, Shigella и Clostridium;

- Паразитов: Histomonas, Isospora, Cryptosporidium и Dermanyssus; и

- Грибов: Aspergillus.

Более предпочтительным дополнительным антигеном является один или несколько, выбранных из группы, состоящей из: IBV, NDV, IBDV, ILTV, TRT, AIV, MDV, Mycoplasma и Salmonella.

Вакцину для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению можно преимущественным образом комбинировать с фармацевтическим компонентом, таким как антибиотик, гормон, и/или противовоспалительное лекарственное средство. Даже использование антикокцидного соединения является возможным, при условии, что ооцисты Eimeria в вакцине не являются чувствительными к этому конкретному лекарственному средству.

Вакцина для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению может содержать один или несколько компонентов, улучшающих жизнеспособность и качество живых ооцист Eimeria для использования по изобретению, таким образом, способствующих продуктивному воспроизведению и развитию колонизации домашней птицы-мишени.

В одном варианте осуществления добавка представляет собой стабилизатор, для стабилизации количества и качества ооцист Eimeria по изобретению во время составления, хранения, манипуляции, введения или употребления внутрь. А также, можно добавлять подходящие консерванты, такие как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения, или гентамицин.

Вакцину для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению можно использовать в качестве либо профилактического, либо терапевтического лечения, или обоих, поскольку она создает помехи как развитию, так и прогрессированию инфекции патогенным Eimeria.

В зависимости от условий введения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, таких как полевые условия или вид домашней птицы-мишени, может обеспечивать преимущества дополнительная оптимизация вакцины. Это полностью находится в компетенции специалиста в данной области, и, как правило, включает тонкую регулировку эффективности или безопасности вакцины. Это можно осуществлять использовать выбора используемого штамма Eimeria, посредством адаптации уровня, частоты или способа дозирования вакцины, или посредством адаптации или добавления других составляющих вакцины (например, стабилизаторов, носителей, разбавителей и т.п.).

В предпочтительном варианте осуществления вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, агонист TLR3 представляет собой поли-A:U; агонист TLR3 присутствует в количестве 5-250 микрограмм на миллилитр вакцины; живые ооцисты Eimeria представляют собой спорулирующие ооцисты; ооцисты представляют собой E. acervulina, E. maxima, E. mitis и E. tenella; ооцисты E. maxima происходят из двух штаммов; вакцина содержит между приблизительно 0,3 и приблизительно 1,5% масс./об. (вакцины) ксантановой смолы; вакцина имеет вязкость между приблизительно 200 и приблизительно 4000 мПа.с; и композиция содержит кармин, в количестве 0,1-0,2% масс./об. (вакцины).

В следующем аспекте, изобретение относится к способу вакцинации домашней птицы против кокцидиоза, отличающемуся тем, что способ включает введение вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению указанной домашней птице.

Как описано, вакцину для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению предпочтительно вводят способом массового введения, таким образом, что вакцину употребляют внутрь, что приводит к эффективной иммунизации против патогенного Eimeria.

Предпочтительным способом массового введения вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению является способ распыления на птиц. Это можно осуществлять в форме крупнокапельной струи с использованием водной среды, в результате чего получаемые капельки, как правило, имеют размер более 50 мкм в диаметре.

Такую крупнокапельную струю можно, например, наносить с использованием распылителя в инкубаторе при иммунизации цыплят в возрасте одних суток в поддонах инкубатора, или можно наносить, например, с использованием распылителя ранцевого типа при иммунизации более старших птиц в условиях загона для напольного содержания цыплят. Распыленную вакцину птицы быстро употребляют внутрь с перьев или с пола.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, способ включает введение вакцины посредством крупнокапельной струи на домашнюю птицу и/или в ее окружение.

Указание на то, что вакцина распылена «на домашнюю птицу» не требует того, чтобы вакцина полностью или по большей части достигала тела птиц. Вместо этого, это указывает на то, что не требуется специфического нацеливания на конкретную часть тела. При содержании ксантановой смолы, капельки вакцины могут становиться несколько липкими и при доставке в форме крупнокапельной струи проявляют тенденцию к адгезии, до некоторой степени, к перьям птиц. Однако часть вакцины не приземляется, или не остается, на теле птиц, но в конце концов падает на пол или на дно контейнера, в котором содержат птиц. Это хорошо, поскольку птицы быстро начинают склевывать такие капельки и употреблять их внутрь.

В предпочтительном варианте осуществления способа вакцинации домашней птицы против кокцидиоза по изобретению посредством крупнокапельной струи, капельки вакцины имеют размер между приблизительно 1 и приблизительно 4 мм в диаметре.

Можно использовать стандартное оборудование для вакцинации распылением, и посредством выбора надлежащих условий, таких как используемые сопло и давление, специалист в данной области может удобным образом получать капельки таких размеров. Благодаря свойствам псевдопластичности ксантановой смолы, не требуется увеличения давления или использования специальных наконечников распылителей для высокого давления.

Режим введения вакцинации по способу по изобретению домашней птице-мишени, можно осуществлять в однократных или множественных дозах, способом, совместимым с составом вакцины и с практическими аспектами условий содержания животных.

Предпочтительно, режим для способа вакцинации домашней птицы против кокцидиоза по изобретению интегрируют в существующие расписания вакцинации других вакцин, которые могут вводить домашней птице-мишени, чтобы уменьшить стресс для животных и уменьшить затраты на оплату труда. Эти другие вакцины можно вводить одновременным, параллельным или последовательным образом, способом, совместимым с зарегистрированным для них применением.

Таким образом, в одном варианте осуществления способа вакцинации домашней птицы против кокцидиоза по изобретению, вакцину вводят в комбинации с другой вакциной для домашней птицы.

Эти способы вакцинации домашней птицы против кокцидиоза по изобретению являются очень эффективными для защиты домашней птицы против инфекции Eimeria и/или против (клинических) признаков заболевания, ассоциированных с такой инфекцией. В частности, это предотвращает страдания и дискомфорт домашней птицы, и предотвращает значительный экономический ущерб для коммерческих операций с домашней птицей.

Таким образом, в следующем аспекте изобретение относится к способу уменьшения у домашней птицы инфекции Eimeria или ассоциированных признаков заболевания, отличающемуся тем, что способ включает введение указанной домашней птице вакцины для домашней птицы против кокцидиоза по изобретению.

Принимая во внимание неожиданный эффект защиты аналога дцРНК посредством комбинации с ксантановой смолой, так что он в настоящее время может быть введен пероральным способом, в относительно низких концентрациях, и все еще осуществлять индукцию в кишечнике птицы, для получения поддающегося детекции клинического улучшения защитного ответа, полученного после пероральной вакцинации против Eimeria домашней птицы, изобретение относится к способу для защиты агониста TLR3 в ходе пероральной доставки.

Таким образом, в следующем аспекте, изобретение относится к способу доставки агониста TLR3 в кишечник птицы пероральным способом, отличающемуся тем, что агонист TLR3 смешивают с ксантановой смолой.

Собственно агонист TLR3 может иметь фармацевтический эффект, и/или может функционировать (также) в качестве адъюванта иммунологического или фармацевтического эффекта другого соединения.

Предпочтительно ксантановая смола для смешивания с агонистом TLR3 является такой, как описано в одном или нескольких из аспектов и их различных вариантов осуществления и предпочтений, как описано в настоящем описании.

Изобретение в настоящее время далее описано посредством следующих, неограничивающих, примеров.Примеры

1. Эффект агониста TLR3 на эффективность вакцины против Eimeria; более раннее начало иммунитета

1.1. Описание эксперимента

В этом эксперименте тестировали эффект на начало иммунитета вакцины Paracox™ 8 посредством добавления агониста TLR3. Титрование дозы проводили для агониста TLR3. Результаты напрямую сравнивали с птицами, вакцинированными только с использованием Paracox 8.

Двести десять птиц в возрасте одни сутки разделяли на семь групп по 30 птиц. Всех птиц в группах 1-5 вакцинировали с использованием вакцины Paracox, разведенной в 0,6% ксантановой смоле, содержащей 0,1% кармина; посредством введения через желудочный зонд 0,5 мл вакцины. В каждой из групп 1-4 вводили различное количество агониста TLR3. Птиц в группе 5 вакцинировали с использованием только Paracox 8, и птиц в группах 6 и 7 не вакцинировали (см. таблицу 1). Всех птиц содержали в их группах в отдельных загонах в течение 14 суток после вакцинации (PV). Образцы фекалий собирали на сутки 7, 14 и 19 от контрольных птиц (группы 6 и 7) для мониторирования инфекции кокцидиоза. На сутки 13 PV перед заражением, всем птицам присваивали уникальный идентификатор посредством числовой метки, затем на сутки 14 PV каждую птицу в группах 1-6 заражали с использованием 15000 ооцист E. tenella дикого типа. В то время как эта дата заражения являлась слишком ранней в норме для вакцинации Paracox для достижения полной защиты, она позволяла детекцию какого-либо улучшения начала иммунитета.

На сутки 5 после заражения всех зараженных птиц и птиц в группе 7 подвергали эвтаназии и проверяли посмертно очаги, ассоциированные с инфекцией E. tenella. Птиц обследовали ежесуточно на протяжении исследования по любым клиническим признакам, которые могли быть связаны с инфекцией видами Eimeria.

Таблица 1: Расписание вакцинаций и заражений из примера 1

Группа	Обработка
Вакцина	Агонист TLR3 (доза, мкг/животное)	Заражение
1	Да	5	Да
2		10
3		20
4		40
5	0
6	Нет	0
7	0	Нет

1.2. Материалы и способы

Использовали коммерческую партию вакцины Paracox 8, которую ресуспендировали для получения одной полной дозы на 0,5 мл. Вакцину разводили 1:1 с использованием 2x концентрированного раствора для хранения разбавителя, содержащего раствор 1,2% ксантановой смолы, в 75 мМ NaCl (т.е. 0,44% масс./об.), и содержащего 0,2% масс./об. кармина (E 120). Раствор для хранения разбавителя стерилизовали автоклавированием при 115°C в течение 30 минут.

Разведение вакцины Paracox 8 проводили в ламинарном боксе. 100 мл вакцины (содержащей 200 доз) подготавливали для каждой группы; два пакета с 1000 дозами вакцины интенсивно встряхивали и массировали в течение 1 минуты для обеспечения ресуспендирования ооцист. Содержимое пакетов объединяли в подходящем контейнере. Для каждой вакцины 21 мл чистой объединенной вакцины Paracox 8 добавляли в стерильную стеклянную дюрановую бутыль (соответствующим образом снабженную меткой с номером группы). Раствор для хранения агониста TLR3 при 10 мг/мл быстро размораживали, и затем соответствующие объемы агониста и воды добавляли к вакцине и интенсивно перемешивали. Затем 50 мл 2x раствора для хранения разбавителя добавляли в каждую дюрановую бутыль (в зависимости от группы). Затем все составы интенсивно перемешивали посредством встряхивания в течение по меньшей мере 10 минут перед использованием.

В группах 1-4 для образцов вакцины вводили такое количество раствора для хранения агониста TLR3 при 10 мг/мл, чтобы достичь намеченного количества агониста; группа 1: 100 мкл, группа 2: 200 мкл и т.д.; все эти объемы доводили стерильной водой до 29 мл.

Агонист TLR3:

Использованный агонист TLR3 представлял собой поли-A:U, двухцепочечный гомополимер (Sigma Aldrich). Его растворяли из лиофилизированной натриевой соли до раствора для хранения 10 мг/мл и хранили при -70°C до использования.

Материалы для заражения:

Материал для заражения представлял собой партию E. tenella дикого типа, стерильных спорулирующих ооцист, хранившуюся при 2-8°C до использования. Концентрацию ооцист в материале для заражения определяли с использованием модифицированной счетной камеры Фукса-Розенталя. Из этого проводили разведение для получения 15000 ооцист на 0,5 мл дозу для заражения.

Тестируемые животные:

Экспериментальные животные представляли собой цыплят Lohmann SPF смешанного пола, в возрасте одни сутки при вакцинации. Птиц случайным образом помещали в группы по 30, в индивидуальных загонах.

Птиц помечали индивидуально с использованием меток swift tag на сутки 13 после вакцинации.

Птиц вакцинировали посредством введения 0,5 мл соответствующего препарата вакцины на птицу, посредством введения через желудочный зонд.

Цыплят заражали с использованием 0,5 мл каждого из препаратов E. tenella дикого типа, посредством введения через желудочный зонд, все в пределах 1 часа друг от друга.

На протяжении эксперимента всех птиц обследовали ежесуточно по клиническим признакам кокцидиальной инфекции, таким как диарея или кровь в фекалиях, депрессия или отсутствие аппетита. Не выявлено особенных обнаружений. 3 цыпленка умерли по причинам, не связанным с экспериментом: 1 из группы 1, и 2 из группы 2.

На сутки 5 после заражения всех птиц подвергали эвтаназии, и посылали на некропсию. Посмертно, всех птиц из каждой группы проверяли на очаги в кишечнике, связанные с E. tenella.

С целью проверки поглощения вакцины или материала для заражения, проводили сбор фекалий с пола загонов контрольных птиц (группы 6 и 7) на сутки 7, 14 и 19 после вакцинации. Каждый образец отбирали из помета в загоне, образцы составляли приблизительно 10-20 грамм и являлись репрезентативными для целого загона, например, собранными из 4 углов и середины загона; образцы были свежими и содержали минимально возможное количество помета. Каждый образец помещали в двойной пакет, снабжали меткой, и хранили при 2-8°C до переработки. Ооцисты детектировали стандартным способом, и количества рассчитывали с использованием модифицированного способа подсчета МакМастера.

1.3. Результаты

Оценки в баллах очагов в кишечнике, связанных с E. tenella, определяли через 5 суток после заражения посредством некропсии. Оценку очагов проводили слепым способом по отношению к группе обработки, за исключением контрольных групп 6 и 7. Результаты оценки в баллах очагов для групп 1-7 обобщены на фигуре 1, панели A-G соответственно, как процент животных, для которых показан конкретный балл. За исключением случайных смертей, для этих групп n=30.

Результаты оценки в баллах очагов являлись такими, как ожидали для контрольных групп; все незараженные птицы в группе 7 имели оценки в баллах очагов 0, в то время как невакцинированные, зараженные птицы из группы 6 имели высокие баллы 3 или 4, напоминающие профиль оценки в баллах очагов для наивных птиц.

Птицы в группе 5 (только вакцина Paracox 8) имели оценки в баллах, взвешенные на высоких значениях диапазона оценки в баллах. Это не было неожиданным, поскольку птиц заражали на 14 сутки после вакцинации, когда эта вакцина в норме обеспечивает только частичную защиту. Однако это облегчало наблюдение того, присутствовало ли более раннее начало иммунитета в результате добавления агониста TLR3.

Для птиц в группах 1 и 2, которым вводили низкие дозы агониста TLR3 (5 или 10 мкг/птицу, соответственно), показан полный диапазон оценки в баллах очагов, с явно увеличенной долей более низкой оценки в баллах очагов. В группах 3 и 4, где птицам вводили два более высоких уровня дозы агониста TLR3 (20 или 40 мкг/птицу, соответственно), профиль оценки в баллах очагов не очень сильно отличался от птиц, вакцинированных только Paracox 8 (группа 5).

Сбор фекалий показал, что ооцисты не детектированы ни в каком из отобранных образцов фекалий. Это показало, что птицы в группе 7 оставались неинфицированными на протяжении исследования. Для группы 6, также не детектированы ооцисты при конечном сборе, однако это, вероятно, было связано с тяжелым заболеванием этих птиц, как показано по их оценкам в баллах очагов в кишечнике, предотвращающим формирование нормальных фекалий.

1.4. Заключения

Из всех тестированных количеств агониста TLR3, птицы, которым вводили более низкие дозы 5 или 10 мкг на животное, имели наилучшие результаты оценки в баллах очагов, с более широким диапазоном оценок в баллах, и явной тенденцией к более низким оценках в баллах очагов. Это является убедительным доказательством индукции более раннего начала иммунитета.

В этом эксперименте более высокие количества агониста TLR3/животное не предоставляли явного иммунологического улучшения. Это может являться показателем того, что существует оптимальный профиль зависимости эффекта агониста TLR3 от дозы. Однако в другом эксперименте вакцинации-заражения (пример 2) для более высокой дозы агониста TLR3/животное показано явное преимущество, по сравнению с группой только вакцины Paracox 8.

2. Эффект агониста TLR3 на эффективность вакцины против Eimeria; более раннее начало иммунитета 2

В эксперименте с по большей части такими же дизайном и способами, как описано в примере 1, количества агониста TLR3 10 или 20 микрограмм/птицу тестировали по эффекту улучшения начала иммунитета.

Использовали группы по 20 кур, которых подвергали обработке, как показано в таблице 2

Таблица 2: Расписание вакцинаций и заражений из примера 2

Группа	Обработка
Вакцина	Агонист TLR3 (доза, мкг/животное	Заражение
1	Да	10	Да
2		20
3	0
4	Нет	0
5	0	Нет

2.1. Результаты

Результаты оценки в баллах очагов из этого эксперимента представлены на фигуре 2, на панелях A-E, для групп 1-5, соответственно.

Результаты являлись такими, как ожидали для контрольных групп: все невакцинированные-незараженные птицы из группы 5 имели оценки в баллах очагов 0, в то время как невакцинированные-зараженные птицы имели высокие баллы 3 или 4, показывая, что не присутствовало защиты против заражения. Тяжесть заражения, по-видимому, была немного ниже, чем использовали в примере 1.

Птицы, которым вводили только вакцину Paracox 8, группа 3, имели некоторый диапазон оценки в баллах, но взвешенный на более высоких значениях диапазона оценки в баллах. Подобно примеру 1, это было ожидаемым из-за ранней даты заражения (2 недели) после вакцинации.

Группы обработки 1 и 2 имели широкий профиль оценки в баллах очагов, с более высокой долей более низких оценок в баллах очагов, чем у птиц в группе вакцинации 3, что показывает, что агонист TLR3 улучшал иммунитет для вакцины применительно к началу иммунитета, который она индуцировала.

В этом эксперименте более высокие количества агониста TLR3 (20 мкг/птицу), по-видимому, были более эффективными, чем более низкое количество (10 мкг/птицу) для индукции более раннего начала иммунитета.

3. Эффект агониста TLR3 на эффективность вакцины против Eimeria; уменьшение количества ооцист на дозу

Проводили дополнительный эксперимент для тестирования эффекта агониста TLR3 на эффективность вакцинации живыми ооцистами Eimeria. В этом эксперименте ряд больших групп подвергали обработке, для оценки эффекта агониста TLR3 на дозу вакцины. Дизайн и активность являлись по существу такими же, как для экспериментов в примерах 1 и 2, за исключением того, что: куры принадлежали к типу коммерческих несушек; использованная вакцина представляла собой Paracox™ 5, дозу агониста TLR3/птицу фиксировали на 7,5 мкг, вакцинацию проводили посредством крупнокапельной струи при 0,2 мл/птицу, и заражение проводили на сутки 21 после вакцинации и с использованием 4 отдельных штаммов.

3.1. Описание эксперимента

1125 цыплят в возрасте одни сутки разделяли на 9 групп из 125 животных; одну группу оставляли невакцинированной, в других 8 группах вводили вакцину Paracox 5 в различных дозах, и либо в присутствии, либо в отсутствие агониста TLR3, см. таблицу 3. Вакцина содержала ксантановую смолу, и ее вводили в форме крупнокапельной струи с использованием стандартного устройства для распыления в инкубаторах.

На сутки 21 после вакцинации, 80 птиц из каждой группы обработки относили к одному из четырех типов заражения, оставляя 20 птиц на подгруппу вида-заражения. Всего 720 птицам вводили через желудочный зонд 0,5 мл одного из четырех видов Eimeria для заражения. Пять птиц из контрольной группы 1 оставляли незараженными и содержали в их исходном загоне для получения фоновых оценок при некропсии на сутки 28 p.v.

Всех птиц взвешивали индивидуально на сутки 20 p.v. до отнесения к типу заражения, и снова на сутки 28 p.v. до некропсии, для определения прироста живой массы тела. Объединенные образцы фекалий собирали от суток 21 до 25 и от суток 25 до 28 p.v. из всех загонов для подсчета выхода ооцист. По десять птиц на группу обработки для заражения, для типов заражения E. acervulina, E. maxima и E. tenella, подвергали некропсии для оценки очагов в кишечнике. Поскольку E. mitis не образует патогномоничных очагов в кишечнике, десять птиц из группы 1 (контроль), зараженных E. mitis, подвергали некропсии для оценки статуса паразитов для подтверждения поглощения материала для заражения.

3.2. Материалы и способы

Тестируемые животные:

Hyline™ brown, коммерческие куры-несушки. Мужского пола, снабженные индивидуальными числовыми метками. Все цыплята были в возрасте одни сутки на сутки вакцинации. Птиц содержали в подходящих загонах в условиях определенного климата и в контролируемых условиях, на подстилке из опилок. Корм не являлся лечебным.

Цыплят тщательно мониторировали на протяжении исследования; 7 птиц умерли на первой неделе после вакцинации по причинам, не связанным с обработкой, они были из различных групп.

Таблица 3: Расписание вакцинаций и заражений из примера 3

Группа	Обработка
Доза вакцины	Агонист TLR3 (X мкг/птицу)	Заражение
1	отсутствует	отсутствует	Да, один из: E. acervulina, E tenella, E. mitis или E. maxima (n=20)
2	1:20	нет
3	1:20	да
4	1:10	нет
5	1:10	да
6	1:4	нет
7	1:4	да
8	full	нет
9	full	да

Вакцины:

Пакеты с Paracox 5, всего 11000 доз, интенсивно встряхивали, разделяли на различные группы в соответствующих разведениях в воде, перемешивали с агонистом TLR3, где это было желательно, и все вакцины смешивали 1:1 со стерильным 2x раствором для хранения разбавителя, содержащим ксантановую смолу (1,2%), NaCl (75 мМ) и кармин (0,2%), как описано.

Количество ооцист в «полной» дозе вакцины для групп 8 и 9 составляли на дозу: E. acervulina: 500; E. maxima, штамм CP: 200; E. maxima, штамм MFP: 100; E. mitis: 1000; и E. tenella: 500 ооцист.

Использованный агонист TLR3 представлял собой поли-A:U в дозе 7,5 мкг на птицу.

Вакцины вводили в форме крупнокапельной струи, с использованием устройства Spraycox™ II, в соответствии с инструкциями производителя: условия объема и давления калибровали перед использованием; вакцины хорошо встряхивали перед использованием; вакцины вводили от наиболее низкой до наиболее высокой дозы, и группы без агониста перед группами с агонистом, с промежуточной отмывкой. Объем вакцины устанавливали на 20 мл на 100 птиц. После вакцинации, птиц содержали в поддоне, в котором их вакцинировали, в течение по меньшей мере 30 минут в хорошо освещенном и теплом месте до переноса в загоны для содержания.

Материалы для заражения:

Все материалы для заражения представляли собой жидкие суспензии спорулирующих ооцист из 4 различных видов: E. acervulina (Ea), E tenella (Et), E. mitis (Emit) или E. maxima (Emax). Намеченное количество ооцист определяли с использованием модифицированной счетной камеры Фукса-Розенталя, что соответствует: Ea: 1×10⁶/птицу в 1 мл; Et: 3×10⁴/птицу в 0,5 мл; Emit: 3×10⁵/птицу в 1 мл; Emax: 1×10⁴/птицу в 0,5 мл.

Материал для заражения вводили индивидуально, посредством введения через желудочный зонд.

Некропсия и оценка в баллах очагов:

Персонал, проводящий подсчет ооцист или оценку в баллах очагов, не был осведомлен относительно информации об обработках. При оценке в баллах очагов использовали стандартные критерии, специфические для каждого из видов для заражения (Ea, Et и Emax).

3.3. Результаты

Поглощение вакцин и материала для заражения:

Образцы фекалий птиц из группы 1 оставались отрицательными при подсчете ооцист перед заражением, что показывает, что группа 1 являлась свободной от кокцидий перед заражением. При подсчете ооцист, все образцы фекалий, отобранные в вакцинированных группах 2-9, являлись положительными с суток 11 p.v., что показывает, что воспроизведение ооцист вакцины являлось успешных для всех вакцинированных групп.

Поглощение материала для заражения также являлось успешным с клиническими симптомами кокцидиоза, наблюдаемыми от трех суток после заражения до некропсии. При некропсии на сутки 28 p.v., птицы, зараженные с использованием E. acervulina, E. maxima и E. tenella, имели оценки в баллах очагов в кишечнике выше 0, и все соскобы кишечника контрольных птиц, зараженных E. mitis, являлись положительными по ооцистам, что подтверждает, что заражение было эффективным.

Прирост живой массы тела:

Результаты среднего прироста живой массы тела в граммах, от суток 20 до суток 28 после вакцинации, для различных подгрупп заражения, представлены в таблице 4. Размер различных подгрупп составлял 20 животных.

Для E. acervulina, для всех разведений вакцины получали значимо лучший (p<0,01) средний прирост живой массы тела по сравнению с невакцинированной-зараженной контрольной группой, за исключением разведения 1/20 (группа 2), которая имела значимо более низкий средний прирост живой массы тела. Однако он очень сильно восстанавливался в присутствии агониста TLR3.

Из птиц в вакцинированных подгруппах, в которых вводили один из других видов для заражения (E. tenella, E. mitis или E. maxima), большинство имели значимо лучший прирост живой массы тела по сравнению с соответствующими им невакцинированными-зараженными группами. Однако невозможно было детектировать эффект разведения вакцины или присутствия агониста TLR3.

Заключили, что использованные дозы вакцины, даже в разведенных образцах, все еще содержали слишком высокие дозы ооцист для возможности наблюдения эффекта на прирост массы тела. В повторном эксперименте будут использованы более высокие разведения вакцины.

Таблица 4: Средний прирост живой массы тела в граммах, от суток 20 до суток 28 после вакцинации, для различных подгрупп заражения (n=20)

Группа	E. acervulina	E. tenella	E. mitis	E. maxima
1 - невакцинированная - без агониста TLR3	63,7	73,3	50,4	53,7
2-1/20 дозы	36,7	84,0	72,3	92,3
3-1/20 дозы+агонист TLR3	88,1	84,2	73,1	90,7
4-1/10 дозы	85,6	77,6	60,2	76,5
5-1/10 дозы+агонист TLR3	83,5	87,4	72,6	нет данных
6-1/4 дозы	88,8	91,2	70,6	83,4
7-1/4 дозы+агонист TLR3	93,2	84,2	74,5	81,6
8 - полная доза	85,3	84,5	71,5	86,4
9 - полная доза+агонист TLR3	93,0	83,0	72,0	82,6

Оценки в баллах очагов в кишечнике:

Результаты для средней оценки в баллах очагов в кишечнике для типа заражения и группы обработки представлены в таблице 5. Для этих группа n=20.

Только 50% из невакцинированных контрольных птиц, зараженных E. acervulina, имели оценки в баллах очагов выше 2.

Вакцинированные-зараженные птицы не имели значимых различий в оценке в баллах очагов. Восемьдесят процентов невакцинированных контрольных птиц, зараженных E. maxima, имели оценки в баллах очагов выше 2. Это представляло собой значимое (p<0,05) различие в распределении очагов для всех вакцинированных птиц (группы 2-9), по сравнению с невакцинированными птицами (все значения p<0,03), без соответствия разведению вакцины или присутствию агониста TLR3. Девяносто процентов невакцинированных контрольных птиц, зараженных E. tenella, имели оценки в баллах очагов выше 2. Хотя для стандартной вакцины в отсутствие агониста TLR3 (группа 8) процент птиц с оценкой в баллах очагов выше 2 был уменьшен до 60%, это изменение общего распределения не было статистически значимым (p=0,07). Однако присутствовало значимое уменьшение в распределении оценок в баллах очагов для вакцины, разведенной 1/4 (группа 6; p=0,001). При более сильных разведениях вакцины (1/10, группа 2, и 1/20, группа 4), 70% птиц имели оценки в баллах очагов выше 2, и распределения значимо не отличались от невакцинированной зараженной контрольной группы. Присутствие агониста TLR3 уменьшало процент птиц с оценками в баллах очагов выше 2 до 20% (группа 5, 1/10 дозы) и 50% (группа 3, 1/20 дозы) соответственно, приводя в результате к распределению оценки в баллах очагов, которое отличалось от контрольной группы статистически значимо для группы 5 (p=0,003), и почти статистически значимо для группы 3 (p=0,0509).

3.4. Обсуждение и заключения

Не присутствовало значимых различий в массе тела птиц между контрольной группой и вакцинированными группами обработки для каждого типа заражения на сутки 20 p.v. Образцы фекалий для невакцинированного контроля (группа 1) подтвердили, что группа 1 оставалась свободной от кокцидий перед заражением. При подсчете ооцист, все образцы фекалий, отобранные из вакцинированных групп обработки 2-9, являлись положительными от суток 11 p.v., что показывает, что поглощение и повторное прохождение циклов для ооцист являлось успешным для всех вакцинированных групп. Повторный подсчет использованного материала для заражения показал, что доза находилась в пределах ±2% от целевой.

При некропсии на сутки 28 p.v., невакцинированные контрольные птицы, зараженные E. acervulina, E. maxima или E. tenella, имели оценки в баллах очагов в кишечнике выше 2 у 50%, 80% и 90% птиц, соответственно. А также, все соскобы кишечника контрольных птиц, зараженных E. mitis, являлись положительными по ооцистам.

Несмотря на то, что оценки в баллах очагов, полученные после заражения E. acervulina, являлись относительно умеренными, высокие уровни выхода ооцист и значительный эффект на прирост массы наблюдали в невакцинированной контрольной группе, таким образом, подтверждая, что все заражения являлись эффективными. Для разведения вакцин показан изменчивый эффект на эффективность, в зависимости от видов для заражения и измеряемого параметра. Разведение вакцины вплоть до 1/20 не оказывало эффекта на какой-либо из исследованных параметров либо для E. maxima, либо E. mitis, что показывает, что эти антигены присутствуют в значительном избытке в составе Paracox 5. В отличие от этого, для E. tenella уменьшенные уровни защиты в отношении как для уменьшения выхода ооцист, так и для оценки в баллах очагов, наблюдали при разведениях вакцины 1/10 или выше. Подобным образом, для E. acervulina, когда вакцину разводили 1/20, не наблюдали защиты против уменьшения прироста массы. Очаги в кишечнике являлись слишком умеренными, чтобы показать определенный исход. Во всех случаях, когда наблюдали уменьшение защиты из-за разведения вакцины, включение агониста TLR3 в вакцинный состав обеспечивало преимущества.

Совместно, эти результаты доказывают, что включение агониста TLR3 в вакцинный состав может увеличивать активность вакцины при более низких дозах антигена вплоть до 4 раз, с получением в то же время такого же уровня защиты против заражения.

Таблица 5: Средние оценки в баллах очагов в кишечнике для типа заражения и группы обработки (n=20)

Группа	E. acervulina	E. tenella	E. maxima
1 - невакцинированная - без агониста TLR3	1,5	2,9	2,1
2-1/20 дозы	1,5	2,2	0,9
3-1/20 дозы+агонист TLR3	0,9	1,7	1,2
4-1/10 дозы	1,0	2,0	1,2
5-1/10 дозы+агонист TLR3	1,3	1,0	1,0
6-1/4 дозы	1,0	0,6	0,8
7-1/4 дозы+агонист TLR3	1,4	0,3	1,2
8 - полная доза	1,5	2,0	0,9
9 - полная доза+агонист TLR3	1,1	0,2	0,9

Подписи к фигурам

Фигура 1

На Фигуре 1 показаны результаты эксперимента вакцинации-заражения, описанного в примере 1. На панелях A-G представлены оценки в баллах очагов после вакцинации-обработки для заражения для групп 1-7, соответственно.

На горизонтальной оси представлены оценки в баллах очагов в числах 0-4, и на вертикальной оси - процент птиц, для которых показана эта оценка в баллах очагов в этой группе. Для этих групп n=30.

Фигура 2

Результаты оценки в баллах очагов, полученные в результате эксперимента вакцинации-заражения из примера 2. На панелях A-E показаны результаты для групп 1-5, соответственно. Использованные оси являются такими же, как на фигуре 1. Для этих групп n=20.

1. Композиция для уменьшения у домашней птицы инфекции Eimeria или ассоциированных признаков заболевания, содержащая живые ооцисты Eimeria и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что композиция содержит между приблизительно 0,3 и приблизительно 5% масс./об. ксантановой смолы и агонист TLR3.

2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что агонист TLR3 представляет собой поли-A:U.

3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что живые ооцисты Eimeria представляют собой спорулирующие ооцисты.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что живые ооцисты Eimeria представляют собой одну или несколько, выбранные из группы, состоящей из: E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. brunetti, E. praecox, E. mivati, E. hagani, E. meleagrimitis 1, E. meleagrimitis 2, E. adenoides, E. gallopavonis и E. dispersa.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что композиция содержит между приблизительно 0,1 и приблизительно 1,6% масс./об. соли металла.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что композиция содержит фармацевтически приемлемый краситель.

7. Способ получения композиции по любому из пп. 1-6, включающий смешивание живых ооцист Eimeria и фармацевтически приемлемого носителя с агонистом TLR3.

8. Применение композиции по любому из пп. 1-6 для изготовления вакцины для домашней птицы против кокцидиоза.

9. Композиция по любому из пп. 1-6 для применения в качестве вакцины для домашней птицы против кокцидиоза.

10. Вакцина для домашней птицы против кокцидиоза, содержащая композицию по любому из пп. 1-6.

11. Вакцина по п. 10, содержащая 0,3-1,5% масс./об. ксантановой смолы и имеющая вязкость между 200-4000 мПа.с.

12. Способ вакцинации домашней птицы против кокцидиоза, отличающийся тем, что способ включает введение вакцины по п. 10 или 11 указанной домашней птице.

13. Способ вакцинации по п. 12, включающий введение вакцины посредством крупнокапельной струи на домашнюю птицу и/или в ее окружение.

14. Способ уменьшения у домашней птицы инфекции Eimeria или ассоциированных признаков заболевания, отличающийся тем, что способ включает введение вакцины по п. 10 или 11 указанной домашней птице.

15. Способ доставки агониста TLR3 в кишечник птицы пероральным способом, отличающийся тем, что агонист TLR3 является смешанным с композицией по п. 1.