Способ прогнозирования летального исхода у собак, больных эндокардиозом митрального клапана

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способу прогнозирования летального исхода у собак с эндокардиозом митрального клапана. Способ характеризуется тем, что определяют наличие или отсутствие отека легких, оценивают функциональный класс сердечной недостаточности, а также определяют пол животного. Вероятность развития летального исхода в течение 12 месяцев (у) рассчитывают по формуле:

2,43 - свободный коэффициент, 3,42; 1,49; 0,56 - коэффициенты регрессии, ОЛ - отек легких, причем ОЛ принимает значение, равное 1, если отек присутствует, и 0 - если отсутствует, П - пол больного животного, причем П принимает значение, равное 1 для самцов, и значение 0 - для самок, ФК - функциональный класс сердечной недостаточности, выраженный в условных единицах, при значении у≥0,5 прогнозируют высокий риск наступления летального исхода в течение 12 месяцев. Использование изобретения позволит прогнозировать вероятность наступления летального исхода у собак в течение года. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития летального исхода у собак, больных эндокардиозом митрального клапана.

Эндокардиоз или миксоматозная дегенерация митрального клапана, является наиболее распространенным приобретенным пороком сердца у собак (1). Данная патология имеет длительное течение, сложный патогенез, может осложняется синдромом застойной сердечной недостаточности, высокой легочной гиперетензией (2). При этом, болезнь имеет генетически наследуемую природу, болеют преимущественно карликовые и мелкие породы собак (3) и проявление данной патологии возникает в возрасте старше 5-6 лет (4). Следует отметить, что одним из важнейших методов диагностики эндокардиоза атриовентрикулярных клапанов сердца у собак, который позволяет верифицировать поражение клапанного аппарата, степень развития и прогрессировать кардиального ремоделирования, изменений внутрисердечной гемодинамики остается эхокардиография (5), дающая возможность оценить систолическую и диастолическую функцию сердца, особенности трасмитрального, транстрикуспидального, трансаортального и транспульмонального кровотока (6).

Врачам ветеринарной медицины и владельцам больных эндокардиозом собак всегда важно знать прогноз относительно продолжительности и качества их жизни (7). Зная риски формирования и прогрессирования сердечной недостаточности у собак больных, эндокардиозом митрального клапана, можно разрабатывать эффективные терапевтические и профилактические мероприятия (8, 9).

Из уровня техники известен способ прогнозирования летального исхода у собак, больных эндокардиозом митрального клапана (10), который базируется на выявление сывороточной концентрации натрийуретического предсердного фактора (NT-proBNP). Если концентрация этого аналита в сыворотке крови собак, больных эндокардиозом митрального клапана, составляет выше 1800 пг/мл, констатируют прогрессирующее течение синдрома застойной сердечной недостаточности с неблагоприятным исходом. Недостатком данного способа является недоступность и дороговизна диагностикумов для определения натрийуретического предсердного фактора (NT-proBNP), а также относительно невысокие показатели чувствительности данной модели прогнозирования.

Из уровня техники известен способ прогнозирования неблагоприятного исхода у больных эндокардиозом митрального клапана собак, базирующийся на выявлении в качестве предиктора кардиогенной кахексии (11). Резкое снижение подкожного жира и мышечной массы тела у больных эндокардиозом собак значительно снижает продолжительность и качество их жизни. Недостатком способа является его субъективность и недостаточная точность при начальных формах развития эндокардиоза митрального клапана у собак.

Из уровня техники известен способ прогнозирования неблагоприятного исхода у собак, больных эндокардиозом митрального клапана (12), который базируется на выявлении нарушений сердечного ритма в виде постоянной формы тахисистолической мерцательной аритмии. Недостатком способа является низкая эффективность в отношении предсказывания летального исхода от прогрессирования синдрома хронической сердечной недостаточность из-за относительно низкой распространенности мерцательной аритмии в популяции собак, больных эндокардиозом митрального клапана.

В качестве прототипа взят способ прогнозирования летальности исхода у больных эндокардиозом митрального клапана собак (13). Метод базируется на выявлении функционального класса синдрома хронической недостаточности по классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA). Верификация у больных эндокардиозом митрального клапана собак IV функционального класса хронической сердечной недостаточности свидетельствует о значительном снижении их выживаемости в течение 1 года наблюдения.

Недостатком данного способа является его недостаточная точность, так как на выживаемость большинства больных эндокардиозом собак значительное влияние могут оказывать другие неучтенные факторы риска.

Задача - разработать высокоинформативный метод прогнозирования летального исхода у собак, больных эндокардиозом митрального клапана.

Технический результат - разработанный нами способ позволяет повысить достоверность прогнозирования наступление летального исхода болезни в течение года после постановки первичного диагноза.

Для достижения технического результата в способе прогнозирования течения синдрома хронической сердечной недостаточности у собак, больных эндокардиозом митрального клапана, определяют факторы риска и вычисляют вероятность (у) летального исхода по формуле:

где: у - исходящий параметр модели, характеризующий выживание больных собак в течение 1 года;

2,43 - свободный коэффициент;

ОЛ - наличие отека легких;

П - пол;

ФК - функциональный класс синдрома хронической сердечной недостаточности, выраженный в условных единицах.

При значении исходящего параметра у≥0,5 - исход заболевания расценивали как неблагоприятный, а при у<0,5 - как благоприятный относительно выживания в течение 1 года.

Для построения модели прогноза использован метод бинарной логистической регрессии. В качестве предикторов летального исхода в популяции собак, больных эндокардиозом митрального клапана, рассматривали 30 показателей: пол, возраст, масса тела, наличие цианоза, отека легких, асцита, значительного расширения левого предсердия, функциональный класс синдрома хронической сердечной недостаточности, температура тела, частота сердечных сокращений, частота дыхательных движений, время обратного наполнения капилляров кровью, продолжительность зубца Р, интервалов PQ, QRS, QT, показатели конечно-дисатолического и конечно-систолического размера, фракции укорочения, конечно-диастолического и конечно-систолического объема, фракции выброса, размера левого предсердия, концентрации в крови гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, показатель СОЭ, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, концентрация в сыворотке крови мочевины и креатинина. Метод пошагового включения оставил в качестве независимых предикторов развития летального исхода 3 показателя, в частности наличие отека легких, пол, функциональный класс сердечной недостаточности.

Полученная модель прогноза характеризовалась высоким уровнем информативности (77,1%), чувствительности (68,3%) и специфичности (84,3%). При этом в 77,1% случаев модель позволяла предоставить верный прогноз относительно течения хронической сердечной недостаточности у собак, больных эндокардиозом митрального клапана. Достоверность модели 1 проанализирована с помощью критерия Фишера и коэффициента множественной корреляции (R). Проведенный анализ показал, что множественная корреляция была достаточно высокой и достоверной (R=0,85, р<0,0001). Стандартная ошибка модели составила 0,27. Критерий χ2 модели равен 73,6 из-за высокого уровня достоверности полученных результатов (р<0,0001).

Способ осуществляют следующим образом.

У собаки, больной эндокардиозом митрального клапана, клиническими методами определяют, функциональный класс сердечной недостаточности, наличие отека легких и учитывают пол.

Рассчитывают риск развития неблагоприятного исхода с учетом пола животного по формуле:

где: у - исходящий параметр модели, характеризующий выживание больных собак в течение 1 года;

2,43 - свободный коэффициент;

ОЛ - отек легких (1 - наличие; 0 - отсутствие);

П - пол больного животного (1 - самец; 0 - самка);

ФК - функциональный класс сердечной недостаточности, выраженный в услов. ед.

При значении исходящего параметра у≥0,5 - исход заболевания расценивали как неблагоприятный, а при у<0,5 - как благоприятный относительно выживания в течение 1 года. Результаты использования данного способа прогнозирования проиллюстрирована рядом клинических примеров.

Пример №1. Десятилетний самец собаки породы такса был доставлен в ветеринарную клинику в тяжелом состоянии. Отмечались симптомы острого респираторного дистресс-синдрома одышка, тахипноэ, ортопноэ, цианоз и бледность видимых слизистых оболочек, анорексия, полная непереносимость физических нагрузок. Температура тела 37,8°С, пульс 184 уд\мин, дыхание 94 раз/мин. Время обратного наполнения капилляров кровью составляло 4 с. Пальпаторно определен пульс малой амплитуды. Аускультативно ритм сердца регулярный, выраженный систолический шум в проекции митрального клапана (5 баллов из 6), разнокалиберные хрипы в легких. Методами клинической диагностики у собаки отмечено наличие отека легких, признаки кардиогенной кахексии. Функциональный класс сердечной недостаточности оценен как IV по классификации NYHA. Эхокардиографическим методом выявлена деформация и утолщение терминальных концов створок митрального клапана, митральная регургитация 4 степени, дилатация полости левого желудочка (конечно-дистолический размер 4,2 см), сохранная систолическая функция (фракция укорочения левого желудочка 63%), значительная дилатация левого предсердия (соотношение размера левого предсердия к корню аорты 2,4). Электрокардиографическим методом выявлено наличие синусовой тахикардии, повышение вольтажа зубца R, депрессия сегмента ST, инверсия зубца Т в отведении II. Общее состояние собаки было стабилизировано внутривенным введением фуросемида, ингаляцией кислорода. Собаке назначали пожизненную терапию пимобенданом, фуросемидом, верошпироном. Состояние животного значительно улучшилось, появился аппетит, значительно повысилась физическая активность, уменьшилась одышка. Был проведен прогноз выживаемости.

На основании имеющихся данных рассчитывался риск летального исхода в течение 1 года по формуле:

где:

ОЛ = 1;

П = 1;

ФК = 4.

Т.к. у>0,5 прогнозировали высокий риск летального исхода в течение 1 года. В процессе наблюдения за собакой через 149 дней наступил летальный исход вследствие прогрессирования синдрома сердечной недостаточности.

Пример №2. В ветеринарной клинике при плановом обследовании у семилетней самки собаки породы Кавалер-Кинг-Чарльз-спаниель был диагностирован грубый дующий систолический шум в проекции митрального клапана (громокость 5 из 6 балла). Собака хорошо переносила умеренные физические нагрузки. Температура тела 38,3°С, пульс 132 уд\мин, дыхание 31 раз/мин. Время обратного наполнения капилляров кровью составляло 1 с. Пальпацией диагностирован пульс нормальной величины. Аускультативно ритм сердца нерегулярный, дыхательная аритмия, снижение звучности первого и второго тона сердца. У собаки эхографическим и клиническим методом исключили наличие отека легких и асцита. Функциональный класс сердечной недостаточности оценен как I по классификации NYHA. Эхокардиографическим методом выявлено эксцентрическая гипертрофия полости левого желудочка (конечно-дистолический размер 4,1 см), сохранная систолическая функция левого желудочка (фракция укорочения 61%), дилатация левого предсердия (соотношение размера левого предсердия к корню аорты 1,9). Электрокардиографическим методом выявлено наличие синусовой дыхательной аритмии. Собаке был назначен пимобендан, пожизненно. Был проведен прогноз выживаемости.

На основании имеющихся данных рассчитывался риск летального исхода в течение 1 года по формуле:

где:

ОЛ = 0;

П = 0;

ФК = 1;

Т.к. у<0,5 прогнозировали низкий риск летального исхода в течение 1 года. В процессе наблюдения за животным в течение 31 месяца отмечали хорошее состояние. На момент подачи данной заявки на изобретение собака оставалась живой.

Пример №3. Оценка эффективности модели 1 проведена на новой репрезантивной выборке собак, больных эндокардиозом митрального клапана (n=96), осложненного синдромом хронической сердечной недостаточности разных функциональных классов (табл. 1). Значения выходного параметра у≥0,5 - исход заболевания расценивали как неблагоприятный, а при у<0,5 - как благоприятный относительно выживания в течение 1 года.

Полученная модель характеризовалась высоким уровнем информативности (77,1%), чувствительности (68,3%) и специфичности (84,3%). При этом в 77,1% случаев модель позволяла предоставить верный прогноз относительно течения хронической сердечной недостаточности. Сочетание высокой специфичности с менее высокой чувствительностью свидетельствовало, что прогнозирование несколько отклонялось в сторону гипердиагностики случаев с благоприятным прогнозом.

Полученные данные показывают, что некоторый процент больных животных не учитывается как потенциальные случаи с возможным летальным исходом болезни.

Таким образом, заявленный способ позволяет существенно повысить достоверность прогнозирования наступление летального исхода болезни в течение года после постановки первичного диагноза.

Список литературы

1. Boswood A, J, Gordon SG, Wess G, Stepien RL, Oyama MA, Keene BW, Bonagura J, MacDonald KA, Patteson M, Smith S, Fox PR, Sanderson K, Woolley R, Szatmári V, Menaut P, Church WM, O'Sullivan ML, Jaudon JP, Kresken JG, Rush J, Barrett KA, Rosenthal SL, Saunders AB, Ljungvall I, Deinert M, Bomassi E, Estrada AH, Fernandez Del Palacio MJ, Moise NS, Abbott JA, Fujii Y, Spier A, Luethy MW, Santilli RA, Uechi M, Tidholm A, Watson P. Effect of Pimobendan in Dogs with Preclinical Myxomatous Mitral Valve Disease and Cardiomegaly: The EPIC Study-A Randomized Clinical Trial. J Vet Intern Med. 2016 Nov; 30(6): 1765-1779. doi: 10.1111/jvim. 14586. Epub 2016 Sep 28. PMID: 27678080; PMCID: PMC5115200.

2. J, Boswood A, O'Grady M, O, Smith S, Swift S, Borgarelli M, Gavaghan B, Kresken JG, Patteson M, Ablad B, Bussadori CM, Glaus T, A, Rapp М, Santilli RA, Tidholm A, Eriksson A, Belanger MC, Deinert M, Little CJ, Kvart C, French A, Rønn-Landbo M, Wess G, Eggertsdottir AV, O'Sullivan ML, Schneider M, Lombard CW, Dukes-McEwan J, Willis R, Louvet A, DiFruscia R. Effect of pimobendan or benazepril hydrochloride on survival times in dogs with congestive heart failure caused by naturally occurring myxomatous mitral valve disease: the QUEST study. J Vet Intern Med. 2008 Sep-Oct; 22(5):1124-35. doi: 10.1111/j.1939-1676.2008.0150.x.Epub 2008 Jul 11. PMID: 18638016.

3. Borgarelli M, Savarino P, Crosara S, Santilli RA, Chiavegato D, Poggi M, Bellino C, La Rosa G, Zanatta R, Haggstrom J, Tarducci A. Survival characteristics and prognostic variables of dogs with mitral regurgitation attributable to myxomatous valve disease. J Vet Intern Med. 2008 Jan-Feb; 22(1):120-8. doi: 10.1111/j.1939-1676.2007.0008.x. PMID: 18289298.

4. Beaumier A, Rush JE, Yang VK, Freeman LM. Clinical findings and survival time in dogs with advanced heart failure. J Vet Intern Med. 2018 May; 32(3):944-950. doi: 10.1111/jvim.15126. Epub 2018 Apr 10. PMID: 29635788; PMCID: PMC5980388.

5. Boswood A, Gordon SG, J, Wess G, Stepien RL, Oyama MA, Keene BW, Bonagura J, MacDonald KA, Patteson M, Smith S, Fox PR, Sanderson K, Woolley R, Szatmari V, Menaut P, Church WM, O'Sullivan ML, Jaudon JP, Kresken JG, Rush J, Barrett KA, Rosenthal SL, Saunders AB, Ljungvall I, Deinert M, Bomassi E, Estrada AH, Fernandez Del Palacio MJ, Moise NS, Abbott JA, Fujii Y, Spier A, Luethy MW, Santilli RA, Uechi M, Tidholm A, Schummer C, Watson P. Longitudinal Analysis of Quality of Life, Clinical, Radiographic, Echocardiographic, and Laboratory Variables in Dogs with Preclinical Myxomatous Mitral Valve Disease Receiving Pimobendan or Placebo: The EPIC Study. J Vet Intern Med. 2018 Jan;32(l):72-85. doi: 10.1111/jvim.14885. Epub 2017 Dec 6. PMID: 29214723; PMCID: PMC5787203.

6. Chetboul V, Pouchelon JL, Menard J, Blanc J, Desquilbet L, Petit A, Rougier S, Lucats L, Woehrle F; TEST study investigators. Short-Term Efficacy and Safety of Torasemide and Furosemide in 366 Dogs with Degenerative Mitral Valve Disease: The TEST Study. J Vet Intern Med. 2017 Nov; 31(6):1629-1642. doi: 10.1111/jvim.14841. Epub 2017 Oct 4. PMID: 28975664; PMCID: PMC5697186.

7. Mattin MJ, Boswood A, Church DB, McGreevy PD, O'Neill DG, Thomson PC, Brodbelt DC. Degenerative mitral valve disease: Survival of dogs attending primary-care practice in England. Prev Vet Med. 2015 Dec 1; 122(4):436-42. doi: 10.1016/j.prevetmed.2015.05.007. Epub 2015 May 30. PMID: 26058819.

8. Wess G, Kresken JG, Wendt R, Gaugele J, Killich M, Keller L, Simak J, Holler P, Bauer A, Küchenhof H, Glaus T. Efficacy of adding ramipril (VAsotop) to the combination of furosemide (Lasix) and pimobendan (VEtmedin) in dogs with mitral valve degeneration: The VALVE trial. J Vet Intern Med. 2020 Nov; 34(6):2232-2241. doi: 10.1111/jvim.15863. Epub 2020 Sep 18. PMID: 32945575; PMCID: PMC7694822.

9. Sargent J, Muzzi R, Mukherjee R, Somarathne S, Schranz K, Stephenson H, Connolly D, Brodbelt D, Fuentes VL. Echocardiographic predictors of survival in dogs with myxomatous mitral valve disease. J Vet Cardiol. 2015 Mar; 17(1):1-12. doi: 10.1016/j.jvc.2014.11.001. Epub 2015 Jan 10. PMID: 25586168.

10. Mattin MJ, Boswood A, Church DB, Brodbelt DC. Prognostic factors in dogs with presumed degenerative mitral valve disease attending primary-care veterinary practices in the United Kingdom. J Vet Intern Med. 2019 Mar; 33(2):432-444. doi: 10.1111/jvim.15251. Epub 2018 Oct 24. PMID: 30357909; PMCID: PMC6430873.

11. Ineson DL, Freeman LM, Rush JE. Clinical and laboratory findings and survival time associated with cardiac cachexia in dogs with congestive heart failure. J Vet Intern Med. 2019 Sep; 33(5): 1902-1908. doi: 10.1111/jvim.15566. Epub 2019 Jul 17. PMID: 31317600; PMCID: PMC6766489.

12. Baron Toaldo M, Mazzoldi C, Romito G, Poser H, Contiero B, Cipone M, Guglielmini C. Echocardiographic predictors of first onset of atrial fibrillation in dogs with myxomatous mitral valve disease. J Vet Intern Med. 2020 Sep; 34(5): 1787-1793. doi: 10.1111/jvim. 15860. Epub 2020 Aug 7. PMID: 32767718; PMCID: PMC7517854.

13. Yu IB, Huang HP. Prevalence and Prognosis of Anemia in Dogs with Degenerative Mitral Valve Disease. Biomed Res Int. 2016; 2016:4727054. doi: 10.1155/2016/4727054. Epub 2016 Oct 20. PMID: 27840827; PMCID: PMC5093253.

Способ прогнозирования летального исхода у собак с эндокардиозом митрального клапана, характеризующийся тем, что определяют наличие или отсутствие отека легких, оценивают функциональный класс сердечной недостаточности, а также определяют пол животного, причем вероятность развития летального исхода в течение 12 месяцев (у) рассчитывают по формуле:

2,43 - свободный коэффициент,

3,42; 1,49; 0,56 - коэффициенты регрессии,

ОЛ - отек легких, причем ОЛ принимает значение, равное 1, если отек присутствует, и 0 - если отсутствует,

П - пол больного животного, причем П принимает значение, равное 1 для самцов, и значение 0 - для самок,

ФК - функциональный класс сердечной недостаточности, выраженный в условных единицах,

при значении у≥0,5 прогнозируют высокий риск наступления летального исхода в течение 12 месяцев.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к ветеринарным средствам, в частности к средству для лечения язвы у моногастричного животного. Средство характеризуется тем, что оно представляет собой суспензию, содержащую наноцеолит с размером частиц менее 100 нм в количестве 15 г/кг и метионин в количестве 0,14 г/кг.
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу лечения стерилизованных собак, имеющих новообразования на молочной железе. Способ характеризуется тем, что он предусматривает пероральное введение собакам витамина Д3 в дозе 25-50 МЕ/кг на протяжении 30 месяцев в сочетании с курсом химиотерапии препаратом «Доксорубицин» или хирургическим иссечением новообразования с захватом регионарных лимфоузлов, послеоперационной антибиотикотерапией и курсом химиотерапии препаратом «Доксорубицин».

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к животноводству, в частности способу повышения жизнеспособности новорожденных ягнят к переохлаждению. Способ повышения жизнеспособности ягнят к переохлаждению включает проведение стрижки маток за 3 недели до окота, причем способ позволяет повысить жизнеспособность организма к переохлаждению у новорожденных ягнят и уменьшить число павших ягнят в результате переохлаждения.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к способу предупреждения прогрессии ацидоза у эмбрионов кур мясного направления. Способ характеризуется тем, что поверхность продезинфицированной скорлупы инкубационных яиц за 2-3 часа до инкубации орошают из пульверизатора водным раствором сукцината аммония в концентрации 1%, полученным путем предварительного растворения сукцината аммония в дистиллированной воде при температуре 18-22°С.

Изобретение относится к ветеринарной хирургии. Выполняют подготовку операционного поля, оттеснение семенников в паховую область с одновременным оттягиванием дна мошонки в противоположную сторону, выполнение циркулярного разреза в середине шейки мошонки с рассечением кожи, мускульно-эластической оболочки и фасции мошонки и смещение их к нижней части семенников без рассечения общей влагалищной оболочки.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к водоразбавимому средству для лечения и профилактики некробактериоза копыт на полимерной основе. Средство содержит стабилизированные золи наночастиц серебра, меди и цинка, поливинилацетатную дисперсию, повидон-йод, ксантановую камедь, цитрат натрия и воду.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу тораскопического доступа в плевральную полость для проведения диагностических исследований и хирургических вмешательств на органах грудной полости у кошек и собак. Способ характеризуется тем, что используют видеоэндоскопическое оборудование, троакар, гибкий эндоскоп с рабочим каналом и волоконной оптикой.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для коррекции кифотической деформации в грудном отделе позвоночного столба у растущих собак. В ходе коррекции кифотической деформации в области деформации осуществляют трансторакальный доступ к телам позвонков, с обнажением их вентро-латеральной поверхности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ протезирования мягких тканей животных с использованием биополимерной пленки, являющейся результатом жизнедеятельности целлюлозопродуцирующих бактерий штамма Acetobacter xylinum.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования степени тяжести течения острого бактериального холангиогепатита у кошек. Для этого гематологическим методом диагностики определяют скорость оседания эритроцитов, активность в сыворотке крови аспарагиновой аминотрансферазы, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы и рассчитывают вероятность (у) развития осложнений по разработанной формуле.

Изобретение относится к области медицинской паразитологии, ветеринарии, биотехнологии. Описан способ диагностики возбудителей дирофиляриоза, включающий ПЦР в режиме реального времени с помощью предлагаемых праймеров, специфичных для каждого вида дирофилярий и состоящих из двух пар видовых праймеров: для Dirofilaria repens (F2690DR) 5’- АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’ (R2812DR) 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’ для Dirofilaria immitis(F2690DI) 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’(R2812DI) 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’.Выявление осуществляют автоматически в ходе проведения ПЦР на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации специфичных для D. repens и D. immitis со специфическими праймерами. В случае наличия в пробе ДНК D. Repens, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DR/R2812DR, а в случае наличия в пробе ДНК D. Immitis, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DI/R2812DI. Предварительно подготавливают исследуемую ДНК. Для этого осуществляют промывку нативных гельминтов однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживание при температуре -20±2°С. Затем механическое перетирание и гомогенизация до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия) для постановки ПЦР. Кроме того, ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen – 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер видовой F (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер видовой R (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл. При этом ПЦР проводят с соблюдением режимов:- денатурация при 95°С - 5 мин (1 цикл);- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95°С - 10 с, отжиг при 60°С - 10 с, синтез при 72°С - 30 с;- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90°С - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5°С/10 с;- хранение при 10°С.Изобретение может быль использовано при молекулярно-генетической диагностике возбудителей дирофиляриоза, а также для межвидовой дифференциации видов Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis. Технический результат предлагаемого изобретения заключается в достоверном выявлении видов возбудителей дирофиляриоза D. repens и D. Immitis. 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.
Наверх