3-циано-4-гидрокси-1,4-дигидро-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин, соединение, обладающее антигликирующей и антигликоксидационной активностями

Изобретение относится к области органической химии, а именно к 3-циано-4-гидрокси-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазину формулы 1, который обладающей антигликирующей и антигликоксидационной активностями. Технический результат: обеспечение антигликирующей и антигликоксидационной активностей соединением формулы 1. 1 ил., 6 табл., 1 пр.

 

1. Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биологически активных соединений, перспективных для создания на их основе лекарственных препаратов, и касается 3-циано-4-гидрокси-[1,2,4]триазоло[5,1с][1,2,4]триазина, обладающего антигликирующим, антигликооксидационным действиями, что делает его перспективным для дальнейшей разработки на его основе лекарственного препарата. Это может быть перспективно при лечении поздних осложнений сахарного диабета, болезней пожилого возраста или некоторых форм симптоматических протеинопатий (отдельные формы нейродегенеративных состояний).

Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских лабораториях, в лечебных учреждениях(второе - при условии проведения расширенных и углубленных исследований). Данные, представленные в документе, нацелены на представление и защиту авторских прав в отношении указанных механизмов биологической активности соединения 3-циано-4-гидрокси-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазина.

2. Уровень техники

Реакция между свободными аминогруппами белков и альдо- или кетогруппами альдоз или кетоз, а также специфическими видами карбонильных соединений известна как реакция гликирования [John W. G, Lamb Е. J. // Eye. - 1996. - Vol. 7. - P. 230-237]. Гликирование имеет высокое значение в биологии, медицинской и органической химии, является источником патобиологически активных конечных продуктов гликирования (КПГ), задействованных в патогенезах поздних осложнений сахарного диабета и некоторых нейродегенерацияха.

Общие сведения о механизмах гликирования. Антигликоксидационная активность

Известно множество механизмов протекания реакции гликирования. В их числе нижеперечисленные пути:

а) Путь Ходжа - на ранней стадии пути глюкоза (или другие моносахариды) реагирует со свободной аминогруппой биологических аминов по механизму нуклеофильного присоединения, с обратимым образованием основания Шиффа (альдимин, или альфа-гидроксимин). Этапы реакции протекают при различных значениях рН, от слабо щелочных (инициация) до слабо кислых (поздние этапы). В условиях закисления среды происходит перегруппировка Амадори с образованием соответствующего альдимину кетамина. Если не происходит их распад или участие в прочих реакциях, то в поздней стадии гликирования из продуктов Амадори путем окисления, циклизации, дегидратации образуются соединения, называемые конечными продуктами гликирования (КПГ) [Н.А. Ансари, З. Рашид, Биомедицинская химия, 2010, Т. 56, С. 168-178; Singh V.Р., Bali A., Singh К, etal. // Korean J. Physiol. Pharmacol. - 2014. - Vol. 18. - P. 1-14].

б) Путь Намики - при данном варианте после протекания нуклеофильного присоединения и образования альдимина продукт не преобразуется в кетамин, а разрушается с образованием более активных, чем моносахариды, короткоцепочечных карбонильных соединений (глиоксаль, гликоэльдегид) [Ott С, Jacobs K, Haucke Е, Navarrete Santos A, Grune Т, Simm A. Role of advanced glycation end products in cellular signaling. Redox Biol. 2014 Jan 9;2:411-29. doi: 10.1016/j.redox.2013.12.016. eCollection 2014]. Данные карбонильные соединения реагируют со свободными аминогруппами, образуя КПГ. Путь катализируется основным катализом через ретро-альдольную деконденсацию (в присутствии фосфат-анионов).

в) Путь Вольфа (иначе именуемый ендиол-альфакетоальдегидный [дикетонный] путь) - при этом варианте моносахариды до взаимодействия с субстратом гликирования, окисляясь под действием АФК, переходных металлов (Cu²⁺ и др.) превращаются в альфа-дикарбонильные соединения (альфакетоальдегиды) [S Р Wolff, R T Dean. Glucose autoxidation and protein modification. The potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes. Biochem J. 1987; 245(1); 243-250]» Которые Далее вступают в реакцию нуклеофильного присоединения с аминогруппами белков, образуя КПГ.

г) Окислительный распад продуктов Амадори - процесс, интенсивно протекающий в условиях рН 4-6. В нормальных условиях интенсивность данной реакции не превышает 10% [ChoSJ, RomanG, YeboahF, KonishiY. Theroadtoadvancedglycationendproducts: amechanisticperspective. Curr Med Chem. 2007; 14(15):1653-71]. В данном механизме активное участие принимают переходные металлы, и инициируемые ими реакции продукции АФК, в том числе реакция Фентон.

д) Прочие пути - путь Бимеля, неокислительный распад продуктов Амадори, путь образования арабинозы из продуктов Амадори, иные, на данный момент не установленные механизмы.

Реакция нуклеофильного присоединения и дальнейшие преобразования продуктов по описанным путям с получением конечного результата - образования КПГ - способны протекать в условиях отсутствия ускоряющих факторов. Однако переходные элементы способны выступать ускорителями течения гликирования. Они способны образовывать короткоживущий промежуточный комплекс между альдозой и свободной аминогруппой аминокислотного остатка (начальный этап путей Ходжа и Намики) [Дж. Кендлин, К. Тейлор, Д. Томпсон. Реакции координационных соединений переходных металлов. Перевод с англ. Под ред. А.Н. Ермака. Изд-во Мир. 1970. 392 с]. Распад продуктов Амадори с образованием карбонильных соединений, аутоокисление глюкозы (путь Вольфа), окисление продуктов Амадори как этап пути Ходжа - также механизмы, ускоряющиеся при участии катиона переходных металлов. Согласно данным литературы, гликирование при участии металлов переходного ряда характерно для гликоксидации [AI Serban, Е Condac, М Costache, A Dinischiotu. The relationship between ages, Cu2+ and crosslinking of collagen. Revue Roumaine de Chimie. 2009. 54(l):93-10l].

Учитывая это, способность влиять на катионы элементов, ответственные за образование активных форм кислорода дает возможность замедлить формирование КПГ, дополнить совокупный антигликирующий, и сформировать антигликооксидационный потенциал соединения [Wan-JuYeh, Shih-MinHsia, Wei-HwaLee, Chi-HaoWu. Polyphenols with antiglycation activity and mechanisms of action: A review of recent findings. Journal of Food and Drug Analysis. 2017. Vol. 25(1), P. 84-92].

3-циано-4-гидрокси-1,4-дигидро-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин и известная биологическая активность его близких аналогов

Настоящие материалы представляют соединение, 3-циано-4-гидрокси-1,4-дигидро-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин, как биологически активное вещество, проявляющее антигликирующее и антигликоксидационное действия. Наличие данных механизмов делает соединение перспективным для дальнейшего исследования на наличие способности оказывать лекарственный эффект в условиях заболеваний, ассоциированных с КПГ, например, поздних осложнений сахарного диабета или болезни Альцгеймера.

Ранее в ряду аналогов основного соединения (азоло-1,2,4-триазинов) уже была установлена иная биологическая активность, а именно известны соединения, обладающие противовирусным действием. Противовирусный препарат Триазавирин - 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-ОН, дигидрат [О.Н. Чупахин, В.Л. Русинов, В.Н. Чарушин, Е.Н. Уломский, А.Ю. Петров, О.И. Киселев, Патент РФ 2294936 от 10.03.2007], Зарегистрирован в реестре лекарственных средств РФ, как препарат для лечения гриппозной инфекции [№ Гос. регистрации ЛП-002604].

Отбор препаратов сравнения, соответствующих уровню техники

Согласно оцениваемому механизму, для исследования надлежит отбирать релевантные препараты сравнения. Несмотря на то, что на сегодняшний день нет клинически одобренных препаратов, целенаправленно угнетающих образование КПГ, лекарственные средства с данным механизмом (аминогуанидин и др.) находились на дорегистрационных фазах клинических испытаний, хоть и не были одобрены ввиду наличия побочных эффектов. Это, однако, не является препятствием к их использованию в качестве соединений/препаратов сравнения. Среди используемых в клинической практике препаратов проводился поиск наличия анти-КПГ активности у ряда сартанов (валсартан, эпросартан и др.), липоевой кислоты [L. Parengkuan, M. Yagi, М. Mohammad, Shin-ichiAsahi, Y. Yonei. Angiotensin receptor blockers (ARBs), angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors, and statins as anti-glycation agents. Glycative Stress Research 2014; 1 (4): 90-95; H. Ghelani, V. Razmovski-Naumovski, R.R. Pragada, S. Nammi. (R)-α-Lipoic acid inhibits fructose-induced myoglobin fructation and the formation of advanced glycation end products (AGEs) in vitro. BMCComplementAlternMed. 2018; 18: 13].

Эффект является слабым, проявляющимся, вероятно, по множеству возможных механизмов (нет единого механизма анти-КПГ активности в ряду препаратов), и зависимым от особенностей (условий протекания) реакции гликирования, а потому данные препараты сложно использовать в качестве стандартов и референтов. Однако подбор условий реакционной среды, в которой соединение/препарат проявит себя в полной мере, позволяет использовать в качестве референтов и данные лекарственные средства. К таким условиям можно отнести применение лекарственных препаратов, для которых способность к хелатированию известна (например, она известна для сартанов -эпросартан, лозартан и др.).

3. Сущность изобретения

Техническим результатом данного изобретения является создание нового химического соединения азолоазиниевого ряда - 3-циано-4-гидрокси-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазина 1, обладающего антигликирующей и антигликоксидантной биологическими активностями, полезными с целью контроля за образованием КПГ и лечения заболеваний, по патогенетическому механизму связанных с образованием и действием КПГ.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Заявляемое соединение 3-циано-4-гидрокси-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин 1 получено по следующей схеме: соль 1,2,4-триазолил-5-диазония 2, полученная из соответствующего 3-амино-1,2,4-триазола 3 действием нитрита натрия или калия в присутствии 12 М соляной кислоты, конденсируют с 1-морфолин-2-цианоэтиленом в ацетонитриле.

Пример 1. Методика синтеза 3-циано-4-гидрокси-1,4-дигидро-[1,2,4]триазоло[5,1-с] [1,2,4]триазина (1)

К смеси 0.84 г (0.01 моль) 3-амино-1,2,4-триазола, 5 мл воды, 5 мл ацетонитрила и 10 мл конц. HCl (0.12 моль) порциями прибавляют раствор 0.75 г (0.011 моль) NaNO₂ в 3 мл воды при -7÷-10°С. Реакционную массу выдерживают при этой температуре 10 мин и прибавляют к ней раствор 1.38 г (0.01 моль) 1-морфолин-2-цианоэтилена в 25 мл ацетонитрила. Смесь выдерживают при температуре 0°С 3 часа, затем при комнатной температуре 12 часов. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом. Этилацетат упаривают досуха, осадок перекристаллизовывают из ацетонитрила, фильтруют и сушат на воздухе. Выход 1,26 г (77%), порошок светло-коричневого цвета, имеет следующие физико-химические характеристики: Т_пл=165-167°С (разл.); ¹Н ЯМР спектр (в ДМСО-d6 δ, м.д.): 13.25 (с, Н, NH), 8.12 (д, Н, ОН, J=8.5 Гц), 7,96 (с, Н, СН), 6.53 (д, 2Н, J=8.5 Гц, СН₂); ¹³С ЯМР спектр (в ДМСО-d6 δ, м.д.): 150.58, 145.45, 117.77, 115.64, 73.64. Найдено: С - 36.88; Н - 2.44; N - 51.62. Брутто-формула - C₅H₄N₆O. Вычислено: С - 36.59; Н - 2.46; N -51.21.

5. Методики изучения биологической активности

5.1. Модели образования КПГ по механизмам гликирования и гликоксидации

Тесты определения антигликирующей и антигликооксидационной активностей нацелены на выявление способности соединения замедлять образование веспер-лизиновых КПГ (в случае модельного белка бычьего сывороточного альбумина) и веспер-лизиновых и пентозидиновых КПГ (в случае использования гидролизатов сухожилий или хрусталиков, содержащих долгоживущие белки - фракции коллагена и кристаллина) в разных условиях протекания реакции и объединены общим методом детекции присутствия КПГ - спектрофлуориметрией (спектрофлуориметр Infifnite Pro 220 TECAN, Австрия). Различия в условиях протекания реакций предполагают протекание гликирования по разным вариантам течения реакции, и методологически различаются наличием/отсутствием ключевых лимитирующих факторов, определяющих протекание реакции. К вариантам гликирования, воспроизведенным в настоящем исследовании относятся (i) гликирование с вовлечением фосфат-анионов, потенцирующих образование промежуточных КПГ-прекурсоров - реактивных карбонильных соединений; (ii) гликирование в присутствии кислой среды реакции, с участием катионов элемента с переходной валентностью - Cu²⁺ (гликооксидация). Различия определены также разными субстратами проведения реакции гликирования: основной белок-субстрат гликирования -бычий сывороточный альбумин (фракция V, далее БСА), используемый в скрининговых и углубленных исследованиях антигликирующей активности, а также гидролизат очищенного биологического материала сухожилий хвоста крыс, содержащий в качестве основного белка фракции коллагена, и гидролизат выделенных хрусталиков крыс, в качестве основного содержащий белки фракций кристаллина. Согласно данным литературы, с наибольшей вероятностью подтвердить антигликирующее действие применяя флуоресцентную детекцию КПГ, при этом минимизировать интерференцию результатов, можно применяя две длины волн возбуждения и испускания - 335/385 нм (пентозидин-подобные КПГ), и 370/440 нм (весперлизин-подобные КПГ) [Sero L, Sanguinet L, Blanchard P, et al. Tuning a 96-well microtiter plate fluorescence-based assay to identify AGE inhibitors in crude plant extracts. Molecules. 2013; 18(11):14320-14339. Published 2013 Nov 19. doi:10.3390/molecules181114320]. данный подход применен при оценке антигликирующего действия на гидролизатах тканей с высоким содержанием фракций коллагена или кристаллина.

5.1.1. Гликирование БСА глюкозой в фосфатном буферном растворе рН 7.4

Методика является стандартной и распространенной при in vitro изучении антигликирующих свойств, ранее неоднократно описана [Savateev K.V._; Fedotov V.V., Butorin I., Eltsov O.S., Slepukhin P.A., Ulomsky E.N., Rusinov V.L., Litvinov R.A., Babkov D.A., Khokhlacheva E.A., Radaev P., Vasilev P.M., Spasov A.A. Nitrothiadiazolo[3,2-a]pyrimidines as promising antiglycating agents. European Journal of Medicinal Chemistry. 2020. T. 185. C. 111808; Spasov A.A., Brel A.K., Litvinov R.A., Lisina S.V., Kucheryavenko A.F., Budaeva Yu.N., Salaznikova O.A., Rashchenko A.I., Shamshina D.D., Batrakov V.V., Ivanov A.V. Evaluation of N-hydroxy-, N-metoxy-, and N-acetoxybenzoyl- substituted derivatives of thymine and uracil as new substances for prevention and treatment of long-term complications of diabetes mellitus. Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2018. T. 44. №6. c. 769-777]. Субстрат гликирования: БСА (1 мг/мл); индуктор гликирования: глюкоза (0,5 М); среда протекания реакции: фосфатный буферный раствор (0,05 М, рН 7.4); условия протекания реакции: температура 60°С; длительность инкубации: 24 часа; вещество сравнения: аминогуанидин; растворитель для объекта исследования: диметилсульфоксид (далее ДМСО, содержание в конечной среде реакции 3%, ДМСО замедляет течение свободнорадикальных реакций [Phillis JW, Estevez AY, O'Regan MH. Protective effects of the free radical scavengers, dimethyl sulfoxide and ethanol, in cerebral ischemia in gerbils. Neurosci Lett. 1998 Mar 13; 244(2): 109-11.]). Оценка активности объекта исследования и вещества сравнения дана в диапазоне концентраций 10-1000 мкМ. После постановки реакции гликирования БСА осаждали при помощи трихлоруксусной кислоты, концентрация 6,1 М (далее ТХУ) и центрифугирования 15000 rpm (4°С, 4 мин) (центрифуга Sigma, Япония). Супернатант удаляли аспирацией. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе (рН 10.5), аликвоты вносили в 96-луночный планшет (GreinerFlatBlack, 96), определяли флуоресценцию веспер-лизин-подобных КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 370-440 нм соответственно.

5.1.2. Гликоксидация БСА глюкозой в HEPES-буферном растворе рН 5.8, содержащем Cu²⁺ (преинкубация катионов Cu²⁺с БСА) -основная методика

Методика является модификацией представленной выше модели гликирования, при этом в ней при образовании КПГ значительный вклад отведен присутствующим в реакционной среде катионам меди (II) [Литвинов Р.А., Косолапое В.А, Муравьева Е.А., Скачко И.В., Шамшина Д.Д. Модифицированный метод изучения реакции гликоксидации. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2020. №2 (74). с. 61-66.] При описываемом варианте гликирования раствор CuSO₄*5H₂O преинкубировался с БСА, что обеспечило возможность предварительного образования комплекса «БСА»-«Cu²⁺». Реакция гликирования в отсутствие меди в среде ввиду изначально кислой рН среды замедленна, что делает присутствие меди лимитирующим фактором.

Субстрат гликирования: БСА (1 мг/мл); индуктор гликирования: глюкоза (0,5 М); среда протекания реакции: HEPES-буферный раствор (2,4 гр на 100 мл, рН 5,8), с содержанием CuSO₄*5H₂O (10 мг/л); условия протекания реакции: температура 60°С; длительность инкубации: 24 часа; вещество сравнения: эпросартан; растворитель для объекта исследования: деионизированная вода. Оценка активности объекта исследования и вещества сравнения дана в диапазоне концентраций 10-1000 мкМ. После постановки реакции гликирования БСА осаждали при помощи ТХУ и центрифугирования 15000 rpm (4°С, 4 мин) (центрифуга Sigma, Япония). Жидкую фракцию аспирировали для устранения избытка глюкозы и изучаемого соединения. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе (рН 10.5), аликвоты вносили в 96-луночный планшет (GreinerFlatBlack, 96), определяли флуоресценцию веспер-лизин-подобных КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 370-440 нм соответственно.

5.1.3. Гликирование растворимого гидролизата сухожилий хвоста крыс, содержащего коллаген, глюкозой в фосфатном буферном растворе рН 7.4

Методика является подтверждением результатов, полученных на субстрате гликирования БСА в тех же условиях, но с использованием гидролизата тканевого материала, содержащего высокий процент коллагена. Субстрат гликирования: гидролизат коллагена хвоста крыс (исходно биоматериала 1 мг/мл) (приготовление гидролизата - см. приложение I); индуктор гликирования: глюкоза (0,5 М); среда протекания реакции: фосфатный буферный раствор (0,05 М, рН 7.4); условия протекания реакции: температура 60°С; длительность инкубации: 24 часа; вещество сравнения: аминогуанидин; растворитель для объекта исследования: ДМСО. Оценка активности объекта исследования и вещества сравнения дана в концентрации 1000 мкМ (для I дополнительно проведен расчет IC₅₀). После постановки реакции гликирования, коллаген осаждали при помощи ТХУ (1:3 по объему кислота: проба) и центрифугирования 15 300 rpm (4°С, 8 мин) (центрифуга Sigma, Япония). Жидкую фракцию незамедлительно аспирировали (не допуская нагрева эппендорфов до комнатной температуры) для устранения избытка глюкозы, изучаемого соединения, а также исключения риска интерференции результатов за счет вовлечения в гликирование альфа-аминогрупп аминокислот, находящихся в жидкой фракции в неосаждаемом виде. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе (рН 10.5), аликвоты вносили в 96-луночный планшет (GreinerFlatBlack, 96), определяли флуоресценцию веспер-лизин-подобных КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 370-440 нм и пентозидин-подобных КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 335-385 нм соответственно.

5.1.4. Гликирование растворимого гидролизата белков хрусталиков крыс, содержащих кристаллин, глюкозой в фосфатном буферном растворе рН 7.4

Методика нацелена на подтверждение результатов, ранее полученных на субстрате гликирования БСА в тех же условиях, но с использованием гидролизата тканевого материала, содержащего высокий процент кристаллина. Субстрат гликирования: гидролизат белков хрусталиков крыс (исходно биоматериала 1 мг/мл) (получение гидролизата - см. приложение II); индуктор гликирования: глюкоза (0,5 М); среда протекания реакции: фосфатный буферный раствор (0,05 М, рН 7.4); условия протекания реакции: температура 60°С; длительность инкубации: 24 часа; вещество сравнения: аминогуанидин; растворитель для объекта исследования: ДМСО. Оценка активности объекта исследования и вещества сравнения дана в концентрации 1000 мкМ (для I дополнительно проведен расчет IC₅₀). После постановки реакции гликирования кристаллин осаждали при помощи ТХУ (1:10 по объему кислота: проба) и центрифугирования 15000 rpm (4°С, 4 мин) (центрифуга Sigma, Япония). Жидкую фракцию аспирировали для устранения избытка глюкозы, изучаемого соединения, а также исключения риска интерференции результатов за счет вовлечения в гликирование альфа-аминогрупп аминокислот, находящихся в жидкой фракции в не осаждаемом виде. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе (рН 10.5), аликвоты вносили в 96-луночный планшет (GreinerFlatBlack, 96), определяли флуоресценцию веспер-лизин-подобных КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 370-440 нм и пентозидин-подобных КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 335-385 нм соответственно.

Анализ данных при оценке антигликирующей активности

Во всех случаях прирост уровня КПГ в опытных пробах (содержащих индуктор гликировния) в сравнении с холостыми пробами (не содержащими индуктор гликирования) определяли по формуле:

I_fly=10 ^{(log10(test)-log10(mean blank))}.

где I_fly - относительная степень прироста флуоресценции в опытной пробе за счет нарастания концентрациивеспер-лизиновых или пентозидиновых КПГ в сравнении с холостой пробой, test-опытная (или контрольная) проба, содержавшая индуктор гликирования, mean blank-среднее значение соответствующих опытной (или контрольной) пробе холостых проб, не содержавших индуктор гликирования.

Далее проводили сравнительную оценку активности соединения и вещества сравнения, сопоставляя показатели I_fly для эквимолярных концентраций, сравнивая данные посредством многогруппового Краскела-Уоллиса (пост-тест Данна). Активность соединения и вещества сравнения выражали в процентах. Для определения зависимости «активность-концентрация» в тестах гликирования/гликооксидации БСА строили кривые зависимости активности от концентрации, определяли IC₅₀. Расчеты проводили в пакете программ GraphPadPrism 7.0.

5.2. Оценка цитотоксичности

Ввиду характера разработки и позиционирования продукта в качестве основы для создания лекарственного средства, на этапе оценки активности in vitro желательна оценка токсического действия. В условиях in vitro приемлемым вариантом оценки токсического действия является поиск цитотоксичности.

5.2.1. Оценка влияния соединения на жизнеспособность клеток с помощью определения их метаболической активности (МТТ-тест)

Использование альтернативных методов изучения токсичности веществ в ходе исследования имеет практическое значение для разработки подходов ускоренного изучения их фармакологических свойств. Изучение токсичности веществ с применением клеточных культур позволяет сократить использование лабораторных животных, время проведения эксперимента, финансовые затраты при относительной близости получаемых в конечном счете данных. На раннем доклиническом этапе тест необходим в качестве показательного при определении токсического действия. В связи с этим, является актуальным исследование цитотоксичности соединения I и аминогуанидина в сравнении с цитостатиком доксорубицином, с дальнейшим определением нецитотоксических концентраций. В основе метода МТТ лежит способность живых клеток при помощи НАДФ-Н-зависимых оксиредуктазных ферментов восстанавливать желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в фиолетовые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана, нерастворимые в воде. При лизисе клеток кристаллы формазана легко переходят в раствор органических растворителей (ДМСО, изопропанол). По данным оптической плотности определяется активность митоходриальных дегидрогеназ и, соответственно, жизнеспособность клеток. Анализ произведен с использованием первичной культуры клеток HSF (фибробласты кожи человека).

В ходе работы производилось культивирование в полной питательной среде ЕМЕМ в культуральном флаконе до образования монослоя (85-90%), после чего осуществлялось внесение клеточной суспензии в количестве 10000 клеток в лунку планшета, с последующей 24 часовой инкубацией в СО₂-инкубаторе для адгезии клеток ко дну планшета. По истечению 24 часов инкубации производилось внесение в лунки исследуемых соединений в необходимых концентрациях (n=4). В контрольные лунки вносился эквивалентный объем растворителя, с последующей инкубацией в течение 48 часов. По истечению 48 часов инкубации производилось удаление культуральной среды и внесение реакционной смеси в каждую лунку, с последующей инкубацией, по истечении которой в каждую лунку планшета вносился ДМСО. Далее анализировалось поглощение растворов при 555 нм против 650 нм референсных при помощи планшетного ридера. Процент жизнеспособных клеток в каждой опытной лунке рассчитывался относительно положительного контроля (100% живых клеток). Производилось построение кривыхзависимости жизнеспособности клеток (в % относительно контроля) от концентрации добавленных соединений. Рассчитывали IC₅₀ веществ (концентрацию, ингибирующую пролиферацию 50% клеток).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения MARS DataAnalysisSoftware, GraphPadPrism5.0. Использовали метод нелинейного регрессионного анализа, межгрупповое сравнение проводили с применением критерия Краскела-Уоллиса с постобработкой тестом Данна.

6. Результаты исследования биологической активности

6.1. Оценка влияния на механизмы образования КПГ

6.1.1. Гликирование глюкозой в фосфатном буферном растворе рН 7.4

Известно, что множество факторов вносит вклад в гликирование, в частности, фосфат-анионы и рН. В данной реакционной среде при описанных условиях установлено, что активность аминогуанидина в максимальной концентрации составила величину 30%, и не достигла значений полуингибирования реакции. В то же время соединение I показало в 2 раза более высокую активность в максимальной изученной концентрации, и было более чем в 3 раза активнее по показателю IC₅₀, чем выбранный референт (Табл. 1).

6.1.2. Гликирование глюкозой в буферной среде HEPES в присутствии Cu²⁺, рН 5.8 (гликоксидация)

Согласно данным Литературы [A.I. Serban, Б. Condac, М. Costache, A. Dinischiotu. Therelationshipbetweenages, Cu2+ andcrosslinkingofcollagen. Revue Roumaine de Chimie 54(l):93-10l], гликирование в среде, обогащенной медью, благодаря свойствам данного катиона, может быть расценено как гликооксидация.

В результате постановки методики гликооксидации установлено, что соединение проявляет активность, в 4,9 раза превосходящую дополнительный референт эпросартан и в 2,3 раза - основной референт аминогуанидин по показателю IC₅₀ (Табл. 2).

В ходе исследования отмечено, что основной референт аминогуанидин при тестовых длинах волн образует не идентифицированные флуоресцирующие соединения в рабочем диапазоне длин волн, создающие иллюзию отсутствия антигликирующей активности. Известно, что аминогуанидин в присутствии катионов меди теряет антигликирующую активность в условиях гликирования альбумина глюкозой [Jakus V, Bauerova K, Rietbrock N. Effect of aminoguanidine and copper (II) ions on the formation of advanced glycosylation end products. In vitro study on human serum albumin. Arzneimittelforschung. 2001; 51(4):280-3] (данные не приводятся).

6.1.3. Гликирование растворимого гидролизата сухожилий хвоста крыс глюкозой в фосфатном буферном растворе рН 7.4

Фракции коллагена составляют основу сухожильного материала. Согласно данным литературы, гликирование коллагена вносит значительный вклад в формирование многих КПГ-ассоциированных патологий, например микрососудистых поздних осложнений сахарного диабета, в частности, нефропатии [Makita Z, Radoff S, Rayfield EJ, et al. Advanced glycosylation end products in patients with diabetic nephropathy. NEnglJMed, 1991, 325, 836-842]. Состав коллагена отличен от модельного альбумина, аминокислоты, традиционно рассматриваемые в качестве мишеней для гликирования в нем присутствуют в меньшем количестве: аргинин и лизин, кроме этого коллаген не содержит триптофан. Данные о результатах исследования приведены в Табл. 3. Данное исследование подтверждает способность соединения I подавлять образование КПГ в коллагене, как в релевантном субстрате для сосудистых патологий, связанных с накоплением КПГ.

Установленная в настоящем исследовании активность препарата сравнения аминогуанидина соответствует данным литературы о том, что аминогуанидин с большей силой подавляет образование пентозидин-подобных КПГ, чем веспер-лизин-подобных КПГ [Rouger С, Charreau В., Pabois A., Cauchy Т., Litaudon М., Awang K., Richomme P. Lepidotol A from Mesualepidota Inhibits Inflammatory and Immune Mediatorsin Human Endothelial Cells. JNatProd. 2015; 78(9):2187-97]. Для I установлена более высокая активность в отношении обоих типов КПГ, чем для аминогуанидина, однако динамика распределения активностей указывает на более выраженную способность подавлять образование веспер-лизина. IC₅₀ соединения I подтверждает данное заключение, составляя 1733,9 мкМ в отношении пентозидин-подобных КПГ, и 798,0 мкМ в отношении весперлизин-подобных КПГ.

6.1.4. Гликирование растворимого гидролизата хрусталиков глюкозой в фосфатном буферном растворе рН 7.4

Хрусталики содержат фракции кристаллина в количестве более 90% [Hoehenwarter W, Klose J, Jungblut PR. Eye lens proteomies. Amino Acids. 2006; 30(4):369-389. doi:10.1007/s00726-005-0283-9]. Кристаллин является биологически релевантной мишенью для гликирования при изучении потенциала соединения подавлять образование КПГ в хрусталиках. Известно, что гликирование принимает участие в механизме формирования катаракты, в частности возрастной и диабетической форм [Jansirani, Р. H. Anathanaryanan. A comparative study of lens protein glycation in various forms of cataract. Indian J Clin Biochem. 2004 Jan; 19(1): 110-112; Perry RE, Swamy MS, Abraham EC. Progressive changes in lens crystallin glycation and high-molecular-weight aggregate formation leading to cataract development in streptozotocin-diabetic rats. ExpEyeRes. 1987 Feb; 44(2):269-82].

Установлено, что на модели гликирования кристаллин-содержащего гидролизата глюкозой в условиях нормальной рН в фосфатной буферной системе соединение I обладает активностью, значительно превосходящей аминогуанидин по способности подавлять образование обоих изучаемых типов КПГ, как веспер-лизиновых, так и пентозидиновых. При этом, соединение I препятствует образованию обоих типов КПГ эквиэффективно, тогда как аминогуанидин несколько менее активен в отношении веспер-лизиновых КПГ. IC₅₀ соединения I составили 235,6 мкМ в отношении пентозидин-подобных КПГ, и 202,7 в отношении весперлизин-подобных КПГ.

Заключение

В исследовании установлено, что соединение I проявляет высокую антигликирующую и антигликоксидационную активности, превосходя аминогуанидин и эпросартан. Соединение I активно на основном модельном белке БСА, а также на белках фракций коллагенов и кристаллитов, входящих в качестве доминирующего компонента в состав гидролизатов соединительных тканей хвоста и хрусталиков крыс соответственно. Отмечено, что более выражено соединение I проявляет активность в отношении кристаллина.

6.2. Оценка цитотоксичности

Определение токсических свойств потенциального лекарственного средства на раннем этапе доклинического анализа является эффективным способом повышения надежности и последующей применимости разработки. К ранним тестам, позволяющим оценить токсическое действие соединения в условиях in vitro относится МТТ-тест.

6.2.1. Оценка влияния соединения на жизнеспособность клеток с помощью определения их метаболической активности (МТТ-тест)

В ходе проведенного исследования были получены значения абсорбции при 555 нм (референсная λ=650 нм), отражающие количественную оценку конвертированного МТТ-реагента в формазан митохондриальными дегидрогеназами. Для соединения I в концентрациях 1⋅10^-4 и 1⋅10^-5 М не было выявлено статистически значимых отличий величины абсорбции относительно контрольных измерений, что позволяет признать данные концентрации не имеющими цитотоксического действия на данную живую клеточную систему. В концентрации 1⋅10^-3 М наблюдается уменьшение показателя метаболической активности, косвенно отражающей выживаемость клеток, в 1,7 раза по сравнению с контрольными измерениями, однако данная концентрация является критически высокой при масштабировании ее до формата целостного организма. Для аминогуанидина в изученных концентрациях 1⋅10^-5 - 1⋅10^-3 М статистически значимых отличий показателя пролиферативной активности в контрольных лунках выявлено не было, однако количественно показатель метаболической активности клеток был ниже контрольного в 1,3 раза (тенденция). Доксирубицин в изучаемом диапазоне концентраций показал статистически значимое уменьшение метаболической активности клеток во всем диапазоне изучаемых концентраций (Табл. 5).

По результатам проведенного исследования, относительно положительного контроля, был рассчитан процент метаболической активности клеток, отражающий количество жизнеспособных клеток в % отношении относительно контрольных значений (фиг. 1).

Из графического представления данных видно, что количественные показатели цитотоксичности соединения I и аминогуанидина являются эквивалентными, а оба вещества могут быть охарактеризованы как не имеющие значимой цитотоксической активности в отношении рассматриваемой клеточной культуры. При помощи линейного регрессионного анализа был произведен расчет IC₅₀ изучаемых соединений. Показатель доксорубицина составляет 3,85×10^-6 М. Определение IC₅₀ аминогуанидина и соединения I не может быть произведено, так как цитотоксичность в максимальной концентрации не достигает порога в 50%.

Заключение

Совокупное фармакологическое действие соединения I по результатам исследований складывается из (i) значительного, превосходящего препарат сравнения аминогуанидин антигликирующего действия; (ii) превосходящего по активности аминогуанидин и эпросартан антигликоксидационного действия. При этом I не проявляет значимого цитотоксического действия в культуре клеток первичных фибробластов человека.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

Методика приготовления гидролизата сухожилий

Гидролиз очищенного тканевого материала проведен в соответствии с данными

Литературы [с .м. Rendueles de la Vega, M. Dfaz. Alkaline hydrolysis of porcine blood haemoglobin: Applications for peptide and amino acid production. Animal Production Science. 2012. 53(2):121-128] о влиянии щелочей на состояние гидролизуемого белка. Согласно источнику, концентрация 1-6 мМ и длительность экспозиции гидролизующего щелочного агента, используемая в данной работе, влекут образование растворимой фракции белка без глубокого распада на аминокислоты. Известно, что в коллагене, подвергнутом воздействию щелочи при высоком значении рН не наблюдается значительных изменений содержания функциональных групп, служащих мишенями гликирования (например, аминогрупп) [J.Н. Bowes, R.H. Kenten. The effect of alkalis on collagen. Biochem J. 1948; 43(3): 365-372], сохранными остаются триплеты альфа-спиралей [Shunji Hattori, Eijiro Adachi, Tetsuya Ebihara, Tomoko Shirai, Iori Someki, Shinkichi Irie. Alkali-Treated Collagen Retained the Triple Helical Conformation and the Ligand Activity for the Cell Adhesion via a2fil Integrin. J. Biochem. 125, 676-684 (1999)]. Таким образом, получение пригодного материала достигается (i) избирательностью экспрессии в тканях, откуда производится забор, (ii) умеренной обработкой с получением гидрозизатов приемлемого состава.

Первоначально выделенный у декапитированной под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг в/бр) белой беспородной половозрелой крысы забирали материал сухожилий хвоста. Материал высушивали при температуре 4-8°С в течение 3 дней. Далее материал подвергали щелочному гидролизу 1М раствором NaOH в соотношении 1:10 в течение 24 часов до полного впитывания волокнами жидкой фракции, затем добавляли дополнительный объем 1 М NaOH до соотношения 1:33 и гомогенизировали до получения жидкости. Пену осаждали 96% этиловым спиртом, добавляя его по каплям. Из данного раствора без хранения незамедлительно приготовляли рабочий раствор для реакции гликирования, разбавляя состав в фосфатном буферном растворе (рН 7,4) в соотношении 3:100 и доводя значение рН рабочего раствора до 7.4, медленно по каплям добавляя 0,1 М.раствор HCl.

Косвенный анализ сохранности общей аминокислотной структуры провели по реакции с красителем пирогаллоловым красным с применением БСА в заданной концентрации в качестве стандарта. Содержание белка в конечной буферной среде составило 649,8±8,6 мг/мл. Тест подтвердил сохранность общей аминокислотной структуры (пирогаллоловый красный восприимчив к гидрофобным аминокислотам). Сохранность пептидного остова подтверждена реакцией с биуретовым реактивом, с использованием в качестве стандарта БСА заданной концентрации. Установлено, что содержание белка составляет 858,2±19,1 мг/мл, что в свою очередь указывает на отсутствие глубокого разрушения белка.

Дополнительно на отсутствие высоких содержаний примесей других белков в гидролизате дана путем установления уровней флуоресценции отсутствующего в структуре коллагена триптофана в сравнении с БСА. Флуоресценция на длинах волн возбуждения/испускания, соответствующая нативному триптофану (соответственно 295/335 нм [Gillies R, Zonios G, Anderson RR, Kollias N. Fluorescence excitation spectroscopy provides information about human skin in vivo. J Invest Dermatol. 2000 Oct; 115(4):704-7]), была оценена до и после экспозиции глюкозой и при нагревании. Подобные условия влекли разрушение триптофана и потерю флуоресценции гидролизата на данных длинах волн. Эффект описан для кристаллинов и альбуминов, содержащих значительное число триптофана [Coussons PJ, Jacoby J, McKay A Kelly SM, Price NC et al. (1997) Glucose modification of human serum albumin: a structural study. Free Radic Biol Med 22: 1217-1227; Luthra M, Balasubramanian D (1993) Nonenzymatic glycation alters protein structure and stability. A study of two eye lens crystalline. J Biol Chem 268: 18119-18127]. В случае коллаген-содержащего гидролизата данного эффекта, в противоположность БСА, данное явление ожидаться не может, и при гликировании установлено не было (Таблица «Приложение I»). Это косвенно указывает на достаточную чистоту продукта. Данный вывод подтверждает и то, что в гидролизате общий уровень триптофановой флуоресценции нативных фракций в более чем 20 раз ниже такового для БСА (таблица Приложение I).

ПРИЛОЖЕНИЕ II

Гидролиз хрусталиков крыс

Гидролиз очищенного тканевого материала проведен в соответствии с данными литературы [С. М. Rendueles de la Vega, M. Diaz. Alkaline hydrolysis of porcine blood haemoglobin: Applications for peptide and amino acid production. Animal Production Science. 2012. 53(2):121-128] о влиянии щелочей на состояние гидролизуемого белка. Согласно источнику, концентрация 1-6 мМ и длительность экспозиции гидролизующего щелочного агента влекут формирование растворимой фракции белка без глубокого распада на аминокислоты. Фракции кристаллина представляют собой основной состав белков хрусталиков [Hoehenwarter W, Klose J, Jungblut PR. Eye lens proteomics. Amino Acids. 2006; 30(4):369-389. doi:10.1007/s00726-005-0283-9]. Таким образом, получение пригодного материала достигается (i) избирательностью экспрессии в тканях, откуда производится забор, (ii) умеренной обработкой с получением гидрозизатов приемлемого состава.

Гидролизу были подвергнуты высушенные при температуре 4-8°С хрусталики крыс, очищенные от капсул. Хрусталики аутопсированны у животных, умерщвленных декапитацией под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг в/бр). Растворение проведено в 1 М NaOH, в течение 12 часов, при комнатной температуре, с получением 10% концентрированного раствора гидролизата. В дальнейшем растворение концентрата проводили 1:100 в фосфатном буферном растворе рН 7,4, и доводили рН до рН 7,4, медленно по каплям добавляя 0,1 М раствор HCl.

Косвенный анализ сохранности общей аминокислотной структуры провели по реакции с красителем пирогаллоловым красным с применением БСА в качестве стандарта. Содержание белка в конечной буферной среде составило 697,2±7,8 мг/мл. Сохранность пептидного остова подтверждена реакцией с биуретовым реактивом, с использованием в качестве стандарта БСА заданной концентрации. Установлено, что содержание белка составляет 1074,3±4,1 мг/мл, что в свою очередь указывает на отсутствие глубокого разрушения белка.

3-циано-4-гидрокси-[1,2,4]триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин 1, обладающий антигликирующей и антигликоксидационной активностями