Способ оценки биосовместимости раневых покрытий

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при оценке биосовместимости покрытий, используемых для стимуляции регенерации кожных ран. Для этого накладывают исследуемый материал на сформированный раневой дефект кожи в межлопаточной области крысы, осуществляя тем самым его контактирование с тканями. Затем через 7 дней проводят лазерную допплеровскую флоуметрию (ЛДФ) микрокровотока кожи путем установки световодного зонда на расстоянии 1 мм от края раневого дефекта. Определяют показатель перфузии, а затем в вейвлет-спектре ЛДФ-граммы нормированные амплитуды миогенных и дыхательных колебаний. При значении показателя перфузии больше или равном 14,67 покрытие оценивают как небиосовместимое, при значении показателя перфузии ниже 14,67 - как биосовместимое и определяют степень биосовместимости раневого покрытия путем вычисления коэффициента КБП, равного частному от деления единицы на сумму нормированных амплитуд миогенных и дыхательных колебаний. Значение КБП прямо пропорционально степени биосовместимости раневого покрытия. Изобретение позволяет повысить точность определения биосовместимости раневого покрытия посредством учета значения нормированной амплитуды дыхательных колебаний микрокровотока кожи на границе исследуемый материал – ткань. 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, биологии, ветеринарии, фармакологии и может быть использовано при оценке биосовместимости покрытий, используемых для стимуляции регенерации кожных ран.

В настоящее время в связи с увеличивающимся объемом разработок новых материалов и изделий из них, готовящихся к выходу на рынок, особое значение приобретает разработка методов оценки биосовместимости, на параметры которых влияет множество факторов, в частности иммунологические и биомеханические свойства материала, пористость и другие.

Известен способ определения биосовместимости таких материалов, как гемосорбенты [авторское свидетельство SU на изобретение №1176249], включающий инкубацию адсорбента со стандартной лейковзвесью донора с добавлением раствора нитросинеготетразолия в конечной концентрации 2-4 мг/мл, приготовление мазков и определение числа нейтрофилов, имеющих отложения диформазона. По соотношению числа нейтрофилов, имеющих отложения диформазона до и после инкубации с гемосорбентом, судят о его биосовместимости с кровью.

Однако технические особенности выполнения способа, а именно его проведение в условиях in vitro, не позволяет оценивать биосовместимость в динамике и с учетом иммунных реакций в условиях целого организма.

Известен также способ определения биосовместимости инородного материала с организмом [патент RU на изобретение №2402773], включающий отбор исследуемого материала у индивидуума, добавление непосредственно в клеточную субстанцию инородного материала в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг и определение цитохимических показателей ферментативной активности клеток до и после внесения в клеточную субстанцию инородного материала.

Однако все вышеуказанные способы и аналогичные им, основанные на использование клеточных культур, не предусматривают оценку иммунной реакции целого организма и динамики реакций на контакт с тканями.

Известен способ оценки биосовместимости скаффолдов [Robocasting nanocomposite scaffolds of poly(caprolactone)/hydroxyapatite incorporating modified carbon nanotubes for hard tissue reconstruction / B Dorj [et al.] // J Biomed Mater Res A. 2013. 101(6). P. 1670-81]. Производят гетеротопическую имплантацию скаффолда экспериментальным животным в подкожную клетчатку холки крыс. Оценивают биосовместимость скаффолда путем исследования гистологических препаратов биоптатов тканей, полученных из области имплантации скаффолдов у экспериментальных животных.

Однако при использовании данного способа для оценки динамики реакций организма на имплантированный скаффолд возникает необходимость в большом числе животных. Кроме того, морфологические методы оценки результатов имплантации являются полуколичественными, что затрудняет сравнение биосовместимости различных скаффолдов и требует стандартизации.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ оценки биосовместимости скаффолдов [патент RU на изобретение №2571232], в котором крысам проводят лазерную допплеровскую флоуметрию микрокровотока (ЛДФ) в несколько этапов. Перед имплантацией скаффолда крысе в качестве инструментального исследования проводят ЛДФ, определяя показатель перфузии. Используя спектральный вейвлет-анализ, определяют нормированные амплитуды эндотелиальных, нейрогенных и миогенных колебаний микрокровотока, принимают полученные результаты за исходный уровень. Имплантируют скаффолд в форме диска диаметром порядка 15 мм, толщиной порядка 0,1 мм. Затем трехкратно на 7, 14, 21 сутки после имплантации проводят ЛДФ микрокровотока кожи над областью имплантации с определением указанных показателей. Анализируют результаты, сравнивая их с показателями исходного уровня. При повышении перфузионного показателя оценивают биосовместимость скаффолда обратно пропорционально изменению нормированной амплитуды миогенных колебаний микрокровотока.

Недостатками данного способа является оценка степени биосовместимости только на основании одного параметра активной модуляции кровотока - миогенного контроля (нормированной амплитуды миогенных колебаний), что снижает точность оценки. Исполнение данного способа включает в себя технически сложную процедуру - подкожную имплантацию, что не требуется при апробации раневых покрытий.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа оценки биосовместимости, адаптированного под раневые покрытия, с повышенной точностью и обеспечением оптимизации трудозатрат на выполнение методики с учетом особенностей применения раневых покрытий.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки биосовместимости раневых покрытий, включающем проведение лазерной допплеровской флоуметрии микрокровотока кожи через 7 дней контактирования исследуемого материала с тканями в межлопаточной области крысы, определяя показатель перфузии и нормированную амплитуду миогенных колебаний в вейвлет-спектре ЛДФ-граммы, контактирование исследуемого материала с тканями осуществляют путем его наложения на сформированный раневой дефект кожи, при лазерной допплеровской флоуметрии световодный зонд устанавливают на расстоянии 1 мм от края раневого дефекта с дополнительным определением нормированной амплитуды дыхательных колебаний в спектре ЛДФ-граммы, при значении показателя перфузии больше или равном 14,67 покрытие оценивают как небиосовместимое, при значении показателя перфузии ниже 14,67 - как биосовместимое и определяют степень его биосовместимости путем вычисления коэффициента КБП, равного частному от деления единицы на сумму нормированных амплитуд миогенных и дыхательных колебаний, значение которого прямопропорционально степени биосовместимости раневого покрытия.

Технический результат заявляемого изобретения.

Повышение точности достигается за счет расширения параметров оценки микроциркуляторных реакций, учитывая не только активные (миогенные колебания), но и пассивные (дыхательные колебания) механизмы модуляции микрокровотока кожи.

Адаптация способа под раневые покрытия учитывает, что раневое покрытие должно реализовывать свои функции на границе исследуемый материал-ткань, а не на границе ткань-ткань, как в случае скаффолда.

Оптимизация трудозатрат заключается в избежании лишних этапов проведения и обеспечения приближения к реальным условиям функционирования раневого покрытия, а именно реализации функций покрытия на границе ткани и внешней среды. В отличие от аналогов при выполнении заявляемого способа нет необходимости в проведении сложных и трудоемких манипуляций, таких как подкожная имплантация, изготовление морфологических препаратов и их микроскопия.

Способ оценки биосовместимости раневых покрытий осуществляют следующим образом.

Крысам выполняют формирование полнослойного дефекта кожи в межлопаточной области, который закрывается раневым покрытием, соответствующим размеру и форме раневого дефекта. Через 7 дней проводят ЛДФ микрокровотока кожи с помощью компьютеризированного лазерного анализатора микроциркуляции крови, размещая световодный зонд на расстоянии 1 мм от края раневого дефекта. При этом определяют показатель перфузии в перфузионных единицах и с помощью спектрального вейвлет-анализа нормированные амплитуды миогенных (0.2-0.74 Гц) и дыхательных (0,74-2,0 Гц) колебаний микрокровотока кожи. При превышении значения показателя перфузии выше или равном 14,67 перфузионных единиц покрытие оценивают как небиосовместимое. При значении показателя перфузии менее 14,67 перфузионных единиц покрытие считают биосовместимым. Степень биосовместимости определяют, рассчитывая коэффициент биосовместимости покрытия (КБП) как частное от деления единицы на сумму нормированных амплитуд миогенных и дыхательных колебаний микрокровотока кожи. Значение КБП прямопропорционально степени биосовместимости раневого покрытия.

Примеры.

Заявляемый способ был апробирован при оценке биосовместимости раневых покрытий из полилактида и желатина на 25 лабораторных белых крысах массой 300-350 г. Животные были разделены на 2 группы: 1-я группа включала 20 животных, которым закрытие дефекта кожи проводили полилактидным микрокамерным покрытием, в 5 случаях с таниновой кислотой, 2-я группа - 5 крыс, которым закрытие раневого дефекта выполняли желатиновым покрытием с нативными липопалисахаридами (ЛПС) бактерий. Регистрация ЛДФ-грамм осуществлялась на 7-е сутки эксперимента. Применение способа ранее, чем на 7-е сутки не проводится, так как общеизвестно, что первичный иммунный ответ имеет латентный скрытый период. Ограничений на кратность применения у способа нет - возможно исследование в динамике вплоть до полного заживления созданного дефекта. При проведении экспериментов на животных соблюдались этические принципы в соответствии с Женевской конвенцией (Geneva, 1990). Всем животным за 5 минут до проведения манипуляций вводилась внутримышечно комбинация золетила («VirbacSanteAnimale», Франция) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («lnterchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг для достижения наркоза.

Моделирование полнослойного раневого дефекта кожи осуществлялось хирургическим методом по стандартной методике [Влияние перевязочного материала, содержащего наночастицы золота или серебра, на заживление экспериментальной раны / С.М. Смотрин [и др.] // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2012. № 1 (37). С. 75-80.]. У животных после депиляции и антисептической обработки кожи в межлопаточной области с помощью квадратного трафарета 5% йодом наносились контуры будущего раневого дефекта. По разметке с помощью скальпеля проводилось формирование полнослойного раневого дефекта размером 10х10 мм.

Раневые покрытия из полилактида (полимолочная кислота) в виде массивов полимерных микрорезервуаров (микрокамер) были изготовлены с применением шаблона с рельефом в виде лунок микронного размера [Site-specific release of reactive oxygen species from ordered arrays of microchambers based on polylactic acid and carbon nanodots / A.V. Ermakov [et al.] //J. Mater. Chem. B. 2020. №8. Р. 7977-7986]. Площадь покрытия соответствовала размеру раневого дефекта и составляла порядка 1 см². Толщина стенок микрокамер покрытия составляла 0,3-0,5 мкм, горизонтальное сечение микрокамер покрытия имело форму квадрата со стороной 10 мкм, высота микроконтейнеров составляла 12 мкм. Массив микроконтейнеров был иммобилизован на подложке, образованной желатином толщиной 2 мм. Камеры 5 покрытий были загружены раствором таниновой кислоты (Sigma-Aldrich, Германия) с концентрацией 1мг/мл.

Для изготовления покрытия с ЛПС использовали культуры Escherichia coli ATCC® 25922, Pseudomonas aeruginosa, ATCC® 27853, Staphylococcus aureus, ATCC® 25923 восстановленные с дисков BD Microtrol ™ (Becton Dickinson, США) до эксперимента. В стерильном питательном бульоне (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия) готовили суспензии P. aeruginosa, E. coli и S. Aureus, мутность которых соответствовала стандарту MacFarland 0,5. Смешанную суспензию 1:1:1 готовили путем добавления равных объемов каждого вида. После чего проводили убивку миксткультуры путем автоклавирования. Убитую микст культуру в соотношении 1:1 смешивали с 10% раствором желатина для лабораторных работ. После чего в чашке Петри формировали желатиновое покрытие в виде пленки толщиной 2 мм.

Крысам проводили ЛДФ с помощью компьютеризированного лазерного анализатора микроциркуляции крови «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма», Россия) с использованием программы LDF 3.0.2.395. Световодный зонд располагали на коже на расстоянии 1 мм от края раны в межлопаточной области крысы. Длительность записи составляла 7 минут. На первом этапе исследования с помощью программы LDF 3.0.2.395 определяли показатель перфузии в перфузионных единицах. На втором этапе с помощью проводили вейвлет-преобразование спектра ЛДФ-граммы с разложением на нормированные амплитуды эндотелиальных (0.01-0.076 Гц), нейрогенных (0.076-0.2 Гц), миогенных (0.2-0.74 Гц), дыхательных (0,74-2,0 Гц) и пульсовых (2,0-5,0 Гц) колебаний микрокровотока [Time-frequency analysis of laser Doppler flowmetry signals recorded in response to a progressive pressure applied locally on anaesthetized healthy rats / A. Humeau [et. al.] // Phys. Med. Biol. 2004. V.49. №5. P. 843-857]. Определяли нормированные амплитуды миогенных и дыхательных колебаний микрокровотока и вычисляли коэффициент биосовместимости покрытий КБП = 1/(Ам+Ад), где Ам - нормированная амплитуда миогенных колебаний, Ад - нормированная амплитуда дыхательных колебаний.

Вывод животных из эксперимента осуществлялся передозировкой препаратов для наркоза после проведения регистрации ЛДФ-грамм. Для оценки морфологических изменений, происходящих в зоне экспериментальной полнослойной раны, мягкие ткани раневого дефекта фиксировались в 10%-ном растворе формалина для дальнейшего гистологического исследования. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивались гематоксилином и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Микроскопию препаратов зоны раневого дефекта выполняли с помощью микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФОТОНИКА», Россия). Оценивали состояние и кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла, а также инфильтрацию дна раны и ее перифокальной зоны клеточными элементами, участвующими в реализации раневого процесса, такими как фибробластами, лимфоцитами, макрофагами.

Ниже описаны результаты проведения оценки биосовместимости раневых микрокамерных покрытий из полилактида у белых крыс из 1 группы.

У белой крысы массой 280 г был сформирован раневой дефект площадью 102 мм² и закрыт микрокамерным покрытием из полилактида. Через 7 дней перфузионный показатель составил 13,99 перфузионных единиц, нормированная амплитуда миогенных колебаний - 9,293 условных единиц, нормированная амплитуда дыхательных колебаний - 16,594 условных единиц. КБП=0,039.

При гистологическом исследовании выявлено, что сосуды в области краев раны полнокровны. Инфильтрация тканей зоны раневого дефекта лейкоцитами не выражена. В области дна и краев раны отмечаются единичные лимфоциты, в отдельных полях зрения - сидерофаги.

Таким образом, данный пример иллюстрирует то, что после закрытия раны микрокамерным покрытием из полилактида показатель перфузии менее 14,67 перфузионных единиц - следовательно, покрытие биосовместимо. Гистологическое исследование подтверждает отсутствие нейтрофилов в зоне раневого дефекта, что свидетельствует о биосовместимости данного покрытия.

У белой крысы массой 310 г был сформирован раневой дефект площадью 99 мм² и закрыт покрытием из полилактида, микрокамеры которого были заполнены раствором таниновой кислоты. Через 7 дней перфузионный показатель составил 11,9 перфузионных единиц, нормированная амплитуда миогенных колебаний - 11,641 условных единиц, нормированная амплитуда дыхательных колебаний - 12,654 условных единиц. КБП=0,041.

При гистологическом исследовании выявлено, что инфильтрация тканей зоны раневого дефекта лейкоцитами не выражена. В области дна и краев раны отмечаются единичные лимфоциты, в отдельных полях зрения единичные макрофаги. Данный пример также подтверждает биосовместимость покрытия, показатель перфузии которого менее 14,67 перфузионных единиц.

В примерах заявляемого способа представлены в раскрытом виде описание экспериментов на 2 белых крысах из 1 группы, которые имели отличия в использовании двух разновидностей биосовместимых раневых покрытий, что визиализирует применение данной технологии не только для оценки биосовместимости, но и ее степени. При расчете КБП при использовании раневого покрытия из полилактида (КБП=0,039) было ниже, чем при использовании раневого покрытия из полилактида с таниновой кислотой (КБП=0,041), что свидетельствует о различной степени биосовместимости. Результаты количественной оценки КБП были подтверждены гистологическим исследованием, а именно полнокровие сосудов при наложении покрытия с таниновой кислотой было не выражено, что свидетельствует в пользу большей биосовместимости в сравнении с матрицами без таниновой кислоты. Таким образом, взаимосвязь рассчитанного КБП и степени биосовместимости исследуемых покрытий доказана. Остальные эксперименты на 18 белых крысах показали аналогичные результаты.

Ниже описаны результаты проведения оценки биосовместимости раневых покрытий из желатина и ЛПС у белых крыс 2 группы.

У белой крысы массой 340 г был сформирован раневой дефект площадью 98 мм² и закрыт покрытием из желатина и ЛПС. Через 7 дней перфузионный показатель составил 14,67 перфузионных единиц. При гистологическом исследовании выявлено, что сосуды в области краев раны полнокровны, наблюдается выраженная лейкоцитарная инфильтрация тканей дна и краев раны, в составе которой преобладают нейтрофилы, присутствуют лимфоциты и единичные макрофаги, в том числе сидерофаги.

Таким образом, данный пример иллюстрирует то, что закрытие раны покрытием из желатина с ЛПС приводит к увеличению перфузии более 14,67 перфузионных единиц - следовательно покрытие не обладает биосовместимостью. Гистологическое исследование подтверждает наличие воспаления в зоне раневого дефекта закрытого желатиновым покрытием с ЛПС, что свидетельствует об отсутствии у данного покрытия биосовместимости.

У белой крысы массой 300 г был сформирован раневой дефект площадью 101 мм² и закрыт покрытием из желатина и ЛПС. Через 7 дней перфузионный показатель составил 17,47 перфузионных единиц.

При гистологическом исследовании выявлено, что сосуды в области краев раны полнокровны, в отдельных венулах - сладж и сепарация крови. Наблюдается выраженная лейкоцитарная инфильтрация тканей дна и краев раны, в составе которой преобладают нейтрофилы, присутствуют лимфоциты и единичные макрофаги.

У других 3-х животных, которым сформированный дефект кожи закрывался желатиновым покрытием с ЛПС, значения перфузионного показателя составили 15,8, 16,58 и 17,19 перфузионных единиц. Во всех случаях в ране наблюдалась морфологическая картина воспаления, сопровождающаяся выраженной нейтрофильной инфильтрацией.

Таким образом, данный пример иллюстрирует то, что увеличение перфузии более 14,67 перфузионных единиц отражает отсутствие биосовместимости раневого покрытия.

Способ оценки биосовместимости раневых покрытий, включающий проведение лазерной допплеровской флоуметрии микрокровотока кожи через 7 дней контактирования исследуемого материала с тканями в межлопаточной области крысы, определяя показатель перфузии и нормированную амплитуду миогенных колебаний в вейвлет-спектре ЛДФ-граммы, отличающийся тем, что контактирование исследуемого материала с тканями осуществляют путем его наложения на сформированный раневой дефект кожи, при лазерной допплеровской флоуметрии световодный зонд устанавливают на расстоянии 1 мм от края раневого дефекта с дополнительным определением нормированной амплитуды дыхательных колебаний в спектре ЛДФ-граммы, при значении показателя перфузии больше или равном 14,67 покрытие оценивают как небиосовместимое, при значении показателя перфузии ниже 14,67 – как биосовместимое и определяют степень его биосовместимости путем вычисления коэффициента КБП, равного частному от деления единицы на сумму нормированных амплитуд миогенных и дыхательных колебаний, значение которого прямо пропорционально степени биосовместимости раневого покрытия.