Способы лечения заболевания с применением ингибиторов костного морфогенетического белка 6 (вмр6)

Авторы патента:

ЛЮ, Дун (US)

ЦУН, Фэн (US)

ДИТРИХ, Уилльям (US)

ГЕОРГЕ, Натали (CH)

ШАХТЕР, Ашер (US)

СОНИ, Адити (US)

ЧЖОУ, Цзин (US)

A61P7/06 - антианемические средства

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

A61K39/00 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

Владельцы патента RU 2790023:

НОВАРТИС АГ (CH)

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к способу лечения анемии у пациента с помощью антагониста BMP6, предусматривающему селективное введение терапевтически эффективного количества антагониста BMP6 пациенту на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина, большим чем или равным 500 нг/мл, где указанный антагонист BMP6 представляет собой антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие (i) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 69, 70 и 71 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 79, 80 и 81 соответственно; (ii) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 72, 73 и 74 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно; (iii) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 39, 40 и 41 соответственно; (iv) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 32, 33 и 34 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 42, 43 и 44 соответственно; (v) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 49, 50 и 51 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 59, 60 и 61 соответственно; (vi) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 52, 53 и 54 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 62, 63 и 64 соответственно; (vii) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 9, 10 и 11 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно или (viii) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 12, 13 и 14 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно, также относится к способу селективного лечения анемии у пациента с помощью антагониста BMP6, также относится к способу предсказания вероятности того, что пациент, имеющий анемию, будет отвечать на лечение с помощью антагониста BMP6, также относится к применению антагониста BMP6 в лечении анемии у пациента. Группа изобретений обеспечивает осуществление улучшенных способов лечения анемии. 8 н. и 63 з.п. ф-лы, 3 пр., 15 ил., 8 табл.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная ASCII-копия, созданная 23 мая 2017 года, имеет название PAT057354-WO-PCT_SL.txt и размер 82879 байтов.

ВВЕДЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам лечения анемии с применением ингибиторов костного морфогенетического белка 6 (BMP6).

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Анемия широко распространена у пациентов с хроническим заболеванием почек (CKD) и ассоциирована с более низким качеством жизни и более высоким риском неблагоприятных исходов, в том числе сердечно-сосудистого заболевания и смерти. Несколько способов контроля анемии у пациентов с CKD включают применение средств, стимулирующих эритропоэз (ESA), дополнительного перорального и внутривенного введения железа и переливаний крови. Тем не менее, многие пациенты не отвечают в достаточной степени на эти способы лечения или требуют более высоких доз ESA и/или железа. Высокие дозы железа также могут вызывать токсичность, ассоциированную с образованием кислородных радикалов и аллергическими реакциями. Эти способы лечения могут не иметь эффективности, поскольку они не полностью затрагивают первопричину анемии, т. е. нарушенную абсорбцию железа и мобилизацию железа из запасов организма.

В настоящее время предпринимаются попытки контроля устойчивости к эритропоэтину посредством совместного введения высокой дозы железа парентерально. Тем не менее, большая часть железа из внутривенных препаратов сначала перерабатывается макрофагами, и его использование для эритропоэза зависит от опосредованного ферропортином экспорта железа.

У многих пациентов с анемией опосредованный ферропортином экспорт железа подавляется высокими уровнями гепсидина. Дополнительные данные свидетельствуют о том, что повышенные уровни гепсидина коррелируют со слабой восприимчивостью к ESA при гемодиализе. Следовательно, средства, снижающие уровень гепсидина, могут являться эффективной стратегией для ослабления рефрактерной в отношении ESA анемии в этой популяции пациентов и при других формах анемии, обусловленной хроническим заболеванием (ACD), характеризующихся нехваткой железа.

Следовательно, способы, которые снижают уровни циркулирующего гепсидина в кровотоке, должны усиливать абсорбцию железа, способствовать высвобождению секвестированного железа и стимулировать эритропоэз при рефрактерной в отношении ESA анемии, присутствующей у пациентов с хроническим заболеванием почек.

Несмотря на современные варианты лечения, предназначенные для лечения заболеваний и нарушений, ассоциированных с анемией, остается потребность в улучшенных способах лечения анемии, которые являются эффективными и хорошо переносимыми.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ферритин представляет собой внутриклеточный белок, который является показателем запасенного железа. Уровни ферритина можно применять в качестве непрямого маркера общего количества железа, запасенного в организме. Не вдаваясь в теорию, полагают, что ингибиторы BMP6 могут приводить к высвобождению запасенного железа из клеток, например, из макрофагов и/или энтероцитов. Опять-таки, не вдаваясь в теорию, настоящее изобретение отчасти основывается на открытии того, что ингибиторы BMP6 могут являться эффективными в лечении состояний, ассоциированных с секвестированным железом, например анемии, у пациентов с высокими уровнями ферритина (например, уровни ферритина перед лечением более чем 500 нг/мл), например ферритина в сыворотке крови, и, следовательно, с высокими уровнями запасенного железа.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу селективного

a. ингибирования BMP6;

b. повышения уровней железа в сыворотке крови, насыщения трансферрина (TAST), содержания гемоглобина в ретикулоцитах (CHr), количества ретикулоцитов, количества эритроцитов, гемоглобина или гематокрита;

c. снижения активности или уровня гепсидина;

d. лечения анемии или

e. повышения или поддержания уровня гемоглобина

у пациента, нуждающегося в этом, который включает селективное введение пациенту терапевтически эффективного количества антагониста BMP6 на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, имеющего анемию, с помощью антагониста BMP6, включающему селективное введение пациенту терапевтически эффективного количества антагониста BMP6 на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу селективного лечения пациента, имеющего анемию, с помощью антагониста BMP6, включающему:

a) осуществление анализа биологического образца от пациента в отношении уровня ферритина и

b) после этого селективное введение пациенту терапевтически эффективного количества антагониста BMP9, где уровень ферритина составляет ≤ 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

a) осуществление анализа биологического образца от пациента в отношении уровня ферритина;

b) после этого осуществление отбора пациента для лечения с помощью антагониста BMP6 на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл; и

c) после этого введение пациенту терапевтически эффективного количества антагониста BMP9. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу селективного

a. ингибирования BMP6;

c. снижения активности или уровня гепсидина;

d. лечения анемии или

e. повышения или поддержания уровня гемоглобина

a) осуществление анализа биологического образца от пациента в отношении уровня ферритина и

b) после этого селективное введение пациенту терапевтически эффективного количества антагониста BMP9, где уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

a) осуществление анализа биологического образца от пациента в отношении уровня ферритина;

c) после этого введение пациенту терапевтически эффективного количества антагониста BMP9.

В вариантах осуществления, включенных в любой из вышеупомянутых аспектов, уровень ферритина представляет собой уровень белка ферритина.

В вариантах осуществления, включенных в любой из вышеупомянутых аспектов, стадия осуществления анализа предусматривает методику, выбранную из группы, состоящей из иммунологического анализа, иммуногистохимического анализа, ELISA, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, HPLC и масс-спектрометрии.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антагонисту BMP6 для применения в лечении пациента, имеющего анемию, характеризующегося тем, что терапевтически эффективное количество антагониста BMP6 подлежит введению пациенту на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антагонисту BMP6 для применения в лечении пациента, имеющего анемию, характеризующегося тем, что

a) отбор пациента для лечения с помощью антагониста BMP6 осуществляется на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл; и

b) после этого терапевтически эффективное количество антагониста BMP6 подлежит введению пациенту. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

a) отбор пациента для лечения с помощью антагониста BMP6 осуществляется на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≥ 500 нг/мл; и

b) после этого терапевтически эффективное количество антагониста BMP6 подлежит введению пациенту.

a) биологический образец от пациента подлежит анализу в отношении ферритина; и

b) терапевтически эффективное количество антагониста BMP6 подлежит селективному введению пациенту на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

a) биологический образец от пациента подлежит анализу в отношении ферритина; и

a) биологический образец от пациента подлежит анализу в отношении ферритина;

b) пациент выбран для лечения с помощью антагониста BMP6 на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≤ 2000 нг/мл; и

c) терапевтически эффективное количество антагониста BMP6 подлежит селективному введению пациенту. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

a) биологический образец от пациента подлежит анализу в отношении ферритина;

b) пациент выбран для лечения с помощью антагониста BMP6 на основании того, что биологический образец от пациента характеризуется уровнем ферритина ≥ 500 нг/мл; и

c) терапевтически эффективное количество антагониста BMP6 подлежит селективному введению пациенту.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предсказания вероятности того, что пациент, имеющий анемию, будет отвечать на лечение с помощью антагониста BMP6, включающему осуществление анализа биологического образца от пациента в отношении ферритина, где уровень ферритина ≤ 2000 нг/мл является показателем повышенной вероятности того, что пациент будет отвечать на лечение с помощью антагониста BMP6. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предсказания вероятности того, что пациент, имеющий анемию, будет отвечать на лечение с помощью антагониста BMP6, включающему осуществление анализа биологического образца от пациента в отношении ферритина, где уровень ферритина ≥ 500 нг/мл является показателем повышенной вероятности того, что пациент будет отвечать на лечение с помощью антагониста BMP6.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, уровень ферритина представляет собой уровень белка ферритина.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, стадия осуществления анализа предусматривает методику, выбранную из группы, состоящей из иммунологического анализа, иммуногистохимического анализа, ELISA, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, HPLC и масс-спектрометрии.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения пригодной для передачи формы информации для предсказания восприимчивости пациента, имеющего анемию, к лечению с помощью антагониста BMP6, включающий:

a) определение повышенной вероятности ответа пациента на лечение с помощью антагониста BMP6 на основании наличия уровня ферритина ≤ 2000 нг/мл в биологическом образце от пациента и

b) запись результата со стадии определения на материальной или нематериальной форме носителя для применения в передаче. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≥ 500 нг/мл.

a) определение повышенной вероятности ответа пациента на лечение с помощью антагониста BMP6 на основании наличия уровня ферритина ≥ 500 нг/мл в биологическом образце от пациента и

b) запись результата со стадии определения на материальной или нематериальной форме носителя для применения в передаче.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, пациент имеет анемию. В вариантах осуществления анемия представляет собой анемию, ассоциированную с хроническим заболеванием. В вариантах осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек, рак или воспаление.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, пациент получает или получил лечение с помощью средства, стимулирующего эритропоэз (ESA), например, эритропоэтина (EPO).

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, анемия представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении EPO.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, анемия представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа, например, анемию, обусловленную функциональной нехваткой железа.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, пациентом является пациент, находящийся на хроническом гемодиализе.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, способ или применение дополнительно включают обеспечение снижения потребности пациента в дозе железа, снижения потребности пациента в дозе EPO или снижения как потребности пациента в дозе железа, так и потребности пациента в дозе EPO относительно указанных потребности в дозе EPO и/или потребности в дозе железа в отсутствие лечения с помощью терапевтически эффективного количества антагониста BMP6. В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, способ или применение дополнительно включают обеспечение снижения индекса резистентности к ESA (ERI) у пациента или приводят в результате к нему.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, биологический образец представляет собой синовиальную жидкость, кровь, сыворотку крови, кал, плазму крови, мочу, слезу, слюну, спинномозговую жидкость, образец лейкоцитов или образец ткани.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, биологический образец представляет собой сыворотку крови или кровь.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антагонист BMP6 представляет собой молекулу, связывающую BMP6.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антагонист BMP6 представляет собой антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент, например, описанные в таблице 1 или таблице 14.

(a) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 69, 70 и 71 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 79, 80 и 81 соответственно;

(b) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 72, 73 и 74 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно;

(c) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 39, 40 и 41 соответственно;

(d) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 32, 33 и 34 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 42, 43 и 44 соответственно;

(e) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 49, 50 и 51 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 59, 60 и 61 соответственно;

(f) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 52, 53 и 54 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 62, 63 и 64 соответственно;

(g) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 9, 10 и 11 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно или

(h) последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 12, 13 и 14 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно.

(a) последовательность VH под SEQ ID NO: 75;

(b) последовательность VH под SEQ ID NO: 35;

(d) последовательность VH под SEQ ID NO: 15.

(a) последовательность VL под SEQ ID NO: 85;

(b) последовательность VL под SEQ ID NO: 45;

(d) последовательность VL под SEQ ID NO: 25.

(a) последовательность VH под SEQ ID NO: 75 и последовательность VL под SEQ ID NO: 85;

(b) последовательность VH под SEQ ID NO: 35 и последовательность VL под SEQ ID NO: 45;

(d) последовательность VH под SEQ ID NO: 15 и последовательность VL под SEQ ID NO: 25.

(a) последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 77;

(b) последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 37;

(d) последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 17.

(a) последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 87;

(b) последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 47;

(d) последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 27.

(a) последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 77 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 87;

(b) последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 37 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 47;

(d) последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 17 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 27.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются аффинностью в отношении BMP6 человека, превышающей по меньшей мере в приблизительно 100 раз таковую в отношении BMP7 человека.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются аффинностью в отношении BMP6 человека, превышающей по меньшей мере в приблизительно 500 раз таковую в отношении BMP2 человека, BMP5 человека или BMP7 человека.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются отсутствием выявляемого связывания с BMP2 и/или BMP7 человека в ELISA.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела, Fab и scFv.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются измененной эффекторной функцией вследствие мутации в Fc-области.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом BMP6 человека, включающим последовательность QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 98), например, состоящим из нее.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,001 мг/кг до 0,1 мг/кг.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозе, составляющей 0,001 мг/кг, 0,0016 мг/кг, 0,0025 мг/кг, 0,0040 мг/кг, 0,0063 мг/кг, 0,01 мг/кг, 0,016 мг/кг, 0,025 мг/кг, 0,040 мг/кг, 0,063 мг/кг или 0,1 мг/кг.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, введение осуществляют посредством инфузии в течение периода от приблизительно 30 до приблизительно 60 минут.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, уровень ферритина составляет ≤ 1900 нг/мл, ≤ 1800 нг/мл, ≤ 1700 нг/мл, ≤ 1600 нг/мл, ≤ 1500 нг/мл, ≤ 1400 нг/мл, ≤ 1300 нг/мл, ≤ 1200 нг/мл, ≤ 1100 нг/мл, ≤ 1000 нг/мл, ≤ 900 нг/мл, ≤ 800 нг/мл, ≤ 700 нг/мл, ≤ 600 нг/мл или ≤ 500 нг/мл.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, уровень ферритина составляет ≤ 1500 нг/мл. В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, уровень ферритина составляет ≤ 1000 нг/мл.

В вариантах осуществления, в том числе в вариантах осуществления любого из вышеупомянутых аспектов и вариантов осуществления, уровень ферритина составляет ≥ приблизительно 200 нг/мл, ≥ приблизительно 250 нг/мл, ≥ приблизительно 300 нг/мл, ≥ приблизительно 350 нг/мл, ≥ приблизительно 400 нг/мл, ≥ приблизительно 450 нг/мл, ≥ приблизительно 500 нг/мл, ≥ приблизительно 600 нг/мл, ≥ приблизительно 700 нг/мл, ≥ приблизительно 800 нг/мл, ≥ приблизительно 900 нг/мл, ≥ приблизительно 1000 нг/мл, ≥ приблизительно 1100 нг/мл, ≥ приблизительно 1200 нг/мл, ≥ приблизительно 1300 нг/мл, ≥ приблизительно 1400 нг/мл, ≥ приблизительно 1500 нг/мл, ≥ приблизительно 1600 нг/мл, ≥ приблизительно 1700 нг/мл, ≥ приблизительно 1800 нг/мл или ≥ приблизительно 1900 нг/мл.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

"BMP6", как используется в данном документе, означает белок, представляющий собой костный морфогенетический белок 6 (BMP6), или ген или нуклеиновую кислоту, кодирующие BMP6. Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142-7; ID гена в NCBI: 654. BMP6 также известен как BMP-6; VGR; VGR1; ID в сторонних системах: OMIM: 112266; MGI: 88182; HomoloGene: 1300; GeneCards: ген BMP6. Ортологи: вид: человек: Entrez: 654; Ensembl: ENSG00000153162; UniProt: P22004; RefSeq (mRNA): NM_001718; RefSeq (белок): NP_001709; положение (UCSC): хр. 6: 7,73-7,88 Мбаз; вид: мышь: Entrez: 12161; Ensembl: ENSMUSG00000039004; UniProt: P20722; RefSeq (mRNA): NM_007556; RefSeq (белок): NP_031582; положение (UCSC): хр. 13: 38,35-38,5 Мбаз. Как описано в данном документе, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6, связываются с белком BMP6.

"BMP2", как используется в данном документе, означает белок, представляющий собой костный морфогенетический белок 2 (BMP2), или ген или нуклеиновую кислоту, кодирующие BMP2. BMP2 также известен как BDA2 и BMP2A; ID в сторонних системах: OMIM: 112261; MGI: 88177; HomoloGene: 926; GeneCards: ген BMP2. Вид: человек; Entrez: 650; Ensembl: ENSG00000125845; UniProt: P12643; RefSeq (mRNA): NM_001200; RefSeq (белок): NP_001191; положение (UCSC): хр. 20: 6,75-6,76 Мбаз. Вид: мышь; Entrez: 12156; Ensembl: ENSMUSG00000027358; UniProt: P21274; RefSeq (mRNA): NM_007553; RefSeq (белок): NP_031579; положение (UCSC): хр. 2: 133,55-133,56 Мбаз. Как описано в данном документе, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP2, связываются с белком BMP2.

"BMP5", как используется в данном документе, означает белок, представляющий собой костный морфогенетический белок 5 (BMP5), или ген или нуклеиновую кислоту, кодирующие BMP5. BMP5 также известен как MGC34244; ID в сторонних системах: OMIM: 112265; MGI: 88181; HomoloGene: 22412; GeneCards: ген BMP5. Вид: человек; Entrez: 653; Ensembl: ENSG00000112175; UniProt: P22003; RefSeq (mRNA): NM_021073; RefSeq (белок): NP_066551; положение (UCSC): хр. 6: 55,62-55,74 Мбаз. Вид: мышь; Entrez: 12160; Ensembl: ENSMUSG00000032179; UniProt: P49003; RefSeq (mRNA): NM_007555; RefSeq (белок): NP_031581; положение (UCSC): хр. 9: 75,78-75,9 Мбаз. Как описано в данном документе, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP5, связываются с белком BMP5.

"BMP7", как используется в данном документе, означает белок, представляющий собой костный морфогенетический белок 7 (BMP7), или ген или нуклеиновую кислоту, кодирующие BMP7. BMP7 также известен как остеогенный белок-1; OP-1; ID в сторонних системах: OMIM: 112267; MGI: 103302; HomoloGene: 20410; GeneCards: ген BMP7. Вид: человек; Entrez: 655; Ensembl: ENSG00000101144; UniProt: P18075; RefSeq (mRNA): NM_001719; RefSeq (белок): NP_001710; положение (UCSC): хр. 20: 55,74-55,84 Мбаз. Вид: мышь; Entrez: 12162; Ensembl: ENSMUSG00000008999; UniProt: P23359; RefSeq (mRNA): NM_007557; RefSeq (белок): NP_031583; положение (UCSC): хр. 2: 172,87-172,94 Мбаз. Как описано в данном документе, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP7, связываются с белком BMP7.

"Гепсидин" означает ген гепсидина или белок гепсидин, пептидный гормон. Гепсидин также известен как HAMP (противомикробный белок или пептид гепсидин); HEPC; HFE2B; LEAP1 (LEAP-1); PLTR; OMIM: 606464; HomoloGene: 81623; GeneCards: ген HAMP; Entrez: 57817; Ensembl: ENSG00000105697; UniProt: P81172; RefSeq (mRNA): NM_021175; RefSeq (белок): NP_066998; положение (UCSC): хр. 19: 35,77-35,78 Мбаз. Krause et al. FEBS Lett. 480: 147-150; и Pigeon et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7811-9. См. также Ganz 2003 Blood 102: 783-8; Roy et al. 2005 Curr. Opin. Hemat. 12: 107-111; Fleming et al. 2006 Semin. Liver Dix. 25: 411-9; Park et al. 2001 J. Biol. Chem. 276: 7806-10; Majore et al. 2002 Haematologica 87: 221-2; Kluver et al. 2002 J. Pept. Res. 59: 241-8; Hunter et al. 2002 J. Biol. Chem. 277: 37597-603; Weinstein et al. 2003 Blood 100: 3776-81; Nemeth et al. 2003 Blood 101: 2461-3; Roetto et al. 2003 Nat. Genet. 33: 21-2; Strausberg et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-903; Gehrke et al. 2003 Blood 102: 371-6; Merryweather-Clarke et al. 2004 Human Mol. Genet. 12:2241-7; Clark et al. 2003 Genome Res. 13: 2265-70; Roetto et al. 2004 Blood 103: 2407-9; Jacolot et al. 2004 Blood 103: 2835-40; и Ota et al. 2004 Nat. Genet. 36: 40-45.

"Антагонист BMP6", как используется в данном документе, относится к молекуле, способной к противодействию (например, сокращению, ингибированию, снижению, задержке) функционированию, экспрессии BMP6 и/или передаче сигнала с его участием (например, посредством блокирования связывания BMP6 с рецептором BMP6). Неограничивающие примеры антагонистов BMP6 включают молекулы, связывающие BMP6, и молекулы, связывающие рецептор BMP6. В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов, схем, наборов, процессов, путей применения и композиций используют антагонист BMP6.

"Молекула, связывающая BMP6", как используется в данном документе, относится к любой молекуле, способной к связыванию с антигеном BMP6 человека либо отдельно, либо ассоциированным с другими молекулами. Реакция связывания может быть показана с помощью стандартных способов (качественных анализов), в том числе, например, анализа связывания, конкурентного анализа или биологического анализа для определения ингибирования связывания BMP6 с рецептором BMP6 или любого вида анализов связывания в сравнении с тестом отрицательного контроля, в котором используется антитело с неродственной специфичностью, но, в идеальном случае, относящееся к тому же изотипу. Неограничивающие примеры молекул, связывающих BMP6, включают малые молекулы, рецепторы-"ловушки" для BMP6 и антитела, которые связываются с BMP6, продуцируемые B-клетками или гибридомами, и химерные антитела, антитела с привитыми CDR или антитела человека или любой их фрагмент, например, F(ab')2- и Fab-фрагменты, а также одноцепочечные или однодоменные антитела. Предпочтительно молекула, связывающая BMP6, противодействует (например, сокращает, ингибирует, снижает, задерживает) функционированию, экспрессии BMP6 и/или передаче сигнала с его участием. В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов, схем, наборов, процессов, путей применения и композиций используют молекулу, связывающую BMP6.

"Молекула, связывающая рецептор BMP6" означает любую молекулу, способную к связыванию с рецептором BMP6 человека либо отдельно, либо ассоциированным с другими молекулами. Реакция связывания может быть показана с помощью стандартных способов (качественных анализов), в том числе, например, анализа связывания, конкурентного анализа или биологического анализа для определения ингибирования связывания рецептора BMP6 с BMP6 или любого вида анализов связывания в сравнении с тестом отрицательного контроля, в котором используется антитело с неродственной специфичностью, но, в идеальном случае, относящееся к тому же изотипу. Неограничивающие примеры молекул, связывающих рецептор BMP6, включают малые молекулы, "ловушки" для BMP6 и антитела к рецептору BMP6, продуцируемые B-клетками или гибридомами, и химерные антитела, антитела с привитыми CDR или антитела человека или любой их фрагмент, например, F(ab')2- и Fab-фрагменты, а также одноцепочечные или однодоменные антитела. Предпочтительно молекула, связывающая рецептор BMP6, противодействует (например, сокращает, ингибирует, снижает, задерживает) функционированию, экспрессии BMP6 и/или передаче сигнала с его участием. В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов, схем, наборов, процессов, путей применения и композиций используют молекулу, связывающую рецептор BMP6.

"Анемия", как используется в данном документе, означает снижение числа эритроцитов или снижение количества гемоглобина или железа в крови с понижением способности крови к переносу кислорода.

"Индекс резистентности к EPO" или "ERI", как используется в данном документе взаимозаменяемо, означают изменение дозы ESA, например, EPO (в единицах на кг массы тела), в зависимости от уровня гемоглобина. В вариантах осуществления дозу ESA/уровень гемоглобина измеряют еженедельно. В вариантах осуществления дозу ESA/уровень гемоглобина измеряют ежемесячно. В вариантах осуществления дозу ESA/уровень гемоглобина сравнивают для нескольких измерений с получением ERI.

Анемию можно диагностировать с помощью любого способа, известного из уровня техники, в том числе, в качестве неограничивающего примера, у мужчин на основании уровня гемоглобина, составляющего меньше чем приблизительно 130-140 г/л (13-14 г/дл), и у женщин - меньше чем приблизительно 120-130 г/л (12-13 г/дл). Janz et al. 2013 Emerg. Med. Pract. 15: 1-15; и Smith 2010 Am. J. Man. Care 16 Supp. S59-66.

Используемые в данном документе термины "антитело к BMP6", "антитело к BMP6 человека", "антитело, связывающее BMP6", "антагонистическое антитело к BMP6" и т. п. (и их антигенсвязывающие фрагменты) включают антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), которые связываются с белком BMP6.

Используемые в данном документе термины "антитело", "его антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающая часть" и т. п. включают целые антитела и любой их антигенсвязывающий фрагмент (т. е. "антигенсвязывающая часть") или их отдельные цепи. Встречающееся в природе "антитело" представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой посредством дисульфидных связей. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращено в данном документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращено в данном документе как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента.

Используемые в данном документе термины "антигенсвязывающий фрагмент", "его антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающая часть" антитела и т. п. относятся к одному или нескольким фрагментам интактного антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с заданным антигеном (например, BMP6). Антигенсвязывающие функции антитела могут выполняться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; F(ab)₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанные посредством дисульфидного мостика в шарнирной области; Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; фрагмент однодоменного антитела (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и выделенная определяющая комплементарность область (CDR).

Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены с применением рекомбинантных способов с помощью искусственного пептидного линкера, который позволяет преобразовать их в единую белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; и Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела включают одну или несколько "антигенсвязывающих частей" антитела. Эти фрагменты антител получают с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу на пригодность таким же способом, как и интактные антитела.

Антигенсвязывающие части также могут быть включены в однодоменные антитела, макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и бис-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Антигенсвязывающие части антител могут быть привиты на остовы на основе полипептидов, таких как фибронектин типа III (Fn3) (см. патент США № 6703199, в котором описаны монотела на основе полипептида фибронектина).

Антигенсвязывающие части могут быть включены в одноцепочечные молекулы, содержащие пару тандемно расположенных Fv-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8 (10):1057-1062; и патент США № 5641870).

Используемый в данном документе термин "аффинность" относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в отдельных антигенных сайтах. В пределах каждого антигенного сайта вариабельная область "плеча" антитела взаимодействует с антигеном посредством слабых нековалентных сил во многочисленных сайтах; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.

Используемый в данном документе термин "авидность" относится к информативному показателю общей стабильности или прочности комплекса антиген-антитело. Данный процесс контролируется тремя основными факторами: аффинностью эпитопа антитела; валентностью как антигена, так и антитела и структурным расположением взаимодействующих частей. В конечном итоге данные факторы определяют специфичность антитела, другими словами, вероятность того, что конкретное антитело свяжется с конкретным эпитопом антигена.

Термин "аминокислота" относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют подобно встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые с помощью генетического кода, а также те аминокислоты, которые впоследствии модифицируют, например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, т. е. альфа-углерод, который связан с водородом, карбокисльной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют подобно встречающейся в природе аминокислоте.

Используемый в данном документе термин "специфичность связывания" относится к способности отдельного антигенсвязывающего активного центра антитела реагировать только с одной антигенной детерминантой. Антигенсвязывающий активный центр антитела располагается в Fab-части молекулы и он сформирован из гипервариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Аффинность связывания антитела представляет собой силу реакции между одной антигенной детерминантой и одним антигенсвязывающим активным центром антитела. Она представляет собой сумму сил притяжения и отталкивания, действующих между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим активным центром антитела.

Специфическое связывание между двумя молекулами означает связывание с константой равновесия (KA или K_A), составляющей по меньшей мере 1×10⁷ М^-1, 10⁸ М^-1, 10⁹ М^-1, 10¹⁰ М^-1 или 10¹¹ М^-1. Фраза "специфически (или селективно) связывается" с антителом (например, антителом, связывающим BMP6) относится к реакции связывания, которая определяется наличием узнаваемого антигена (например, белка BMP6 человека) в гетерогенной популяции белков и других биологических материалов. Помимо константы равновесия (KA), приведенной выше, антитело, связывающее BMP6, по настоящему изобретению, как правило, также характеризуется константой скорости диссоциации (Kd, или KD, или K_D), составляющей приблизительно 1×10^-2 с^-1, 1×10^-3 с^-1 или меньше, и связывается с BMP6 с аффинностью, которая в по меньшей мере два раза превышает его аффинность в случае связывания с неспецифическим антигеном (например, BMP2, BMP5 или BMP7). Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное в отношении антигена" используются в данном документе взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном".

Специфичное связывание между двумя молекулами означает связывание с константой равновесия (KA) (kon/koff), составляющей по меньшей мере 10² М^-1, по меньшей мере 5×10² М^-1, по меньшей мере 10³ М^-1, по меньшей мере 5×10³ М^-1, по меньшей мере 10⁴ М^-1, по меньшей мере 5×10⁴ М^-1, по меньшей мере 10⁵ М^-1, по меньшей мере 5×10⁵ M^-1, по меньшей мере 10⁶ M^-1, по меньшей мере 5×10⁶ M^-1, по меньшей мере 10⁷ M^-1, по меньшей мере 5×10⁷ M^-1, по меньшей мере 10⁸ M^-1, по меньшей мере 5 X 10⁸ M^-1, по меньшей мере 10⁹ M^-1, по меньшей мере 5×10⁹ M^-1, по меньшей мере 10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁰ M^-1, по меньшей мере 10¹¹ M^-1, по меньшей мере 5×10¹¹ M^-1, по меньшей мере 10¹² M^-1, по меньшей мере 5×10¹² M^-1, по меньшей мере 10¹³ M^-1, по меньшей мере 5×10¹³ M^-1, по меньшей мере 10¹⁴ M^-1, по меньшей мере 5×10¹⁴ M^-1, по меньшей мере 10¹⁵ M^-1 или по меньшей мере 5×10¹⁵ M^-1.

Термин "химерное антитело" (или его антигенсвязывающий фрагмент) представляет собой молекулу антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), в которой (a) константная область или ее часть изменены, заменены или получены в результате обмена таким образом, что антигенсвязывающий сайт (вариабельная область) связан с константной областью отличного или измененного класса, с отличной или измененной эффекторной функцией и/или из отличного или измененного вида, или с полностью отличающейся молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, фермент, токсин, гормон, фактор роста, лекарственное средство и т. д.; или (b) вариабельная область или его часть изменены, заменены или получены в результате обмена с вариабельной областью, имеющей отличную или измененную антигенную специфичность. Например, мышиное антитело может быть модифицировано посредством замены его константной области на константную область из иммуноглобулина человека. Вследствие замены на константную область человека химерное антитело может сохранять свою специфичность в распознавании антигена, и при этом иметь пониженную антигенность у человека по сравнению с исходным мышиным антителом.

Термин "консервативно модифицированный вариант" применяется как к аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновой кислоты. Применительно к конкретным последовательностям нуклеиновой кислоты консервативно модифицированные варианты относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, они относятся к по существу идентичным последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода любой заданный белок кодируется большим числом функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, все из кодонов GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определяется кодоном, кодон может быть изменен на любой из описанных соответствующих кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновой кислоты представляют собой "молчащие вариации", которые представляют собой один вид консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает в данном документе каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалист поймет, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, подразумевается в каждой описанной последовательности.

В случае полипептидных последовательностей "консервативно модифицированные варианты" включают отдельные замены, делеции или добавления в полипептидной последовательности, которые приводят в результате к замене аминокислоты на сходную по химическим свойствам аминокислоту. Таблицы консервативных замен, обеспечивающие функционально сходные аминокислоты, являются хорошо известными из уровня техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по настоящему изобретению. Следующие восемь групп содержат аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (A), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (T) и 8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins (1984)). В одном варианте осуществления термин "консервативные модификации последовательности" используется для обозначения аминокислотных модификаций, которые не оказывают значительного влияния на характеристики связывания у антитела, содержащего аминокислотную последовательность, или не изменяют их.

Используемый в данном документе термин "блокирует" относится к прекращению или предотвращению взаимодействия или процесса, например, прекращению лиганд-зависимой или лиганд-независимой передачи сигнала.

Используемый в данном документе термин "распознает" относится к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту, которые находят и взаимодействуют (например, связываются) со своим конформационным эпитопом.

Термины "перекрестно блокирует", "перекрестно блокируемый", "перекрестное блокирование", "конкурировать", "перекрестно конкурировать" и связанные термины используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения способности антитела или другого связывающего средства препятствовать связыванию других антител или связывающих средств с BMP6 в стандартном конкурентном анализе связывания.

Способность или степень, с которой антитело или другое связывающее средство способны препятствовать связыванию другого антитела или связывающей молекулы с BMP6, и, следовательно, могут считаться перекрестно блокирующими согласно настоящему изобретению, можно определить с помощью стандартных конкурентных анализов связывания. Один подходящий анализ включает применение технологии Biacore (например, путем применения устройства BIAcore 3000 (Biacore, Уппсала, Швеция)), посредством которой можно измерить степень взаимодействий при использовании технологии поверхностного плазмонного резонанса. В другом анализе для измерения перекрестного блокирования используется подход на основе ELISA.

Термин "нейтрализует" означает, что антитело после связывания со своей мишенью снижает активность, уровень или стабильность мишени; например, антитело к BMP6 после связывания с BMP6 нейтрализует BMP6, по меньшей мере частично снижая активность, уровень или стабильность BMP6, как например, при передаче сигнала или его роль в уровнях гепсидина и анемии.

Термин "эпитоп" означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание первого, но не последнего, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей.

Термин "эпитоп" включает любую белковую детерминанту, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или иным образом взаимодействующую с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты BMP6 или боковые цепи углеводов или сахаров, и они могут обладать специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Эпитоп может быть "линейным" или "конформационным".

Термин "линейный эпитоп" относится к эпитопу, в котором все из точек взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) располагаются линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка (непрерывной).

Используемый в данном документе термин "высокая аффинность" для антитела IgG относится к антителу, которое характеризуется KD, составляющей 10^-8 М или меньше, 10^-9 М или меньше, или 10^-10 М, или 10^-11 М или меньше, в отношении антигена-мишени, например, BMP6. Однако "высокоаффинное" связывание может варьировать для других изотипов антител. Например, "высокоаффинное" связывание для изотипа IgM относится к антителу, которое характеризуется KD, составляющей 10^-7 М или меньше или 10^-8 М или меньше.

Предполагается, что используемый в данном документе термин "антитело человека" (или его антигенсвязывающий фрагмент) включает антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты), имеющие вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей человеческого происхождения. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также получена из таких последовательностей человека, например, последовательностей зародышевой линии человека или мутированных вариантов последовательностей зародышевой линии человека. Антитела человека и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человека (например, мутации, введенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo).

Используемые в данном документе фразы "моноклональное антитело" или "композиция на основе моноклонального антитела" (или его антигенсвязывающие фрагменты) относятся к полипептидам, в том числе к антителам, фрагментам антител, биспецифическим антителам и т. д., которые имеют практически идентичную аминокислотную последовательность или получены из одного и того же генетического источника. Данный термин также подразумевает препараты молекул антител одного молекулярного состава. Композиция на основе моноклонального антитела проявляет одну специфичность и аффинность связывания в отношении конкретного эпитопа.

Термин "моноклональное антитело человека" (или его антигенсвязывающий фрагмент) относится к антителам (и их антигенсвязывающим фрагментам), проявляющим одну специфичность связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-области получены из последовательностей человека. В одном варианте осуществления моноклональные антитела человека продуцируются гибридомой, которая предусматривает B-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например, трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, слитую с иммортализованной клеткой.

Используемая в данном документе фраза "рекомбинантное антитело человека" (или его антигенсвязывающий фрагмент) включает все антитела человека (и их антигенсвязывающие фрагменты), которые получают, экспрессируют, создают или выделяют посредством рекомбинантных способов, такие как антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулинов человека, или гибридомы, полученные из него, антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела человека, например, из трансфектомы, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других способов, которые включают сплайсинг всего гена иммуноглобулина человека или его части, последовательностей в другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. В одном варианте осуществления такие рекомбинантные антитела человека могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro (или, когда используется животное, которое является трансгенным по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, следовательно, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственными им, могут не существовать в естественных условиях среди спектра антител зародышевой линии человека in vivo.

"Гуманизированное" антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент), как используется в данном документе, представляет собой антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент), которое сохраняет реактивность антитела, отличного от человеческого, при этом является менее иммуногенным у людей. Этого можно достичь, например, посредством сохранения CDR-областей, отличных от человеческих, и замены остальных частей антитела на соответствующие им части человеческих антител (т. е. константная область, а также каркасные части вариабельной области). См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; и Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Другие примеры технологии конструирования с молекулами человека включают без ограничения технологию Xoma, раскрытую в патенте США № 5766886.

Термины "идентичный" или процентная "идентичность" в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются "практически идентичными", если две последовательности имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т. е. идентичными на 60%, необязательно идентичными на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% в определенной области или, если она указана, во всей последовательности) при сравнении и выравнивании для достижения максимального соответствия в окне сравнения или определенной области, который измеряют с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или с помощью выравнивания в ручном режиме и визуального осмотра. Необязательно идентичность существует в области, которая имеет длину по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот), или более предпочтительно в области, которая имеет длину 100-500 или 1000 или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот). Необязательно идентичность существует в области, которая имеет длину по меньшей мере 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот), или более предпочтительно в области, которая имеет длину 100-500 или 1000 или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот).

Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, если необходимо, устанавливают координаты подпоследовательностей, и устанавливают программные параметры алгоритма для анализа последовательности. Можно использовать программные параметры по умолчанию или можно установить альтернативные параметры. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает значения процентной идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей по сравнению с эталонной последовательностью, исходя из программных параметров.

"Окно сравнения", как используется в данном документе, включает ссылку на сегмент с любым из ряда смежных положений, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от приблизительно 50 до приблизительно 200, чаще от приблизительно 100 до приблизительно 150, в котором последовательность может сравниваться с эталонной последовательностью с таким же числом смежных положений после осуществления оптимального выравнивания двух последовательностей. Способы выравнивания последовательностей для сравнения являются хорошо известными из уровня техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма поиска локальной гомологии согласно Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, с помощью алгоритма выравнивания гомологичных участков согласно Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, с помощью способа поиска сходства согласно Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, с помощью компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в составе пакета программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или с помощью выравнивания в ручном режиме и визуального осмотра (см., например, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)).

Два примера алгоритмов, которые являются подходящими для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, представляют собой алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны соответственно в Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. Программное обеспечение для осуществления анализов BLAST является общедоступным от Национального центра биотехнологической информации. Этот алгоритм предусматривает вначале идентификацию пар последовательностей с высокими баллами (HSP) посредством идентификации коротких слов длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительно оцениваемому пороговому баллу T при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из базы данных. T называется пороговым баллом соседнего слова (Altschul et al., выше). Эти первоначальные совпадения для соседних слов выступают в качестве "затравок" для начала поисков, чтобы найти более длинные HSP, содержащие их. Совпадения для слов продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности настолько, насколько может быть увеличен суммарный балл выравнивания. Суммарные баллы рассчитывают с использованием, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров M (вознаграждающий балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей оценочную матрицу используют для расчета суммарного балла. Продление совпадений для слов в каждом направлении останавливается, когда суммарный балл выравнивания уменьшается на величину X относительно его максимального достигнутого значения; суммарный балл стремится к нулю или ниже вследствие накопления отрицательно оцениваемых выравниваний одного или нескольких остатков; или достигается конец любой из последовательностей. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве параметров по умолчанию используются длина слова (N) 11, ожидание (E) или 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. В случае аминокислотных последовательностей, в программе BLASTP в качестве параметров по умолчанию используются длина слова 3, и ожидание (E) 10, и оценочная матрица BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989), выравнивания (B) 50, ожидание (E) 10, M=5, N=-4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм BLAST также осуществляет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Одной единицей измерения сходства, обеспечиваемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P (N)), которая обеспечивает показатель вероятности, при которой случайно произойдет совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, нуклеиновая кислота считается схожей с эталонной последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно 0,2, более предпочтительно менее приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,001.

Процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма согласно E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0) при использовании таблицы веса остатков PAM120, штрафа за продолжение гэпа 12 и штрафа за открытие гэпа 4. Кроме того, процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием алгоритма согласно Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970), который был включен в программу GAP в составе пакета программного обеспечения GCG (доступного на www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossom 62, либо матрицы PAM250, а также штрафа за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Помимо процентной идентичности последовательности, упомянутой выше, еще одним показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидов являются практически идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно реактивным с антителами, выработка которых индуцируется полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, является практически идентичным второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что две молекулы или их комплементарные цепи гибридизируются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже. Еще одним показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются практически идентичными, является то, что для амплификации последовательности могут применяться одни и те же праймеры.

Используемый в данном документе термин "выделенное антитело" (или его антигенсвязывающий фрагмент) относится к антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту), которое практически не содержит других антител, характеризующихся отличающимися антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с BMP6, практически не содержит антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от BMP6). Более того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.

Термин "изотип" относится к классу антитела (например, IgM, IgE, IgG, такой как IgG1 или IgG4), который обеспечивается генами константной области тяжелой цепи. Изотип также включает модифицированные варианты одного из этих классов, в которых были осуществлены модификации с целью изменения функции Fc, например, для усиления или снижения эффекторных функций или связывания с Fc-рецепторами.

Предполагается, что используемые в данном документе термины "Kассоц.", или "Ka", или "KA", или "K_A" относятся к скорости ассоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как используемые в данном документе термины "Kдисс." или "Kd", как предполагается, относятся к скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. В одном варианте осуществления предполагается, что используемый в данном документе термин "K_D" относится к константе диссоциации, которую получают из отношения Kd к Ka (т. е. Kd/Ka) и которая выражена в виде молярной концентрации (M). Значения K_D для антител можно определить с помощью способов, хорошо известных из уровня техники. Способ определения K_D антитела осуществляют с помощью поверхностного плазмонного резонанса или с помощью биосенсорной системы, такой как система Biacore®.

Используемые в данном документе термины "моноклональное антитело" (или его антигенсвязывающий фрагмент) или "композиция на основе моноклонального антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента)" относятся к препарату молекул антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) одного молекулярного состава. Композиция на основе моноклонального антитела проявляет одну специфичность и аффинность связывания в отношении конкретного эпитопа.

Термин "нуклеиновая кислота" используется в данном документе взаимозаменяемо с термином "полинуклеотид" и относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и полимерам на их основе в одно- либо в двух-цепочечной форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи в остове, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые характеризуются свойствами связывания, подобными эталонной нуклеиновой кислоте, и которые метаболизируются подобно эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают без ограничения фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (PNA).

Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также потенциально охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденными кодонами) и комплементарные последовательности, а также непосредственно указанную последовательность. Конкретно, как подробно описано ниже, замены вырожденными кодонами могут быть достигнуты посредством создания последовательностей, в которых третье положение в одном или нескольких выбранных (или всех) кодонах заменено любым из канонических нуклеозидов и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

Термин "функционально связанный" относится к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами полинуклеотида (например, ДНК). Как правило, он относится к функциональной взаимосвязи регулирующей транскрипцию последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная или энхансерная последовательность является функционально связанной с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. В целом, регулирующие транскрипцию промоторные последовательности, которые являются функционально связанными с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т. е. они являются цис-действующими. Тем не менее, некоторые регулирующие транскрипцию последовательности, такие как энхансеры, не обязательно должны быть физически смежными или располагаться в непосредственной близости с кодирующими последовательностями, транскрипцию которых они усиливают.

Используемый в данном документе термин "оптимизированный" означает, что нуклеотидная последовательность была изменена таким образом, чтобы она кодировала аминокислотную последовательность с использованием кодонов, которые являются предпочтительными в продуцирующей клетке или организме, обычно в эукариотической клетке, например, клетке Pichia, клетке яичника китайского хомячка (CHO) или клетке человека. Оптимизированную нуклеотидную последовательность конструируют таким образом, чтобы полностью или насколько это возможно сохранить аминокислотную последовательность, первоначально кодируемую исходной нуклеотидной последовательностью, которая также известна как "первичная" последовательность. Оптимизированные последовательности в контексте данного документа были сконструированы так, чтобы они имели кодоны, которые являются предпочтительными в клетках млекопитающих. Тем не менее, оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических клетках или прокариотических клетках также предполагается в контексте данного документа. Аминокислотные последовательности, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, также называются оптимизированными.

Термины "полипептид" и "белок" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применяются к полимерам из аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к полимерам из встречающихся в природе аминокислот и полимеру из не встречающихся в природе аминокислот. Если не указано иное, конкретная полипептидная последовательность также потенциально охватывает ее консервативно модифицированные варианты.

Используемый в данном документе термин "рекомбинантное антитело человека" (или его антигенсвязывающий фрагмент) включает все антитела человека (и его антигенсвязывающие фрагменты), которые получают, экспрессируют, создают или выделяют посредством рекомбинантных способов, такие как антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулинов человека, или гибридомы, полученные из него, антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела человека, например, из трансфектомы, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные с помощью любых других способов, которые включают сплайсинг всего гена иммуноглобулина человека или его части, последовательностей в другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные области, в которых каркасные и CDR-области получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Тем не менее, в одном варианте осуществления такие рекомбинантные антитела человека могут быть подвергнуты мутагенезу in vitro (или, когда используется животное, которое является трансгенным по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, следовательно, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственными им, могут не существовать в естественных условиях среди спектра антител зародышевой линии человека in vivo.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") относится к клетке, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины, как предполагается, относятся не только к конкретной клетке-субъекту, но и к потомству такой клетки. Поскольку определенные модификации могут происходить в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство может, в действительности, не быть идентичным родительской клетке, но при этом оно включено в объем термина "клетка-хозяин", который используется в данном документе.

Термин "субъект" включает человека и животных, отличных от человека. Животные, отличные от человека, включают всех позвоночных, например, млекопитающих и животных, отличных от млекопитающих, как, например, приматов, отличных от человека, овцу, собаку, корову, кур, амфибий и рептилий. За исключением случаев, когда на это обращают внимание, термины "пациент" или "субъект" используются в данном документе взаимозаменяемо.

Термин "лечение" включает введение композиций или антител для предупреждения или задержки начала проявления симптомов, осложнений или биохимических признаков заболевания (например, анемии), облегчения симптомов или приостановки или подавления дальнейшего развития заболевания, состояния или нарушения. Лечение может быть профилактическим (для предупреждения или задержки наступления заболевания или для предупреждения проявления его клинических или субклинических симптомов) или терапевтическим подавлением или облегчением симптомов после проявления заболевания.

Предполагается, что термин "вектор" относится к молекуле полинуклеотида, способной транспортировать другой полинуклеотид, с которым она была связана. Одним типом вектора является "плазмида", которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, благодаря этому, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторами экспрессии"). В целом, векторы экспрессии, применимые в методиках рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид. В данном описании "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее широко применяемой формой вектора. Тем не менее, предполагается, что настоящее изобретение включает такие другие формы векторов экспрессии, как, например, вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектной репликацией, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Используемый в данном документе термин "гематокрит" или "показатель гематокрита" также известен как объем осажденных эритроцитов (PCV) или объемная доля эритроцитов (EVF) и представляет собой объем (%) эритроцитов в крови. В норме он составляет приблизительно 45% для мужчин и приблизительно 50% для женщин. Он считается неотъемлемой частью результатов развернутого анализа крови индивидуума вместе с концентрацией гемоглобина, количеством лейкоцитов и количеством тромбоцитов. В одном варианте осуществления анемия относится к ненормально низкому гематокриту, в противоположность полицитемии, которая представляет собой ненормально высокий гематокрит.

Термин "осуществление анализа" используется для обозначения действия по идентификации, скринингу, зондированию, измерению или определению в ходе тестов, причем данное действие можно осуществлять любыми общепринятыми способами. Например, образец можно анализировать в отношении присутствия конкретного генетического или белкового маркера с помощью анализа ELISA, нозерн-блоттинга, визуализации, серотипирования, типирования клеток, секвенирования генов, фенотипирования, гаплотипирования, иммуногистохимического анализа, вестерн-блоттинга, масс-спектрометрии и т. д. Термин "выявление" (и подобные) означает действие по извлечению конкретной информации из заданного источника, которое может быть прямым или косвенным. В некоторых вариантах осуществления способов предсказания, раскрытых в данном документе, наличие или уровень заданного объекта (например, уровень белка и т. д.) выявляют в биологическом образце косвенно, например, посредством запроса информации в базе данных. Термины "осуществление анализа" и "определение" предполагают превращение материала, например, превращение биологического образца, например, образца крови или образца другой ткани, из одного состояния в другое посредством подвергания этого образца физическому тестированию.

Термин "получение" означает добыть, например, получить в распоряжение любым способом, например, посредством физического вмешательства (например, биопсии, взятия крови) или отличного от физического вмешательства (например, передачи информации через сервер) и т. д.

Используемая фраза "осуществление анализа биологического образца …" и т. п. означает, что образец может быть подвергнут тестам (либо прямо, либо косвенно) в отношении либо присутствия, либо уровня заданного маркера (например, белка). Будет понятно, что в случае, если уровень вещества указывает на вероятность, то уровень такого вещества можно применять в качестве основания для выбора способа лечения. Например, можно определить уровень ферритина у пациента путем осуществления анализа в отношении его присутствия с помощью количественных или сравнительных качественных способов (например, уровней по сравнению с уровнями в других образцах). Раскрытые способы включают, среди прочего, определение уровня конкретного маркера, например, ферритина, у пациента.

Как используется в данном документе, термины "выбор" и "выбранный", используемые применительно к пациенту, означают, что конкретный пациент специально выбран из большей группы пациентов на основании того (вследствие того), что конкретный пациент характеризуется предварительно определенными критериями, например, пациент имеет конкретный уровень ферритина, например, описанный в данном документе. Подобным образом, "селективное лечение" относится к обеспечению лечением пациента, имеющего конкретное заболевание, причем этот пациент специально отобран из большей группы пациентов на основании того, что конкретный пациент характеризуется предварительно определенными критериями, например, пациент с анемией специально выбран для лечения вследствие того, что пациент имеет конкретный уровень ферритина, например, описанный в данном документе. Подобным образом, "селективное введение" относится к введению лекарственного средства пациенту, который специально выбран из большей группы пациентов на основании того (вследствие того), что конкретный пациент характеризуется предварительно определенными критериями, например, конкретным генетическим или другим биологическим маркером, например, конкретным уровнем ферритина, например, описанным в данном документе. Под отбором, селективным лечением и селективным введением подразумевают, что пациент получает персонализированную терапию на основании конкретных биологических характеристик пациента вместо того, чтобы получать лечение по стандартной схеме исключительно на основании того, что пациент имеет конкретное заболевание. Отбор, применительно к способу лечения в контексте данного документа, не относится к случайному лечению пациента, который имеет конкретный маркер, а скорее относится к взвешенному выбору введения антагониста BMP6 пациенту на основании того, что пациент имеет конкретный маркер, например, конкретный уровень ферритина, например, описанный в данном документе. Таким образом, селективное лечение отличается от стандартного лечения, при котором конкретное лекарственное средство получают все пациенты вне зависимости от их статуса в отношении маркера.

Как используется в данном документе, "предсказание" указывает на то, что способы, описанные в данном документе, обеспечивают информацию для того, чтобы позволить медицинскому работнику определить вероятность того, что индивидуум, имеющий заболевание, например анемию, будет отвечать или будет более благоприятно отвечать на лечение с помощью молекулы, связывающей BMP6. Данный термин не относится к возможности предсказания ответа со 100% точностью. Вместо этого, специалисту в данной области техники будет понятно, что это относится к повышенной вероятности.

Как используется в данном документе, "вероятность" и "вероятно" представляют собой меру вероятности того, что событие произойдет. Они могут использоваться взаимозаменяемо с термином "возможность". Вероятность относится к возможности того, что утверждение является более чем гипотезой, но менее чем достоверным фактом. Таким образом, событие является вероятным, если здравомыслящий человек с использованием общих принципов, обучения или опыта заключит, что, учитывая обстоятельства, событие является возможным. В некоторых вариантах осуществления после того как вероятность была установлена, пациент может получать лечение (или лечение продолжают, или лечение проводят с повышением дозы) с помощью молекулы, связывающей BMP6, или пациент может не получать лечение (или лечение прекращают, или лечение проводят с использованием пониженной дозы) с помощью молекулы, связывающей BMP6.

Фраза "повышенная вероятность" относится к повышению возможности того, что событие произойдет. Например, некоторые способы, указанные в данном документе, обеспечивают возможность предсказания того, будет ли у пациента проявляться повышенная вероятность ответа на лечение с помощью молекулы, связывающей BMP6, или повышенная вероятность лучшего ответа на лечение с помощью молекулы, связывающей BMP6, по сравнению с пациентом с таким же или подобным заболеванием, который не имеет маркера (например, уровень ферритина, описанный в данном документе).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1A показано ингибирование активности BMP антагонистическими антителами 5, 6 и 7 в анализе с репортерным геном. Показана активность в отношении BMP2, BMP5, BMP6 и BMP7. На фиг. 1B показано тестирование связывания антитела 7 с BMP6 человека, BMP7 человека, BMP5 человека, BMP6 мыши, hBaffR, BSA и Neu в анализе связывания ELISA. На этой фигуре и различных других фигурах, а также в других местах в данном описании Ab 5=антитело 5; Ab 6=антитело 6 и Ab 7=антитело 7.

На фиг. 2 показаны фармакодинамические профили, полученные в PK исследовании однократной дозы с сортировкой у крыс. Применяли антитела 5, 6 и 7. Уровни гепсидина и железа в сыворотке крови измеряли через 1 ч., 6 ч., 1, 2, 4, 8, 16 дней после введения дозы (10 мг/кг, IV).

На фиг. 3 показаны дозозависимые эффекты антитела к BMP6 в отношении сывороточных биомаркеров метаболизма железа. Вверху: концентрация hIgG в сыворотке крови в зависимости от времени после одной IV инъекции антитела 6 в указанных дозах. Внизу: левая панель представляет собой количественный анализ концентрации гепсидина в сыворотке крови после одной инъекции антитела 6 или контрольного IgG человека, тогда как правая панель представляет собой концентрацию железа в сыворотке крови.

На фиг. 4 показана терапевтическая обработка антителом к BMP6 на мышиной модели резистентной к ESA анемии, обусловленной воспалением. Вверху: схема эксперимента в модели индуцированной с помощью BA резистентной к ESA анемии, обусловленной воспалением. Внизу: параметры эритропоэза через 13 дней после обработки с помощью BA. HGB: гемоглобин; HCT: гематокрит; RETA: количество ретикулоцитов; RET-HE: эквивалент гемоглобина ретикулоцитов. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 в сравнении с BA+EPO+hIgG1.

На фиг. 5 показано картирование линейного эпитопа с помощью HDxMS (водород/дейтериевый обмен в сочетании с масс-спектрометрией). Показан эпитоп BMP6, связываемый антителом 7 (остатки 88-102 в BMP6 человека (QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 98))). С помощью HDxMS было обнаружено, что антитело 676, гуманизированный вариант коммерчески доступного антитела к BMP6, связывается с эпитопом BMP6 человека, состоящим из остатков 23-35 (VSSASDYNSSELK (SEQ ID NO: 99)).

На фиг. 6 показан протокол для части 1 клинической программы по изучению безопасности и эффективности антител к BMP6.

На фиг. 7 показана древовидная схема принятия решений по коррекции дозы для клинической программы по изучению безопасности и эффективности антител к BMP6.

На фиг. 8 показан протокол для части 2 клинической программы по изучению безопасности и эффективности антител к BMP6.

На фиг. 9 показаны фармакокинетические профили однократной дозы антитела 7 у самцов крыс.

На фиг. 10 показаны дозозависимые эффекты антитела 7 в отношении сывороточных биомаркеров метаболизма железа у крыс. Показан количественный анализ концентрации гепсидина в сыворотке крови после одной инъекции антитела 7 или контроля (среда-носитель) в указанной дозе. На левой панели показан развернутый вид эффектов в первые 24 часа после введения.

На фиг. 11 показаны зависимые эффекты антитела 7 в отношении уровня железа в сыворотке крови у крыс. Показан количественный анализ концентрации железа в сыворотке крови после одной инъекции антитела 7 или контроля (среда-носитель) в указанной дозе. На левой панели показан развернутый вид эффектов в первые 24 часа после введения.

На фиг. 12 профиль зависимости концентрации от времени для IV инъекции однократной дозы антитела 7 (3 мг/кг) макакам-крабоедам. На графике изображена общая концентрация антитела 7 (как несвязанного, так и связанного с BMP6).

На фиг. 13 показана концентрация гепсидина и Fe в сыворотке крови у самцов макаков-крабоедов после одной внутривенной инъекции антитела 7 в дозе 3 мг/кг. Показаны данные от трех разных особей макака вместе со средним значением.

На фиг. 14 показана пиковая величина TSAT (насыщения железом, %) для пациентов, находящихся на гемодиализе, до лечения (исходный уровень) и в течение 3 дней после получения лечения с использованием 0,01 мг/кг антитела 7 (Ab7) (3 дня после введения дозы). Все пациенты когорты 1 имели уровни ферритина перед лечением, составляющие меньше или равняющиеся 500 нг/мл. Все пациенты когорты 2 имели уровни ферритина перед лечением, составляющие от 500 до 1000 нг/мл. Жирной линией показан средний уровень TSAT для каждой группы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения состояний, ассоциированных с пониженным уровнем железа, например анемии, с помощью ингибиторов BMP6.

ИНГИБИТОРЫ BMP6

Широкий спектр антагонистов BMP6 можно применять в способах по настоящему изобретению, такие как, например, антитела, гибридные белки, аднектины, аптамеры, антикалины, липокалины, нуклеиновые кислоты (например, антисмысловые молекулы, такие как средства для РНК-интерференции и рибозимы), иммуноконъюгаты (например, антитело, конъюгированное с терапевтическим средством), малые молекулы, слитые белки, полученные из BMP6 пептидные соединения и антагонисты на основе рецепторов (например, растворимые домены рецептора BMP6).

Нуклеиновые кислоты/антисмысловые молекулы

В другом варианте осуществления антагонист BMP6, используемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой молекулу антисмысловой нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной гену, кодирующему BMP6, или части этого гена, или рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий молекулу антисмысловой нуклеиновой кислоты. В контексте данного документа "антисмысловая" нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной "смысловой" нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например, комплементарной кодирующей цепи двухцепочечной молекулы cDNA, комплементарной последовательности mRNA или комплементарной кодирующей цепи гена. Соответственно, антисмысловая нуклеиновая кислота может образовывать водородную связь со смысловой нуклеиновой кислотой.

Применение антисмысловых нуклеиновых кислот для понижающей модуляции экспрессии конкретного белка в клетке является хорошо известным из уровня техники (см., например, Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askart, F. K. and McDonnell, W. M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M. R. and Schwartz, S. M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D. and Cohen, J. S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J. J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R. W. (1994) Nature 372:333-335). Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной кодирующей цепи другой молекулы нуклеиновой кислоты (например, последовательности mRNA) и, соответственно, может образовывать водородные связи с кодирующей цепью другой молекулы нуклеиновой кислоты. Антисмысловые последовательности, комплементарные последовательности mRNA, могут быть комплементарными последовательности, находящейся в кодирующей области mRNA, 5'- или 3'-нетранслируемой области mRNA или области, соединяющей кодирующую область и нетранслируемую область (например, в месте соединения 5′-нетранслируемой области и кодирующей области). Кроме того, антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарной по последовательности области с регуляторами гена, кодирующего mRNA, например, последовательности инициации транскрипции или регуляторному элементу. Предпочтительно антисмысловая нуклеиновая кислота сконструирована таким образом, чтобы она была комплементарной области, находящейся перед инициирующим кодоном или распространяющейся на инициирующий кодон в кодирующей цепи/или в 3′-нетранслируемой области mRNA.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты могут быть сконструированы в соответствии с правилами уотсон-криковского спаривания оснований. Молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты может быть комплементарной целой кодирующей области mRNA BMP6, но более предпочтительно она представляет собой олигонуклеотид, который является антисмысловым только для части кодирующей или некодирующей области mRNA BMP6. Например, антисмысловой олигонуклеотид может быть комплементарным области, окружающей сайт начала трансляции в mRNA BMP6. Антисмысловой олигонуклеотид может иметь длину, например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть сконструирована с применением химического синтеза и ферментативных реакций лигирования с использованием процедур, известных из уровня техники. Например, антисмысловая нуклеиновая кислота (например, антисмысловой олигонуклеотид) может быть химически синтезирована с использованием встречающихся в природе нуклеотидов или различным образом модифицированных нуклеотидов, предназначенных для повышения биологической стабильности молекул или для повышения физической стабильности дуплекса, образующегося между антисмысловой и смысловой нуклеиновыми кислотами, например, можно использовать фосфоротиоатные производные и замещенные акридином нуклеотиды. Примеры модифицированных нуклеотидов, которые можно применять для создания антисмысловой нуклеиновой кислоты, включают 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеуозин, инозин, N6-изопентениладенин, метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил, (acp3)w и 2,6-диаминопурин. В качестве альтернативы антисмысловую нуклеиновую кислоту можно получать биологическим способом с применением вектора экспрессии, в который была субклонирована нуклеиновая кислота в антисмысловой ориентации (т. е. РНК, транскрибируемая со вставленной нуклеиновой кислоты, будет присутствовать в антисмысловой ориентации относительно целевой нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, дополнительно описанной в следующем подразделе).

Молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, как правило, вводят субъекту, или они образуются in situ, так что они гибридизуются или связываются с клеточной mRNA и/или геномной ДНК, кодирующей BMP6, таким образом ингибируя экспрессию посредством ингибирования транскрипции и/или трансляции. Гибридизация может происходить благодаря обычной комплементарности нуклеотидов с образованием стабильного дуплекса или, например, в случае молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, которая связывается с дуплексами ДНК, посредством специфических взаимодействий в большой бороздке двойной спирали. Пример пути введения молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты включает непосредственную инъекцию в участок ткани. В качестве альтернативы молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты можно модифицировать для нацеливания на выбранные клетки, а затем вводить системно. Например, в случае системного введения антисмысловые молекулы можно модифицировать так, чтобы они специфически связывались с рецепторами или антигенами, экспрессирующимися на поверхности выбранных клеток, например, посредством связывания антисмысловой нуклеиновой кислоты в молекулах с пептидами или антителами, которые связываются с рецепторами или антигенами на поверхности клеток. Молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты также можно доставлять в клетки с применением векторов, хорошо известных из уровня техники и описанных, например, в US20070111230, полное содержание которой включено в данный документ. Для достижения достаточных внутриклеточных концентраций антисмысловых молекул предпочтительными являются конструкции векторов, в которых молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты помещена под контроль сильного промотора pol II или pol III.

В еще одном варианте осуществления молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты, используемая в способах по настоящему изобретению, может включать α-аномерную молекулу нуклеиновой кислоты. α-Аномерная молекула нуклеиновой кислоты образует специфические двухцепочечные гибриды с комплементарной РНК, в которых, в отличие от обычных β-единиц, цепи идут параллельно друг другу (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). Молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты также могут содержать 2′-o-метилрибонуклеотид (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) или химерный РНК-ДНК аналог (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

В другом варианте осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота, применяемая в способах по настоящему изобретению, представляет собой соединение, которое опосредует RNAi. Средства для РНК-интерференции включают без ограничения молекулы нуклеиновой кислоты, в том числе молекулы РНК, которые являются гомологичными BMP6 или его фрагменту, "короткую интерферирующую РНК" (siRNA), "короткую шпилечную" или "малую шпилечную РНК" (shRNA) и малые молекулы, которые препятствуют или ингибируют экспрессию целевого гена посредством РНК-интерференции (RNAi). РНК-интерференция представляет собой методику посттранскрипционного целенаправленного сайленсинга гена, в которой двухцепочечная РНК (dsRNA) используется для разрушения информационной РНК (mRNA), содержащей такую же последовательность, что и dsRNA (Sharp, P. A. and Zamore, P. D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P. D. et al. Cell 101, 25-33 (2000). Tuschl, T. et al. Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999)). Процесс происходит, когда эндогенная рибонуклеаза расщепляет более длинную dsRNA на более короткие РНК длиной 21 или 22 нуклеотида, называемые малыми интерферирующими РНК или siRNA. Меньшие сегменты РНК затем опосредуют разрушение целевой mRNA. Наборы для синтеза средств для RNAi являются коммерчески доступными, например, от New England Biolabs и Ambion. В одном варианте осуществления можно использовать один или несколько из химических продуктов, описанных выше для применения в антисмысловой РНК.

В еще одном варианте осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота представляет собой рибозим. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК с рибонуклеазной активностью, которые способны расщеплять одноцепочечную нуклеиновую кислоту, такую как mRNA, с которой они имеют комплементарную область. Таким образом, рибозимы (например, рибозимы типа hammerhead (описанные в Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) можно применять для каталитического расщепления транскриптов mRNA BMP6, таким образом ингибируя трансляцию mRNA BMP6.

В качестве альтернативы экспрессию гена можно ингибировать посредством целенаправленного воздействия на нуклеотидные последовательности, комплементарные регуляторной области BMP6 (например, промотору и/или энхансерам), с образованием тройных спиральных структур, которые предотвращают транскрипцию гена BMP6. В целом, см., Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; и Maher, L. J., 1992, Bioassays 14(12):807-15.

Слитые белки и полученные из BMP6 пептидные соединения

В другом варианте осуществления антагонист BMP6, применяемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой слитый белок или пептидное соединение, полученное из аминокислотной последовательности BMP6. В частности, ингибиторное соединение предусматривает слитый белок или часть BMP6 (или его миметик), которые опосредуют взаимодействие BMP6 с целевой молекулой таким образом, что контакт BMP6 с этим гибридным белком или пептидным соединением конкурентно ингибирует взаимодействие BMP6 с целевой молекулой. Такие слитые белки и пептидные соединения можно получить с применением стандартных методик, известных из уровня техники. Например, пептидные соединения можно получить с помощью химического синтеза с применением стандартных методик синтеза пептидов, а затем вводить в клетки с помощью ряда известных из уровня техники средств для введения пептидов в клетки (например, липосома и т. п.).

Период полужизни in vivo у слитого белка или пептидных соединений по настоящему изобретению можно улучшить посредством создания пептидных модификаций, таких как добавление сайтов N-связанного гликозилирования в пептидное соединение из BMP6 или конъюгирование пептидного соединения из BMP6 с полиэтиленгликолем (PEG; пегилирование), например, посредством монопегилирования по лизину. Доказано, что такие методики являются полезными в продлении периода полужизни терапевтических лекарственных средств на основе белков. Ожидается, что пегилирование полипептидов из BMP6 по настоящему изобретению может приводить к подобным фармацевтическим преимуществам.

Кроме того, пегилирование может достигаться в любой части полипептида по настоящему изобретению посредством введения отличной от природной аминокислоты. Определенные отличные от природных аминокислоты можно вводить с помощью технологии, описанной в Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004; или в патенте США № 7083970. Вкратце, в некоторых из этих систем экспрессии предусматривается сайт-направленный мутагенез для введения нонсенс-кодона, такого как "янтарный" TAG, в открытую рамку считывания, кодирующую полипептид по настоящему изобретению. Такие векторы экспрессии затем вводят в хозяина, который может использовать tRNA, специфическую в отношении введенного нонсенс-кодона и нагруженную выбранной отличной от природной аминокислотой. Конкретные отличные от природных аминокислоты, которые являются полезными для конъюгирования фрагментов с полипептидами по настоящему изобретению, включают аминокислоты с ацетилен- и азидосодержащими боковыми цепями. Полипептиды из BMP6, содержащие эти новые аминокислоты, можно затем пегилировать по этим выбранным сайтам в белке.

Антагонист на основе рецептора

В другом варианте осуществления антагонист BMP6, применяемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой антагонист на основе рецептора. Антагонисты на основе рецептора включают растворимые рецепторы BMP6, которые соответственно связывают BMP6 (или его части) и нарушают активность и/или функционирование BMP6. В конкретном варианте осуществления антагонист на основе рецептора включает без ограничения растворимый гемоювелин или рецептор BMP типа I или типа II. Варианты растворимого гемоювелина включают описанные в публикации заявки на патент US2010/0136015.

АНТИТЕЛА К BMP6 И ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ФРАГМЕНТЫ

В настоящем изобретении в качестве ингибиторов BMP6, применимых в способах и других вариантах осуществления и аспектах настоящего изобретения, описанных в данном документе, предусматриваются антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6 человека.

BMP6, секретируемый лиганд семейства факторов роста BMP, был идентифицирован как критически важный эндогенный регулятор экспрессии в печени гормона гепсидина, участвующего в метаболизме железа. Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, настоящее изобретение предлагает антагонистическое антитело к BMP6 в качестве средства терапии для снижения уровня гепсидина, которое, как ожидается, оказывает благоприятное воздействие на пациентов с анемией, обусловленной нехваткой железа, посредством преодоления резистентности к средству, стимулирующему эритропоэз (ESA), которая вносит значительный вклад в заболеваемость первопричинным заболеванием и часто является прогностическим фактором неблагоприятного исхода.

Примерами таких антител к BMP6 человека являются антитела 3, 5, 6 и 7, последовательности которых приведены в таблице 1, и антитела к BMP6 человека, описанные в таблице 14.

Все из антител 5, 6 и 7 связываются с высокой аффинностью с BMP6 человека с высокой селективностью по сравнению с BMP7 человека, BMP5 человека и BMP2 человека (см. фиг. 1A). Все из этих антител также демонстрируют снижение уровня гепсидина в сыворотке крови и повышение уровня железа в сыворотке крови у крыс (см. фиг. 2).

Дополнительные примеры антител к BMP6 человека представляют собой LY3113593 (см., например, клиническое испытание NCT02604160). Дополнительные примеры антител к BMP6 человека описаны в публикации заявки согласно PCT с номером WO2014/099391, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Конкретные антитела к BMP6 человека из WO2014/099391 включают антитела, описанные в таблице 14.

Таблица 14. Примеры антител к BMP6 человека

Название последовательности	Последовательность	SEQ ID NO:
Антитело 1
LCDR1	RSSENIYRNLA	1
LCDR2	AATNLAD	2
LCDR3	QGIWGTPLT	3
Вариабельная область легкой цепи (aa)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSENIYRNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGIWGTPLTFGGGTKVEIK	4
Легкая цепь (aa)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSENIYRNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGIWGTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	5
HCDR1	GYTFTSYAMH	6
HCDR2	YINPYNDGTKYNENFK	7
HCDR3	RPFGNAMDI	8
Вариабельная область тяжелой цепи (aa)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGTKYNENFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRPFGNAMDIWGQGTLVTVSS	92
Тяжелая цепь (aa)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGTKYNENFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRPFGNAMDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG	93
Антитело 2
LCDR1	RSSENIYRNLA	1
LCDR2	AATNLAD	2
LCDR3	QGIWGTPLT	3
Вариабельная область легкой цепи (aa)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSENIYRNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGIWGTPLTFGGGTKVEIK	4
Легкая цепь (aa)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSENIYRNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGIWGTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	5
HCDR1	GYTFTSYAMH	6
HCDR2	YINPYNRGTKYNENFK	94
HCDR3	RPFGNAMDI	8
Вариабельная область тяжелой цепи (aa)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNRGTKYNENFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRPFGNAMDIWGQGTLVTVSS	95
Тяжелая цепь (aa)	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNRGTKYNENFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRPFGNAMDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG	96

Чтобы обеспечить дополнительное доказательство того, что нацеливание на этот путь может придавать улучшение функциональных конечных показателей, авторы настоящего изобретения тестировали способность специфических в отношении BMP6 антител, антител 5-7, модулировать сывороточные биологические маркеры метаболизма железа у нормальных мышей и крыс и обращать течение резистентной к ESA анемии в мышиной модели анемии, обусловленной воспалением. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что одна инъекция животным антитела к BMP6 приводила в результате к устойчивому повышению уровней железа в сыворотке крови, сопровождающемуся сильным подавлением циркулирующего гепсидина в кровотоке. Кроме того, терапевтическая обработка мышей, подвергавшихся воздействию индуцированной воспалением анемии, значительно улучшала параметры эритропоэза в ответ на одновременную обработку эритропоэтином.

В настоящем изобретении ингибирование передачи сигнала с участием BMP6 в мышиной модели анемии, обусловленной воспалением, значительно улучшало зависящие от уровня железа параметры эритроцитов.

Антагонистические антитела к BMP6, раскрытые в данном документе, представляют новый терапевтический подход к безопасному улучшению анемии с низкой восприимчивостью к эритропоэтину. Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, настоящее изобретение дает основания полагать, что это может происходить вследствие мобилизации и доступности запасов железа по требованию из эритроидного компартмента.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с белком BMP6 человека с аффинностью, которая в 100 раз, 500 раз или 1000 раз больше таковой для любого из белка BMP5 человека или BMP7 человека. Специфичность в отношении BMP6 без связывания с BMP7 является важной, поскольку нокаут BMP6 не является смертельным для мышей. Тем не менее, нокаутные по BMP7 мыши гибнут после рождения из-за дефектов почек, глаз и костей. Отдельные нокауты одного из генов не изменяют кардиогенез, но двойной нокаут BMP6 и BMP7 демонстрировал несколько дефектов и задержек в развитии сердца; эмбрионы погибали из-за сердечной недостаточности. BMP7 является важным в предупреждении прогрессирования хронического заболевания сердца, ассоциированного с фиброзом. Следовательно, перекрестная реактивность антитела к BMP6 с BMP7 не является желательной. Антитела, предусмотренные в данном документе, являются специфическими в отношении BMP6, а не BMP7; см., например, таблицу 4A. На фиг. 1B также показано доказательство специфичности связывания с BMP6 человека, а не с белками BMP2, BMP5 и BMP7 человека. В отличие от этого, коммерчески доступное антитело к BMP6 от R&D Systems, например, как было выявлено, характеризуется сильной перекрестной реактивностью с BMP7 в анализе с репортерным геном и ингибирует как BMP6, так и BMP7.

Антитела по настоящему изобретению включают без ограничения моноклональные антитела человека, выделенные, как описано в примерах (см. раздел 6 ниже).

Примерами таких антител к BMP6 человека являются антитела 3, 5, 6 и 7, последовательности которых приведены в таблице 1.

Зрелое антитело 7 получено из NOV0442_VL(YGQ) с возвращением к структуре зародышевой линии/удалением PTM, которое получено из первичного IgG hit NOV0442 (VH3_3-15, Vl1_1e). Антитело 7 связывается с высокой аффинностью с BMP6 человека в анализе связывания ELISA с более чем в 500 раз большей селективностью по сравнению с BMP7 человека (т. е. аффинность в отношении BMP6 человека является более чем в 500 раз большей, чем в отношении BMP7 человека). Это антитело также характеризуется отсутствием выявляемой активности в отношении BMP2 или BMP5 человека. Пептид BMP6, распознаваемый первичным IgG NOV0442 и антителом 7, показан на фиг. 5. Пептид содержит аминокислоты QTLVHLMNPEYVPKP (SEQ ID NO: 98) BMP6 человека. В отличие от IgG NOV0442 и антитела 7, гуманизированное mAb507 (R&D Systems) связывается с последовательностью VSSASDYNSSELK (SEQ ID NO: 99) BMP6 человека. Таким образом, эпитоп, распознаваемый IgG NOV0442 и антителом 7, представляет собой новый эпитоп BMP6. Антитело 7 также ингибирует связывание BMP6 с рецепторами in vitro. Связывание BMP6 с BMPR1A максимально ингибируется на 59%; связывание с BMPR1B максимально ингибируется на 85% и связывание с RGM-c максимально ингибируется на 72%. Одна обработка дозой 10 мг/кг у крыс приводит к устойчивому подавлению циркулирующего гепсидина в кровотоке. Оцененная минимальная эффективная доза у мышей является меньшей или равной 0,1 мг/кг. После введения обезьянам однократной дозы антитела 3 мг/кг также наблюдалось повышение уровня железа в сыворотке крови и наблюдалось снижение уровня гепсидина. У мышей, у которых для имитации анемии использовали антиген Brucella abortus, эффект обработки антителом 7 (2 мг/кг) согласовывался с клинически значимым ответом в отношении эритропоэза на продолжительную терапию EPO с постепенным повышением уровня гемоглобина на > 2,0 г/дл относительно исходного уровня.

В антителе 7 сайт потенциальной посттрансляционной модификации удаляли посредством мутации N51Q в LCDR2 для повышения однородности последующего продукта. Антитело, полученное из каркаса VH3/лямбда1, конструировали для того, чтобы оно совпадало с наиболее близкой последовательностью зародышевой линии человека: в VH посредством мутации V40A, в VL посредством мутаций D1Q, I2S и введения аминокислот Y49 и G50 для восстановления каркаса, в котором эти 2 остатка изначально отсутствовали.

Эта работа дала в результате антитело 7 (= NOV0958=NOV0806_VH[V40A]_VL[D1Q, I2S, Y49, G50, N51Q]).

Все из антител 3, 5, 6 и 7 показывают высокую специфичность в отношении белка BMP6 человека по сравнению с белком BMP2, BMP5 или BMP7 человека. Было предсказано, что эпитоп для всех этих антител является одинаковым, поскольку все они получены из одного первичного Fab до созревания аффинности. Антитело 3, например, имеет одинаковый клон Fab с обоими из антител 5 и 7 до созревания аффинности HCDR2. Антитело 5 получено из NOV0442 (VH3_3-15, VI1_1e) → NOV0442_VL(YGQ) → (созревание аффинности HCDR2) → антитело 5. Антитело 3 получено из NOV0442 (VH3_3-15,VI1_1e) → NOV0442_VL(YGS) → (созревание аффинности HCDR2) → антитело 3. Дополнительные подробности касательно создания антител, описанных в данном документе, представлены в примерах.

В настоящем изобретении предусмотрены антитела, которые специфически связываются с BMP6 (например, белком BMP6 человека), при этом указанные антитела содержат домен VH, приведенный в таблице 1 и/или таблице 14. В настоящем изобретении также предусмотрены антитела, которые специфически связываются с белком BMP6, при этом указанные антитела содержат CDR VH, имеющую аминокислотную последовательность любой из CDR VH, приведенной в таблице 1 и/или таблице 14. В частности, в настоящем изобретении предусмотрены антитела, которые специфически связываются с белком BMP6, при этом указанные антитела содержат одну, две, три, четыре, пять или больше CDR VH (или в качестве альтернативы состоят из них), имеющих аминокислотную последовательность любой из CDR VH, приведенной в таблице 1 и/или таблице 14.

В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VH (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более чем приблизительно 10 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию). В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VH (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более 10 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию).

В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VH (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более чем приблизительно 20 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию). В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VH (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более 20 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию).

В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VL (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более чем приблизительно 10 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию). В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VL (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более 10 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию).

В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VL (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более чем приблизительно 20 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию). В настоящем изобретении также предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат аминокислотную последовательность VL (или в качестве альтернативы состоят из нее), приведенную в таблице 1 и/или таблице 14, причем не более 20 аминокислот в каркасной последовательности (например, последовательности, которая не является CDR) были подвергнуты мутации (где мутация представляет собой в качестве различных неограничивающих примеров добавление, замену или делецию).

В настоящем изобретении предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с белком BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат домен VL, приведенный в таблице 1 и/или таблице 14. В настоящем изобретении также предусматриваются антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с белком BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат CDR VL, имеющие аминокислотную последовательность любой из CDR VL, приведенной в таблице 1 и/или таблице 14. В частности, в настоящем изобретении предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с белком BMP6, при этом указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат одну, две, три или больше CDR VL (или в качестве альтернативы состоят из них), имеющих аминокислотную последовательность любой из CDR VL, приведенной в таблице 1 и/или таблице 14.

Другие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают аминокислоты, которые были подвергнуты мутации, и при этом характеризуются по меньшей мере 60, 70, 80, 90 или 95 процентной идентичностью CDR-областей с CDR-областями, показанными в последовательностях, описанных в таблице 1 и/или таблице 14. В одном варианте осуществления они включают мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были подвергнуты мутации в CDR-областях по сравнению с CDR-областями, показанными в последовательности, описанной в таблице 1 и/или таблице 14.

В настоящем изобретении также предусматриваются последовательности нуклеиновой кислоты, которые кодируют VH, VL, полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связываются с белком BMP6. Такие последовательности нуклеиновой кислоты могут быть оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих (например, в таблице 1 показаны иллюстративные последовательности нуклеиновой кислоты для тяжелой цепи и легкой цепи антител 3, 5, 6 и 7).

ТАБЛИЦА 1. Примеры антител к BMP6 по настоящему изобретению

АНТИТЕЛО 3	SEQ ID NO:
Kabat	HCDR1	SYVVH	9
Kabat	HCDR2	RIKDHKQGYTTAYAASVKG	10
Kabat	HCDR3	VERSKSGFDN	11
Chothia	HCDR1	GFTFSSY	12
Chothia	HCDR2	KDHKQGYT	13
Chothia	HCDR3	VERSKSGFDN	14
	VH	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRIKDHKQGYTTAYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSS	15
	ДНК VH	caggtgcaattggtggaaagcggcggtggcctggtgaaaccaggcggcagcctgcgcctgagctgcgccgcctccggattcaccttttcttcttacgttgttcattgggtgcgccaggccccgggcaaaggtctcgagtgggtgggccgtatcaaagaccacaaacagggctacactactgcttatgccgcctctgtgaaaggccgctttaccattagccgcgatgattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgttgaacgttctaaatctggtttcgataactggggccaaggcaccctggtgactgttagctca	16
	Тяжелая цепь	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRIKDHKQGYTTAYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	17
	ДНК тяжелой цепи	caggtgcaattggtggaaagcggcggtggcctggtgaaaccaggcggcagcctgcgcctgagctgcgccgcctccggattcaccttttcttcttacgttgttcattgggtgcgccaggccccgggcaaaggtctcgagtgggtgggccgtatcaaagaccacaaacagggctacactactgcttatgccgcctctgtgaaaggccgctttaccattagccgcgatgattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgaaaaccgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgttgaacgttctaaatctggtttcgataactggggccaaggcaccctggtgactgttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa	18
Kabat	LCDR1	TGSSSNIGAGYSVH	19
Kabat	LCDR2	GSSERPS	20
Kabat	LCDR3	QSWDSSQTLVV	21
Chothia	LCDR1	SSSNIGAGYS	22
Chothia	LCDR2	GSS	23
Chothia	LCDR3	WDSSQTLV	24
	VL	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGSSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVL	25
	ДНК VL	CAGAGCGTGCTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGGTGCACCGGGCCAGCGCGTGACCATTAGCTGTACCGGCAGCAGCAGCAACATTGGTGCTGGTTACTCTGTGCATTGGTACCAGCAGCTGCCGGGCACGGCGCCGAAACTGCTGATCTATGGTAGCTCTGAACGCCCGAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCCAGCCTGGCGATTACCGGCCTGCAAGCAGAAGACGAAGCGGATTATTACTGCCAGTCTTGGGACTCTTCTCAGACTCTGGTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTCCTA	26
	Легкая цепь	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGSSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	27
	ДНК легкой цепи	CAGAGCGTGCTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGGTGCACCGGGCCAGCGCGTGACCATTAGCTGTACCGGCAGCAGCAGCAACATTGGTGCTGGTTACTCTGTGCATTGGTACCAGCAGCTGCCGGGCACGGCGCCGAAACTGCTGATCTATGGTAGCTCTGAACGCCCGAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACCAGCGCCAGCCTGGCGATTACCGGCCTGCAAGCAGAAGACGAAGCGGATTATTACTGCCAGTCTTGGGACTCTTCTCAGACTCTGGTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA	28
АНТИТЕЛО 5
Kabat	HCDR1	SYVVH	29
Kabat	HCDR2	RIKRESSSYTTMYAAPVKG	30
Kabat	HCDR3	VERSKSGFDN	31
Chothia	HCDR1	GFTFSSY	32
Chothia	HCDR2	KRESSSYT	33
Chothia	HCDR3	VERSKSGFDN	34
	VH	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRIKRESSSYTTMYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSS	35
	ДНК VH	CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGTAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTCACCTTCTCTAGCTACGTGGTGCACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGACGGATTAAGAGAGAGTCCTCTAGCTACACTACTATGTACGCCGCTCCCGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCTAGGGACGACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGTGGAACGGTCTAAGTCAGGCTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGC	36
	Тяжелая цепь	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRIKRESSSYTTMYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	37
	ДНК тяжелой цепи	CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGTAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTCACCTTCTCTAGCTACGTGGTGCACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGACGGATTAAGAGAGAGTCCTCTAGCTACACTACTATGTACGCCGCTCCCGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCTAGGGACGACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGTGGAACGGTCTAAGTCAGGCTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGCGCTAGCACTAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG	38
Kabat	LCDR1	TGSSSNIGAGYSVH	39
Kabat	LCDR2	GQSERPS	40
Kabat	LCDR3	QSWDSSQTLVV	41
Chothia	LCDR1	SSSNIGAGYS	42
Chothia	LCDR2	GQS	43
Chothia	LCDR3	WDSSQTLV	44
	VL	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVL	45
	ДНК VL	CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGTGACTATTAGCTGCACCGGCTCTAGCTCTAATATCGGCGCTGGCTATAGCGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGTCAGTCAGAGCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGGCTCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTCCTGGGACTCTAGTCAGACCCTGGTGGTGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACCGTGCTG	46
	Легкая цепь	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	47
	ДНК легкой цепи	CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGTGACTATTAGCTGCACCGGCTCTAGCTCTAATATCGGCGCTGGCTATAGCGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGTCAGTCAGAGCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGGCTCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTCCTGGGACTCTAGTCAGACCCTGGTGGTGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCTAAGGCTGCCCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTACCCAGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAAAAGACCGTGGCCCCAACCGAGTGCAGC	48
АНТИТЕЛО 6
Kabat	HCDR1	SYVVH	49
Kabat	HCDR2	RTRHSDMGYATSYAAPVKG	50
Kabat	HCDR3	VERSKSGFDN	51
Chothia	HCDR1	GFTFSSY	52
Chothia	HCDR2	RHSDMGYA	53
Chothia	HCDR3	VERSKSGFDN	54
	VH	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRTRHSDMGYATSYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSS	55
	ДНК VH	CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGTAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTCACCTTCTCTAGCTACGTGGTGCACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGACGGACTAGACACTCAGATATGGGCTACGCTACTAGCTACGCCGCTCCCGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCTAGGGACGACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGTGGAACGGTCTAAGTCAGGCTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGC	56
	Тяжелая цепь	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRTRHSDMGYATSYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	57
	ДНК тяжелой цепи	CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGTAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTCACCTTCTCTAGCTACGTGGTGCACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGACGGACTAGACACTCAGATATGGGCTACGCTACTAGCTACGCCGCTCCCGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCTAGGGACGACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGTGGAACGGTCTAAGTCAGGCTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGCGCTAGCACTAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG	58
Kabat	LCDR1	TGSSSNIGAGYSVH	59
Kabat	LCDR2	GQSERPS	60
Kabat	LCDR3	QSWDSSQTLVV	61
Chothia	LCDR1	SSSNIGAGYS	62
Chothia	LCDR2	GQS	63
Chothia	LCDR3	WDSSQTLV	64
	VL	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVL	65
	ДНК VL	CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGTGACTATTAGCTGCACCGGCTCTAGCTCTAATATCGGCGCTGGCTATAGCGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGTCAGTCAGAGCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGGCTCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTCCTGGGACTCTAGTCAGACCCTGGTGGTGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACCGTGCTG	66
	Легкая цепь	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	67
	ДНК легкой цепи	CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGTGACTATTAGCTGCACCGGCTCTAGCTCTAATATCGGCGCTGGCTATAGCGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGTCAGTCAGAGCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGGCTCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTCCTGGGACTCTAGTCAGACCCTGGTGGTGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCTAAGGCTGCCCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTACCCAGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAAAAGACCGTGGCCCCAACCGAGTGCAGC	68
АНТИТЕЛО 7
Kabat	HCDR1	SYVVH	69
Kabat	HCDR2	RIRLETHGYAAEYAASVKG	70
Kabat	HCDR3	VERSKSGFDN	71
Chothia	HCDR1	GFTFSSY	72
Chothia	HCDR2	RLETHGYA	73
Chothia	HCDR3	VERSKSGFDN	74
	VH	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRIRLETHGYAAEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSS	75
	ДНК VH	CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGTAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTCACCTTCTCTAGCTACGTGGTGCACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGACGGATTAGACTGGAAACTCACGGCTACGCCGCCGAGTACGCCGCTAGTGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCTAGGGACGACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGTGGAACGGTCTAAGTCAGGCTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGC	76
	Тяжелая цепь	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYVVHWVRQAPGKGLEWVGRIRLETHGYAAEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARVERSKSGFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	77
	ДНК тяжелой цепи	CAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTCAAGCCTGGCGGTAGCCTGAGACTGAGCTGCGCTGCTAGTGGCTTCACCTTCTCTAGCTACGTGGTGCACTGGGTCAGACAGGCCCCTGGTAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGACGGATTAGACTGGAAACTCACGGCTACGCCGCCGAGTACGCCGCTAGTGTGAAGGGCCGGTTCACTATCTCTAGGGACGACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAGTGGAACGGTCTAAGTCAGGCTTCGATAACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCTAGCGCTAGCACTAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTACTTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACAGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG	78
Kabat	LCDR1	TGSSSNIGAGYSVH	79
Kabat	LCDR2	GQSERPS	80
Kabat	LCDR3	QSWDSSQTLVV	81
Chothia	LCDR1	SSSNIGAGYS	82
Chothia	LCDR2	GQS	83
Chothia	LCDR3	WDSSQTLV	84
	VL	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVL	85
	ДНК VL	CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGTGACTATTAGCTGCACCGGCTCTAGCTCTAATATCGGCGCTGGCTATAGCGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGTCAGTCAGAGCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGGCTCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTCCTGGGACTCTAGTCAGACCCTGGTGGTGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACCGTGCTG	86
	Легкая цепь	QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYSVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSERPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSWDSSQTLVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	87
	ДНК легкой цепи	CAGTCAGTCCTGACTCAGCCCCCTAGCGTCAGCGGCGCTCCCGGTCAGAGAGTGACTATTAGCTGCACCGGCTCTAGCTCTAATATCGGCGCTGGCTATAGCGTGCACTGGTATCAGCAGCTGCCCGGCACCGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGGTCAGTCAGAGCGGCCTAGCGGCGTGCCCGATAGGTTTAGCGGCTCTAAGTCAGGCACTAGCGCTAGTCTGGCTATCACCGGCCTGCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTCAGTCCTGGGACTCTAGTCAGACCCTGGTGGTGTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGACCGTGCTGGGTCAGCCTAAGGCTGCCCCCAGCGTGACCCTGTTCCCCCCCAGCAGCGAGGAGCTGCAGGCCAACAAGGCCACCCTGGTGTGCCTGATCAGCGACTTCTACCCAGGCGCCGTGACCGTGGCCTGGAAGGCCGACAGCAGCCCCGTGAAGGCCGGCGTGGAGACCACCACCCCCAGCAAGCAGAGCAACAACAAGTACGCCGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACCCCCGAGCAGTGGAAGAGCCACAGGTCCTACAGCTGCCAGGTGACCCACGAGGGCAGCACCGTGGAAAAGACCGTGGCCCCAACCGAGTGCAGC	88

Другие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают такие, в которых аминокислоты или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислоты, были подвергнуты мутации, и при этом они характеризуются по меньшей мере 60, 70, 80, 90 или 95 процентной идентичностью с последовательностями, описанными в таблице 1 и/или таблице 14. В одном варианте осуществления они включают мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были подвергнуты мутации в вариабельных областях по сравнению с вариабельными областями, показанными в последовательности, описанной в таблице 1 и/или таблице 14, с сохранением практически такой же терапевтической активности.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 9, 10 и 11 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 19, 20 и 21 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 12, 13 и 14 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 22, 23 и 24 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 39, 40 и 41 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 32, 33 и 34 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 42, 43 и 44 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 49, 50 и 51 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 59, 60 и 61 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 52, 53 и 54 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 62, 63 и 64 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 69, 70 и 71 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 79, 80 и 81 соответственно.

В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с BMP6 человека и содержат последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3 под SEQ ID NO: 72, 73 и 74 соответственно и последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3 под SEQ ID NO: 82, 83 и 84 соответственно.

Поскольку каждое из этих антител может связываться с BMP6 последовательности (аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности) VH, VL, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи можно подвергнуть "смешиванию и подбору в пары" для создания других связывающих BMP6 антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Такие подвергнутые "смешиванию и подбору в пары" антитела, связывающие BMP6, можно тестировать с применением анализов связывания, известных из уровня техники (например, разновидностей ELISA и других анализов, описанных в разделе Примеры). Если эти цепи подвергаются смешиванию и подбору в пары, последовательность VH из конкретной пары VH/VL следует заменить на структурно подобную последовательность VH. Аналогичным образом полноразмерную последовательность тяжелой цепи из конкретной пары полноразмерной тяжелой цепи/полноразмерной легкой цепи следует заменить на структурно подобную полноразмерную последовательность тяжелой цепи. Аналогичным образом последовательность VL из конкретной пары VH/VL следует заменить на структурно подобную последовательность VL. Аналогичным образом полноразмерную последовательность легкой цепи из конкретной пары полноразмерной тяжелой цепи/полноразмерной легкой цепи следует заменить на структурно подобную полноразмерную последовательность легкой цепи.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитела, связывающие BMP6, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи, описанные в таблице 1 и/или таблице 14, или их комбинации. CDR-области определяют с использованием системы по Kabat (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Министерство здравоохранения и социальных служб США, публикация NIH № 91-3242) или с использованием системы по Chothia [Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901-917; и Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948].

С учетом того, что каждое из этих антител может связываться с BMP6, и что специфичность связывания с антигеном обеспечивается преимущественно областями CDR1, 2 и 3, последовательности CDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL можно подвергнуть "смешиванию и подбору в пары" (т. е. CDR из различных антител можно подвергнуть смешиванию и подбору в пары, хотя каждое антитело должно содержать CDR1, 2 и 3 VH и CDR1, 2 и 3 VL для создания других молекул, связывающих BMP6, по настоящему изобретению. Такие подвергнутые "смешиванию и подбору в пары" антитела, связывающие BMP6, можно тестировать с применением анализов связывания, известных из уровня техники, и анализов, описанных в примерах (например, разновидности ELISA). Если последовательности CDR VH подвергают смешиванию и подбору в пары, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности VH следует заменить на структурно подобную последовательность(-и) CDR. Аналогичным образом, если последовательности CDR VL подвергают смешиванию и подбору в пары, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной последовательности VL следует заменить на структурно подобную последовательность(-и) CDR. Специалисту обычной квалификации в данной области техники будет хорошо понятно, что новые последовательности VH и VL можно создать посредством мутирования одной или нескольких последовательностей CDR-областей VH и/или VL с помощью структурно подобных последовательностей из последовательностей CDR, приведенных в данном документе для моноклональных антител по настоящему изобретению.

Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены выделенные моноклональное антитело или его антигенсвязывающая область, содержащие CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72 или 9; CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53 или 73; CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54 или 74; CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62 или 82; CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63 или 83; и CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64 или 84; где антитело специфически связывается с BMP6.

В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с BMP6, представляет собой антитело, которое описано в таблице 1 и/или таблице 14.

Как используется в данном документе, антитело человека содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепи или полноразмерные тяжелые или легкие цепи, которые являются "продуктом" или "полученными из" конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные области или полноразмерные цепи антитела получают из системы, в которой используются гены иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, несущей гены иммуноглобулинов человека, антигеном, представляющим интерес, или скрининг библиотеки генов иммуноглобулинов человека, отображенных на фаге, с использованием антигена, представляющего интерес. Антитело человека, которое является "продуктом" или "полученным из" последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, может быть идентифицировано как таковое посредством сравнения аминокислотной последовательности антитела человека с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека и выбора последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека, которая является наиболее близкой по последовательности (т. е. имеет наибольший % идентичности) к последовательности антитела человека. Антитело человека, которое является "продуктом" или "полученным из" последовательности иммуноглобулина конкретной зародышевой линии человека, может содержать аминокислотные отличия по сравнению с последовательностью зародышевой линии вследствие, например, естественных соматических мутаций или преднамеренного введения сайт-направленных мутаций. Тем не менее, в каркасных областях VH или VL выбранное антитело человека, как правило, является на по меньшей мере 90% идентичным по аминокислотам последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют антитело человека как человеческое по сравнению с аминокислотными последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, последовательностями зародышевой линии мыши). В определенных случаях, антитело человека может быть на по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, или на по меньшей мере 95%, или даже на по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичным по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, рекомбинантное антитело человека будет проявлять отличия не более чем 10 аминокислотами от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии человека, в каркасных областях VH или VL. В определенных случаях антитело человека может проявлять отличие не более чем 5, или даже не более чем 4, 3, 2 или 1 аминокислотой от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.

ПРЕДСТАВИТЕЛИ СЕМЕЙСТВА ВМР И ГЕПСИДИН

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело или его связывающий фрагмент, которые специфически связываются с BMP6, при этом они представляют собой антитело. В одном варианте осуществления антитело или его связывающий фрагмент описаны в таблице 1 и/или таблице 14.

В одном варианте осуществления антитело или его связывающий фрагмент специфически связываются с BMP6, но не с другими белками BMP (такими как BMP2, BMP5 или BMP7).

BMP6, секретируемый лиганд семейства факторов роста BMP, в своей зрелой активной форме представляет собой соединенный дисульфидной связью гомодимер массой 30 кДа. Белок является представителем суперсемейства TGF-бета. Костные морфогенетические белки известны своей способностью к индукции роста кости и хряща. BMP6 способен индуцировать все остеогенные маркеры в мезенхимальных стволовых клетках.

Костные морфогенетические белки (BMP) принадлежат к семейству секретируемых сигнальных молекул, которые могут индуцировать эктопический рост кости. BMP являются частью суперсемейства трансформирующих факторов роста бета (TGF-бета). BMP первоначально идентифицировали на основании способности деминерализованного экстракта кости к индукции эндохондрального остеогенеза in vivo во внескелетном участке. На основании его экспрессии на ранних этапах эмбриогенеза BMP, кодируемый этим геном, играет предполагаемую роль на ранних этапах развития. Кроме того, факт того, что этот BMP тесно связан с BMP5 и BMP7, привел к гипотезе о возможной активности в отношении индукции развития кости. Дополнительная функция BMP6 была идентифицирована, как описано в Nature Genetics April; 41 [4]:386-8.

Мыши с нокаутом BMP6 являются жизнеспособными и фертильными, а также характеризуются нормальным развитием костей и хрящей.

BMP6 является ключевым регулятором гепсидина, небольшого пептида, секретируемого печенью, который является главным регулятором метаболизма железа у млекопитающих. Гепсидин контролирует как количество железа из пищи, всасываемого в двенадцатиперстной кишке, так и железо, высвобождаемое ретикулоэндотелиальными клетками. Экспрессия гепсидина активируется рядом стимулов, в том числе воспалением и перенасыщением железом, и подавляется при анемии, гипоксии и дефиците железа.

Не вдаваясь в какую-либо конкретную теорию, настоящее изобретение дает основания полагать, что антагонистическое антитело к BMP6 в качестве средства терапии для снижения уровня гепсидина, как ожидается, оказывает благоприятное воздействие на пациентов с анемией, обусловленной нехваткой железа, посредством преодоления резистентности к средству, стимулирующему эритропоэз (ESA), которая вносит значительный вклад в заболеваемость первопричинным заболеванием и часто является прогностическим фактором неблагоприятного исхода. При его взаимодействии с рецепторами BMPR1 и BMPR2 он индуцирует димеризацию рецепторов и транскрипцию гепсидина. BMP6 также связывается с корецептором HJV в печени и мышечных клетках.

Таким образом, известно, что BMP6 повышает экспрессию гепсидина. Известно, что гепсидин является ключевым гормоном, вовлеченным в гомеостаз железа. Высокие уровни гепсидина ассоциированы с железодефицитным эритропоэзом при ACD.

В WO 2010/056981 раскрыто, что введение мышам антитела к BMP6 снижало уровень гепсидина и повышало уровень железа.

BMP6 дополнительно описан в уровне техники, например, Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759-62; Sauermann et al. 1993 J. Neurosci. Res. 33: 142; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843; Schluesener et al. 1995 Atherosclerosis 113: 153; Gitelman et al. 1994 J. Cell Biol. 126: 1595; Barnes et al. 1997 W. J. Urol. 13: 337; и Hamdy et al. 1997 Cancer Res. 57: 4427.

BMP2, подобно другим костным морфогенетическим белкам, играет важную роль в развитии костей и хрящей. Он вовлечен в путь hedgehog, путь передачи сигнала с участием TGF-бета и во взаимодействие цитокин-цитокиновый рецептор. Он также вовлечен в дифференцировку клеток сердца и эпителиально-мезенхимальный переход. BMP2 играет много важных ролей, как указано в Kishimoto et al. 1997 Dev. 124: 4457; Ma et al. 2005 Dev. 132: 5601; Wang et al. Bone 48: 524; и Rosen 2009 Cyt. Growth Fact. Rev. 20: 475. Таким образом, предпочтительно, чтобы антитело к BMP6 не связывалось с BMP2.

BMP2 дополнительно описан, среди прочего, в Sampath et al. 1990 J. Biol. Chem. 265: 13198; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Marie et al. 2002 Histol. Histopath. 17: 877; Nickel et al. 2001 J. Bone Joint Surg. 83-A Supp. 1: S7-14; Kirsch et al. 2000 FEBS Lett. 468: 215; Kirsch et al. 2000 EMBO J. 19: 3314; Gilboa et al. 2000 Mol. Biol. Cell 11: 1023.

BMP5 также является представителем суперсемейства TGF-бета. Подобно другим BMP, он известен своей способностью к индукции развития костей и хрящей. BMP5 экспрессируется в трабекулярной сети и головке зрительного нерва, и он может играть роль в развитии и нормальном функционировании. Он также экспрессируется в легком и печени.

Дополнительная информация о BMP5 известна в уровне техники, например, Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Beck et al. 2003 BMC Neurosci. 2: 12; Celeste et al. 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9843; и Sakaue et al. 1996 Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 768.

BMP7 также является представителем суперсемейства TGF-бета. Подобно другим представителям семейства белков BMP, он играет ключевую роль в трансформации мезенхимальных клеток в кость и хрящ. Он индуцирует фосфорилирование SMAD1 и SMAD5, которые, в свою очередь, индуцируют транскрипцию многочисленных генов, отвечающих за остеогенез.

Как указано выше, мыши с нокаутом BMP6 являются жизнеспособными и фертильными, а также характеризуются нормальным развитием костей и хрящей. Тем не менее, нокаутные по BMP7 мыши гибнут после рождения из-за дефектов почек, глаз и костей. Отдельные нокауты одного из генов не изменяют кардиогенез, но двойной нокаут BMP6 и BMP7 демонстрировал несколько дефектов и задержек в развитии сердца; эмбрионы погибали из-за сердечной недостаточности. BMP7 является важным в предупреждении прогрессирования хронического заболевания сердца, ассоциированного с фиброзом. Следовательно, перекрестная реактивность антитела к BMP6 с BMP7 не является желательной.

Дополнительная информация, связанная с BMP7, представлена в уровне техники, например, Hahn et al. 1992 Genomics 14: 759; Chen et al. 2004 Growth Factors 22: 233; Itoh et al. 2001 EMBO J. 20: 4132; Zeisberg et al. 2003 Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F1060; Kallui et al. 2009 J. Clin. Invest. 119: 1420; и Wang et al. 2001 J. Am. Soc. Neph. 12: 2392.

Гепсидин представляет собой пептидный гормон, также известный как HAMP (гепсидиновый противомикробный белок или пептид).

Недавнее событие в эволюции мышей, заключающееся в дупликации гена, привело к наличию двух подобных генов гепсидина у мышей, Hepcidin1 и Hepcidin2. Ilyin et al. 2003 FEBS Lett. 542: 22-26. У hepcidin2 мыши отсутствуют несколько консервативных остатков, обнаруживающихся в гепсидинах млекопитающих. Lou et al. 2004 Blood 103: 2816-2821.

Продукт гена гепсидина вовлечен в поддержание гомеостаза железа, и он необходим для регуляции запасания железа в макрофагах и абсорбции железа в кишечнике. Эти пептиды проявляют противомикробную активность.

Препробелок (или препрогормон или препрогепсидин) (84 aa) и пробелок (или прогормон или прогепсидин) (60 aa) подвергаются процессингу в зрелые пептиды из 20, 22 и 25 аминокислот. Пептид из 25 aa секретируется преимущественно печенью и считается "главным регулятором" метаболизма железа. Метаболиты из 20 и 22 aa присутствуют в моче. N-концевая область гепсидина требуется для выполнения функции; делеция 5 N-концевых аминокислот приводит в результате к потере функции.

Активные пептиды гепсидина имеют высокое содержание цистеинов, которые образуют внутримолекулярные связи, которые стабилизируют их бета-складчатые структуры.

Гепсидин синтезируется преимущественно в печени, при этом в других тканях, как обнаружилось, синтезируются меньшие его количества. Bekri et al. 2006 Gastroent. 131: 788-96.

Пептид гепсидина из 25 aa секретируется преимущественно печенью и считается "главным регулятором" метаболизма железа. Гепсидин ингибирует транспорт железа посредством связывания с каналом экспорта железа, ферропортином, который располагается на базолатеральной поверхности энтероцитов кишки и плазматической мембране ретикулоэндотелиальных клеток (макрофагов). Посредством ингибирования ферропортина гепсидин предотвращает секрецию железа энтероцитами кишечника в воротную систему печени, за счет чего функционально снижается абсорбция железа. Высвобождение железа из макрофагов также предотвращается при ингибировании ферропортина; следовательно, гепсидин поддерживает гомеостаз железа. Активность гепсидина также частично ответственна за секвестрацию железа, наблюдаемую при анемии, обусловленной хроническим воспалением, таким как воспалительное заболевание кишечника, хроническая сердечная недостаточность, карциномы, ревматоидный артрит и почечная недостаточность.

Мутации в гене гепсидина вызывают гемохроматоз типа 2B, также известный как ювенильный гемохроматоз, заболевание, вызываемое сильным перенасыщением железом, которое приводит в результате к кардиомиопатии, циррозу и эндокринной недостаточности. Большинство случаев ювенильного гемохроматоза обусловлены мутациями в гемоювелине, регуляторе продукции гепсидина.

Генетически модифицированные мыши, созданные способами генетической инженерии с целью сверхэкспрессии гепсидина, гибнут вскоре после рождения из-за сильного дефицита железа, что свидетельствует о центральной и не избыточной роли в регуляции уровня железа. Первое доказательство, которое связало гепсидин с анемией, обусловленной воспалением, было получено, когда исследователи изучали ткани от двух пациентов с опухолями печени с тяжелой микроцитарной анемией, которые не отвечали на железосодержащие биологически активные добавки. Опухолевая ткань сверхпродуцировала гепсидин, и хирургическое удаление опухолей излечило анемию.

Существует много заболеваний, при которых неспособность в достаточном количестве абсорбировать железо вносит вклад в развитие дефицита железа и железодефицитной анемии. Лечение будет зависеть от уровней гепсидина, поскольку лечение пероральными препаратами, вероятно, будет неэффективным, если гепсидин блокирует кишечную абсорбцию.

В одном варианте осуществления введение антитела к BMP6 или его связывающего фрагмента снижает активность и/или уровень гепсидина и, следовательно, является полезным в лечении анемии. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения активности или уровня гепсидина у пациента, нуждающегося в этом, при этом способ предусматривает стадию введения пациенту антитела к BMP6 или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления активность или уровень гепсидина снижается по меньшей мере на 50%.

Ингибиторы гепсидина, такие как антитела к BMP6, можно применять для лечения связанного с гепсидином заболевания. Оно включает любое заболевание, ассоциированное с гепсидином и/или мутацией и/или сверхэкспрессией гепсидина дикого типа и/или мутантного гепсидина, и/или заболевания, при которых прогрессирование заболевания усиливается или прогноз ухудшается за счет присутствия гепсидина и/или мутации и/или сверхэкспрессии гепсидина дикого типа и/или мутантного гепсидина и/или уменьшенного выведения гепсидина почками с мочой. Неограничивающие примеры связанных с гепсидином заболеваний включают анемию, железодефицитный эритропоэз, гипоферремию, нарушенное поглощение железа из пищи, секвестрацию железа, анемию, обусловленную воспалением (AI), атеросклероз, диабет и многие нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и атаксия Фридриха, сердечную недостаточность, хроническое заболевание почек, кардиоренальный анемический синдром, инфекцию, потерю крови, гемолиз, дефицит витамина B12 или фолата, гиперпаратиреоз, гемоглобинопатии и злокачественные новообразования, рак, СПИД, хирургическое вмешательство, задержку роста и/или выпадение волос. В одном варианте осуществления субъект представляет собой пациента, находящегося на диализе. В одном варианте осуществления связанное с гепсидином заболевание представляет собой анемию, и субъект представляет собой пациента, находящегося на диализе. Распространенность рефрактерной в отношении железа и ESA анемии в популяции на хроническом гемодиализе является высокой.

Анемия включает, среди прочего, анемию, обусловленную хроническим заболеванием (ACD), анемию, обусловленную хроническим заболеванием почек (CKD), анемию, обусловленную раком, анемию, резистентную к средствам, стимулирующим эритропоэз (ESA), и/или анемию, обусловленную нехваткой железа.

Анемия, обусловленная CKD, является обычным и ранним осложнением хронического заболевания почек. Анемию, обусловленную раком, вызывают гематологические злокачественные новообразования и некоторые солидные опухоли. Как определено в данном документе, этот термин также включает анемию, индуцированную химиотерапией, которая представляет собой анемию, вызванную химиотерапевтическими средствами. Анемия при хронических заболеваниях почек может ухудшать диабетическую невропатию, сердечно-сосудистое заболевание, ретинопатию и другие проблемы. Связанная с раком анемия ассоциирована с повышенным риском смерти.

Некоторые хронические заболевания, такие как рак, заболевания почек и аутоиммунные нарушения могут приводить к анемии. Избыточно активные воспалительные цитокины могут вызывать нарушение регуляции гомеостаза железа, сокращение эритропоэза и снижение продолжительности жизни эритроцитов. Некоторые способы лечения анемии включают введение ESA, эритропоэтина, железа (в виде пищевой биологически активной добавки) или переливание крови.

Гепсидин является ключевым гормоном, вовлеченным в гомеостаз железа. Высокие уровни гепсидина ассоциировали с железодефицитным эритропоэзом при ACD. Известно, что BMP6 повышает экспрессию гепсидина.

Различные типы антител к BMP6 и их антигенсвязывающих фрагментов описаны ниже.

ГОМОЛОГИЧНЫЕ АНТИТЕЛА

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие аминокислотные последовательности, которые являются гомологичными последовательностям, описанным в таблице 1 и/или таблице 14, и указанное антитело связывается с BMP6 и сохраняет требуемые функциональные свойства антител, описанных в таблице 1 и/или таблице 14.

Например, в настоящем изобретении предусмотрено выделенное моноклональное антитело (или его функциональный антигенсвязывающий фрагмент), содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16; 36; 56 или 76; вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26; 46; 66 или 86; антитело специфически связывается с белком BMP6, и антитело может ингибировать лизис эритроцитов в анализе гемолиза, при этом анализ гемолиза известен из уровня техники. В конкретном примере такие антитела характеризуются значением IC₅₀, составляющим 20-200 пМ, в анализе гемолиза с использованием сыворотки крови, истощенной по BMP6 человека, которую восстанавливают с помощью 100 пМ BMP6 человека.

В одном варианте осуществления аминокислотные последовательности VH и/или VL могут быть на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательностям, изложенным в таблице 1 и/или таблице 14. В одном варианте осуществления аминокислотные последовательности VH и/или VL могут быть идентичными за исключением аминокислотной замены в не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных положениях. Антитело, имеющее VH и VL области, характеризующиеся высокой (т. е. 80% или большей) идентичностью с VH и VL областями антител, описанных в таблице 1 и/или таблице 14, можно получить посредством мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредованного мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих соответственно SEQ ID NO: 16; 36; 56 или 76 и 26; 46; 66 или 86, с последующим тестированием кодируемого измененного антитела в отношении сохраненной функции с помощью функциональных анализов, описанных в данном документе.

В одном варианте осуществления аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и/или полноразмерной легкой цепи могут быть на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательностям, изложенным в таблице 1 и/или таблице 14. Антитело, имеющее полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь, характеризующиеся высокой (т. е. 80% или большей) идентичностью полноразмерным тяжелым цепям под любым из SEQ ID NO: 18; 38; 58 или 78 и полноразмерным легким цепям под любым из SEQ ID NO: 28; 48; 68 или 88 соответственно, может быть получено посредством мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредованного мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих такие полипептиды соответственно, с последующим тестированием кодируемого измененного антитела в отношении сохраненной функции с помощью функциональных анализов, описанных в данном документе.

В одном варианте осуществления нуклеотидные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и/или полноразмерной легкой цепи могут быть на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательностям, изложенным в таблице 1 и/или таблице 14.

В одном варианте осуществления нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и/или легкой цепи могут быть на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательностям, изложенным в таблице 1 и/или таблице 14.

Как используется в данном документе, процентная идентичность двух последовательностей зависит от числа идентичных положений, общих для последовательностей (т. е. % идентичность равняется числу идентичных положений/общее число положений X 100), при этом учитывается число гэпов и длина каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности двух последовательностей можно осуществлять с применением математического алгоритма, описанного в неограничивающих примерах ниже.

В качестве дополнения или альтернативы, последовательности белка по настоящему изобретению также можно применять в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Например, такие поиски можно проводить с применением программы BLAST (версия 2.0) Altschul, et al., 1990 J. Mol. Biol. 215:403-10.

Антитела с консервативными модификациями

В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению имеет вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, при этом одна или несколько из этих последовательностей CDR имеют определенные аминокислотные последовательности, основанные на антителах, описанных в данном документе, или их консервативные модификации, и при этом антитела сохраняют требуемые функциональные свойства антител, связывающих BMP6, и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены выделенные моноклональное антитело или его функциональный антигенсвязывающий фрагмент, состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, при этом CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 29, 49, 69, 12, 32, 52, 72 или 9 или их консервативных вариантов; CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 10, 30, 50, 70, 13, 33, 53 или 73 или их консервативных вариантов; CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 11, 31, 51, 71, 14, 34, 54 или 74 или их консервативных вариантов; CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 19, 39, 59, 79, 22, 42, 62 или 82 или их консервативных вариантов; CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 20, 40, 60, 80, 23, 43, 63 или 83 или их консервативных вариантов; и CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 21, 41, 61, 81, 24, 44, 64 или 84 или их консервативных вариантов; антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с BMP6 и ингибируют лизис эритроцитов в анализе гемолиза.

В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению, оптимизированное для экспрессии в клетке млекопитающего, имеет полноразмерную последовательность тяжелой цепи и полноразмерную последовательность легкой цепи, при этом одна или несколько из этих последовательностей имеют определенные аминокислотные последовательности, основанные на антителах, описанных в данном документе, или их консервативные модификации, и при этом антитела сохраняют требуемые функциональные свойства антител, связывающих BMP6, и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрено выделенное моноклональное антитело, оптимизированное для экспрессии в клетке млекопитающего, состоящее из полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, где полноразмерная тяжелая цепь имеет аминокислотные последовательности, выбранные из группы SEQ ID NO: 18; 38; 58 или 78 и их консервативных модификаций; и полноразмерная легкая цепь имеет аминокислотные последовательности, выбранные из группы SEQ ID NO: 28; 48; 68 или 88 и их консервативных модификаций; антитело специфически связывается с BMP6; и антитело ингибирует лизис эритроцитов в анализе гемолиза, описанном в данном документе. В конкретном варианте осуществления такие антитела характеризуются значением IC₅₀, составляющим 20-200 пМ, в анализе гемолиза с использованием сыворотки крови, истощенной по BMP6 человека, которую восстанавливают с помощью 100 пМ BMP6 человека.

АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ОДНИМ И ТЕМ ЖЕ ЭПИТОПОМ

В настоящем изобретении предусмотрены антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и антитела, связывающие BMP6, приведенные в таблице 1 и/или таблице 14. Эпитоп, связываемый антителом 7, показан на фиг. 5. Следовательно, дополнительные антитела можно идентифицировать на основании их способности к перекрестной конкуренции (например, к конкурентному ингибированию связывания статистически значимым образом) с другими антителами и их антигенсвязывающими фрагментами по настоящему изобретению в анализах связывания BMP6. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению с белком BMP6 демонстрирует, что тестируемое антитело может конкурировать с этим антителом за связывание с BMP6; такое антитело в соответствии с неограничивающей теорией может связываться с одним и тем же или родственным (например, структурно подобным или пространственно близким) эпитопом на BMP6, что и антитело, с которым оно конкурирует. В определенном варианте осуществления антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом на BMP6, что и антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению, представляет собой моноклональное антитело человека. Такие моноклональные антитела человека можно получать и выделять, как описано в данном документе.

После определения требуемого эпитопа на антигене можно создавать антитела к этому эпитопу, например, с применением методик, описанных в настоящем изобретении. В качестве альтернативы в ходе процесса разработки создание антител и определение их характеристик могут предоставить информацию о необходимых эпитопах. На основании этой информации затем можно провести конкурентный скрининг антител в отношении связывания с одним и тем же эпитопом. Подход для достижения этого заключается в проведении исследований перекрестной конкуренции с целью обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, например, антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Способ с высокой пропускной способностью для "сортировки" антител на основании их перекрестной конкуренции описан в международной заявке на патент № WO 2003/48731. Как будет понятно специалисту в данной области техники, практически все, с чем может специфически связываться антитело, может представлять собой эпитоп. Эпитоп может содержать те остатки, с которыми связывается антитело.

В целом, антитела, специфичные в отношении конкретного целевого антигена, будут преимущественно распознавать эпитоп на целевом антигене в сложной смеси белков и/или макромолекул.

Области данного полипептида, которые включают эпитоп, могут быть идентифицированы с применением множества методик картирования эпитопов, хорошо известных из уровня техники. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, посредством одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и осуществления реакции пептидов с антителами, когда пептиды все еще прикреплены к подложкам. Такие методики известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США № 4708871; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Подобным образом, конформационные эпитопы с легкостью идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот в BMP6, как, например, с помощью водород/дейтериевого обмена, рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols выше. Антигенные области белков также могут быть идентифицированы с применением стандартных графиков антигенности и гидрофобности, таких как графики, построенные с применением, например, программы из системы программного обеспечения Omiga версии 1.0, доступной от Oxford Molecular Group. В этой компьютерной программе используется способ Хоппа/Вудса, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; для определения профилей антигенности и методика Кайта-Дулиттла, Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132; для графиков гидрофобности.

Сконструированные и модифицированные антитела

Антитело по настоящему изобретению также можно получить с применением антитела, имеющего одну или несколько из последовательностей VH и/или VL, показанных в данном документе, в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела, причем данное модифицированное антитело может иметь измененные свойства исходного антитела. Антитело может быть сконструировано посредством модификации одного или нескольких остатков в пределах одной или обоих вариабельных областей (т. е. VH и/или VL), например, в пределах одной или нескольких CDR-областей и/или в пределах одной или нескольких каркасных областей. В качестве дополнения или альтернативы, антитело может быть сконструировано посредством модификации остатков в константной(-ых) области(-ях), например, для изменения эффекторной(-ых) функции(-й) антитела.

Один тип конструирования вариабельной области, который можно осуществлять, представляет собой прививку CDR. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами преимущественно посредством аминокислотных остатков, которые расположены в шести определяющих комплементарность областях (CDR) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в пределах CDR являются более разнообразными у отдельных антител, чем последовательности за пределами CDR. Поскольку последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства конкретных встречающихся в природе антител, посредством конструирования векторов экспрессии, которые содержат последовательности CDR из конкретного встречающегося в природе антитела, привитые на каркасные последовательности из отличающегося антитела с отличающимися свойствами (см., например, Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; патент США № 5225539 за авторством Winter и патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 за авторством Queen et al.).

Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных источников, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепей человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека "VBase" (доступной в сети Интернет по адресу www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, Министерство здравоохранения и социальных служб США, публикация NIH № 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; и Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836; содержание каждого из которых прямо включено в данный документ посредством ссылки.

Примером каркасных последовательностей для применения в антителах и их антигенсвязывающих фрагментах по настоящему изобретению являются последовательности, которые являются структурно подобными каркасным последовательностям, применяемым в выбранных антителах и их антигенсвязывающих фрагментах по настоящему изобретению, например, консенсусные последовательности и/или каркасные последовательности, применяемые в моноклональных антителах по настоящему изобретению. Последовательности CDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL могут быть привиты на каркасные области, которые имеют последовательность, идентичную той, что обнаруживается в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого получена каркасная последовательность, или последовательности CDR могут быть привиты на каркасные области, которые содержат одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в определенных случаях благоприятным является мутирование остатков в пределах каркасных областей для сохранения или повышения способности к связыванию антигена антителом (см., например, патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 за авторством Queen et al.).

Другой тип модификации вариабельной области заключается в мутировании аминокислотных остатков в пределах областей CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH и/или VL, с улучшением таким образом одного или нескольких свойств связывания (например, аффинности) антитела, представляющего интерес, известном как "созревание аффинности". Для введения мутации(-й) можно осуществлять сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез, и эффект в отношении связывания антитела или другого функционального свойства, представляющего интерес, можно оценивать в анализах in vitro или in vivo, описанных в данном документе и представленных в примерах. Можно вводить консервативные модификации (которые обсуждаются выше). Мутации могут представлять собой замены, добавления или делеции аминокислот. Более того, как правило, изменяют не более одного, двух, трех, четырех или пяти остатков в пределах CDR-области.

ПРИВИТИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИХ ДОМЕНОВ НА АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ КАРКАСЫ ИЛИ ОСТОВЫ

Можно использовать широкий спектр каркасов или остовов антитела/иммуноглобулина при условии, что полученный в результате полипептид содержит по меньшей мере одну связывающую область, которая специфически связывается с BMP6. Такие каркасы или остовы включают 5 основных идиотипов иммуноглобулинов человека, их антигенсвязывающих фрагментов и включают иммуноглобулины других видов животных, предпочтительно имеющие гуманизированные составляющие. Антитела с одной тяжелой цепью, такие как идентифицированные у верблюдовых, представляют особый интерес в этом отношении. Специалисты в данной области техники продолжают открывать и разрабатывать новые каркасы, остовы и фрагменты.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антител на основе белков, отличных от иммуноглобулинов, с использованием остовов, отличных от иммуноглобулинов, на которые можно привить CDR по настоящему изобретению. Можно использовать известные или будущие каркасы и остовы, отличные от иммуноглобулинов, при условии, что они содержат связывающую область, специфичную в отношении целевого белка BMP6. Известные каркасы или остовы, отличные от иммуноглобулинов, включают без ограничения фибронектин (Compound Therapeutics, Inc., Уолтем, Массачусетс), анкирин (Molecular Partners AG, Цюрих, Швейцария), доменные антитела (Domantis, Ltd., Кембридж, Массачусетс и Ablynx nv, Звейнарде, Бельгия), липокалин (Pieris Proteolab AG, Фрайзинг, Германия), небольшие модульные иммунофармацевтические средства (Trubion Pharmaceuticals Inc., Сиэтл, Вашингтон), макситела (Avidia, Inc., Маунтин-Вью, Калифорния), белок A (Affibody AG, Швеция) и аффилин (гамма-кристаллин или убиквитин) (SciI Proteins GmbH, Галле, Германия).

Фибронектиновые остовы имеют в основе домен фибронектина типа III (например, десятый модуль фибронектина типа III (10 домен Fn3)). Домен фибронектина типа III имеет 7 или 8 бета-тяжей, которые распределены между двумя складчатыми бета-слоями, которые сами располагаются между друг другом, образуя сердцевину белка, и дополнительно содержит петли (аналогичные CDR), которые соединяют бета-тяжи друг с другом и являются доступными для растворителя. По меньшей мере три такие петли присутствуют на каждом краю сэндвича из складчатых бета-слоев, где край представляет собой границу белка, перпендикулярную направлению складчатых бета-слоев (см. патент США № 6818418). Эти остовы на основе фибронектина не являются иммуноглобулином, хотя общая укладка очень напоминает таковую у наименьшего функционального фрагмента антитела, вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит полную единицу распознавания антигена в IgG верблюда и ламы. Благодаря этой структуре антитело, отличное от иммуноглобулина, имитирует свойства связывания антигена, которые являются подобными по своей природе и аффинности свойствам антител. Эти остовы можно применять в стратегии рандомизации и шаффлинга петель in vitro, которая является подобной процессу созревания аффинности антител in vivo. Эти молекулы на основе фибронектина можно применять в качестве остовов, при этом области петель молекулы могут быть заменены на CDR по настоящему изобретению с применением стандартных методик клонирования.

Анкириновая технология основывается на применении белков с полученными из анкириновых повторов модулями в качестве остовов для переноса вариабельных участков, которые можно применять для связывания с различными мишенями. Модуль с анкириновым повтором представляет собой полипептид из 33 аминокислот, состоящий из двух антипараллельных альфа-спиралей и бета-изгиба. Связывание вариабельных областей в основном оптимизируют путем применения рибосомного дисплея.

Авимеры получают из природного белка, содержащего A-домен, такого как LRP-1. Эти домены используются по своей природе для белок-белковых взаимодействий, и у человека более 250 белков имеют в основе структуры A-домены. Авимеры состоят из ряда различных мономеров (2-10) "A-домена", связанных посредством аминокислотных линкеров. Авимеры, которые могут связываться с целевым антигеном, можно создавать с применением методики, описанной, например, в публикациях заявок на патент США №№ 20040175756; 20050053973; 20050048512 и 20060008844.

Аффинные лиганды, аффитела, представляют собой небольшие простые белки, состоящие из трехспирального пучка на основе остова из одного из связывающих IgG доменов белка A. Белок A представляет собой поверхностный белок бактерии Staphylococcus aureus. Этот домен остова состоит из 58 аминокислот, 13 из которых рандомизируют для создания библиотек аффител с большим количеством вариантов лигандов (см., например, патент США № 5831012). Молекулы аффител имитируют антитела, они имеют молекулярную массу 6 кДа в сравнении с молекулярной массой антител, которая составляет 150 кДа. Несмотря на свой небольшой размер, сайт связывания в молекулах аффител является подобным таковому у антитела.

Антикалины представляют собой продукты, разработанные компанией Pieris ProteoLab AG. Их получают из липокалинов, распространенной группы небольших и устойчивых белков, которые обычно вовлечены в физиологический транспорт или запасание химически чувствительных или нерастворимых соединений. Несколько природных липокалинов встречаются в тканях или биологических жидкостях человека. Структура белка напоминает иммуноглобулины с гипервариабельными петлями сверху на жестком каркасе. Тем не менее, в противоположность антителам или их рекомбинантным фрагментам липокалины состоят из одной полипептидной цепи с 160-180 аминокислотными остатками, при этом они лишь незначительно больше, чем один домен иммуноглобулина. Набор из четырех петель, которые образуют связывающий карман, проявляет выраженную структурную пластичность и допускает наличие ряда боковых цепей. Таким образом, сайт связывания можно видоизменить в запатентованном способе для того, чтобы распознавать заданные целевые молекулы различной формы с высокой аффинностью и специфичностью. Один белок семейства липокалинов, белок, связывающий билин (BBP), из Pieris Brassicae применяли для разработки антикалинов посредством осуществления мутагенеза набора из четырех петель. Одним примером патентной заявки, описывающей антикалины, является публикация согласно PCT № WO 199916873.

Молекулы аффилина представляют собой небольшие белки, отличные от иммуноглобулина, которые сконструированы с конкретными видами аффинности в отношении белков и малых молекул. Новые молекулы аффилина можно очень быстро выбрать из двух библиотек, каждая из которых имеет в основе отличающийся каркасный белок, происходящий от человека. Молекулы аффилина не проявляют какой-либо структурной гомологии с белками, представляющими собой иммуноглобулины. В настоящее время используют два аффилиновых остова, один из которых представляет собой гамма-кристаллин, структурный белок хрусталика глаза человека, а другой представляет собой белок суперсемейства "убиквитинов". Оба остова человека являются весьма небольшими, проявляют стабильность при высокой температуре и являются наиболее устойчивыми к изменениям pH и денатурирующим средствам. Эта высокая стабильность в основном обусловлена развернутой бета-складчатой структурой белков. Примеры белков, полученных из гамма-кристаллина, описаны в WO200104144, а примеры "убиквитин-подобных" белков описаны в WO2004106368.

Миметики эпитопов белков (PEM) представляют собой циклические пептидоподобные молекулы среднего размера (MW 1-2 кДа), имитирующие бета-шпилечные вторичные структуры белков, основную вторичную структуру, вовлеченную в белок-белковые взаимодействия.

Антитела человека, связывающие BMP6, можно создавать с помощью способов, которые известны из уровня техники. Например, технологию "человеческой инженерии" применяют для превращения антител, отличных от человеческих, в сконструированные антитела человека. В публикации заявки на патент США № 20050008625 описан осуществляемый in vivo способ замены вариабельной области антитела, отличного от человеческого, на вариабельную область человека в антителе с сохранением тех же или обеспечением лучших характеристик связывания по сравнению с таковыми у антитела, отличного от человеческого. Способ основывается на определяемой эпитопом замене вариабельных областей эталонного антитела, отличного от человеческого, на таковые полностью человеческого антитела. Полученное в результате антитело человека, в целом, является структурно неродственным эталонному антителу, отличному от человеческого, но связывается с одним и тем же эпитопом на том же антигене, что и эталонное антитело. Вкратце, подход с последовательной определяемой эпитопом комплементарной заменой обеспечивается за счет создания конкуренции в клетках между "конкурентом" и библиотекой разнообразных гибридов эталонного антитела ("тестируемые антитела") за связывание с антигеном, находящимся в ограниченных количествах, в присутствии репортерной системы, которая реагирует на связывание тестируемого антитела с антигеном. Конкурентом может быть эталонное антитело или его производное, такое как одноцепочечный Fv-фрагмент. Конкурентом также может быть природный или искусственный лиганд антигена, который связывается с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело. Единственными требованиями к конкуренту является то, чтобы он связывался с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело, и чтобы он конкурировал с эталонным антителом за связывание с антигеном. Тестируемые антитела имеют одну общую антигенсвязывающую V-область из эталонного антитела, отличного от человеческого, и другую V-область, выбранную случайным образом из иного источника, такого как репертуарная библиотека антител человека. Общая V-область из эталонного антитела служит в качестве указателя, располагая тестируемые антитела на одном и том же эпитопе на антигене и в одной и той же ориентации для того, чтобы выбор склонялся в сторону наиболее высокого качества связывания с антигеном относительно эталонного антитела.

Много типов репортерных систем можно применять для выявления требуемых взаимодействий между тестируемыми антителами и антигеном. Например, соответствующие друг другу репортерные фрагменты могут быть связаны соответственно с антигеном и тестируемым антителом для того, чтобы активация репортера вследствие соответствия фрагментов происходила только тогда, когда тестируемое антитело связывается с антигеном. Если продукты слияния из тестируемого антитела-репортерного фрагмента и антигена-репортерного фрагмента коэкспрессируются с конкурентом, активация репортера становится зависимой от способности тестируемого антитела конкурировать с конкурентом, что является пропорциональным аффинности тестируемого антитела в отношении антигена. Другие репортерные системы, которые можно применять, включают реактиватор самоингибируемой системы реактивации репортера (RAIR), которая раскрыта в заявке на патент США с регистрационным № 10/208730 (публикация № 20030198971), или систему конкурентной активации, раскрытую в заявке на патент США с регистрационным № 10/076845 (публикация № 20030157579).

При использовании системы последовательной определяемой эпитопом комплементарной замены проводят отбор для идентификации клеток, экспрессирующих одно тестируемое антитело вместе с конкурентом, антигеном и компонентами репортера. В этих клетках каждое тестируемое антитело конкурирует индивидуально с конкурентом за связывание с антигеном, находящимся в ограниченном количестве. Активность репортера является пропорциональной количеству антигена, связавшегося с тестируемым антителом, что, в свою очередь, является пропорциональным аффинности тестируемого антитела в отношении антигена и стабильности тестируемого антитела. Тестируемые антитела изначально выбирают на основании их активности по сравнению с активностью эталонного антитела при экспрессии в виде тестируемого антитела. Результатом первого раунда отбора является набор "гибридных" антител, каждое из которых состоит из одинаковой V-области, отличной от человеческой, из эталонного антитела и V-области человека из библиотеки, и каждое из которых связывается с одним и тем же эпитопом на антигене, что и эталонное антитело. Одно или несколько гибридных антител, выбранных в первом раунде, будут характеризоваться аффинностью в отношении антигена, сравнимой или большей, чем таковая у эталонного антитела.

На второй стадии замены V-области V-области человека, выбранные на первой стадии, используют в качестве указателя для выбора человеческих заменяющих фрагментов для остальной части V-области эталонного антитела, отличного от человеческого, с использованием разнообразной библиотеки когнатных V-областей человека. Гибридные антитела, выбранные в первом раунде, также можно применять в качестве конкурентов для второго раунда отбора. Результатом второго раунда отбора является набор полностью человеческих антител, которые структурно отличаются от эталонного антитела, но которые конкурируют с эталонным антителом за связывание с одним и тем же антигеном. Некоторые из отобранных антител человека связываются с одним и тем же эпитопом на том же антигене, что и эталонное антитело. Среди этих отобранных антител человека одно или несколько связываются с одним и тем же эпитопом с аффинностью, которая является сравнимой или большей, чем таковая у эталонного антитела.

При применении одного из вышеописанных мышиных или химерных антител, связывающих BMP6, в качестве эталонного антитела, этот способ можно с легкостью использовать для создания антител человека, которые связываются с BMP6 человека с такой же специфичностью связывания и такой же или лучшей аффинностью связывания. Кроме того, такие антитела человека, связывающие BMP6, также могут быть коммерчески получены от компаний, которые производят антитела человека на заказ, например, KaloBios, Inc. (Маунтин-Вью, Калифорния).

АНТИТЕЛА ВЕРБЛЮДОВЫХ

Белки, представляющие собой антитела, полученные из представителей семейства, к которому относятся двугорбые верблюды и одногорбые верблюды (Camelus bactrianus и Calelus dromaderius), в том числе представителей из видов Нового Света, таких как виды лам (Lama paccos, Lama glama и Lama vicugna), были охарактеризованы в отношении размера, сложности структуры и антигенности в отношении субъектов-людей. У определенных антител IgG этого семейства млекопитающих, которые обнаруживаются в природе, отсутствуют легкие цепи, и, следовательно, они отличаются в плане структуры от типичной четырехцепочечной четвертичной структуры, характеризующейся двумя тяжелыми и двумя легкими цепями, у антител от других животных. См. PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, опубликованная 3 марта 1994 года).

Область антитела верблюдовых, которая представляет собой небольшой отдельный вариабельный домен, идентифицированный как VHH, можно получить с помощью генной инженерии для получения небольшого белка, характеризующегося высокой аффинностью в отношении мишени, что приводит в результате к полученному из антитела белку с низкой молекулярной массой, известному как "нанотело верблюдовых". См. патент США № 5759808, выданный 2 июня 1998 года; см. также Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; и Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Сконструированные библиотеки антител верблюдовых и фрагментов антител являются коммерчески доступными, например, от Ablynx, Гент, Бельгия. Как и в случае других антител и их антигенсвязывающих фрагментов, происходящих из организма, отличного от человека, аминокислотную последовательность антитела верблюдовых можно изменить рекомбинантным способом с получением последовательности, которая более точно напоминает последовательность человека, т. е. нанотело можно "гуманизировать". Таким образом можно дополнительно снизить природную низкую антигенность антител верблюдовых у людей.

Нанотело верблюдовых имеет молекулярную массу, составляющую примерно одну десятую от массы молекулы IgG человека, и белок имеет физический диаметр лишь несколько нанометров. Одним следствием небольшого размера является способность нанотел верблюдовых связываться с сайтами антигенов, которые являются функционально невидимыми для белков, представляющих собой антитела большего размера, т. е. нанотела верблюдовых являются применимыми в качестве реагентов для выявления антигенов, которые в ином случае являются скрытыми при использовании классических иммунологических методик, и в качестве возможных терапевтических средств. Таким образом, еще одним следствием небольшого размера является то, что нанотело верблюдовых может осуществлять ингибирование в результате связывания с конкретным сайтом в бороздке или узком углублении целевого белка и, следовательно, может служить в качестве, которое более точно походит на функцию классического низкомолекулярного лекарственного средства, чем таковую у классического антитела.

Низкая молекулярная масса и компактный размер дополнительно приводят к тому, что нанотела верблюдовых являются чрезвычайно термостабильными, устойчивыми к экстремальным значениям pH и к протеолитическому расщеплению и характеризуются слабой антигенностью. Другим следствием является то, что нанотела верблюдовых легко перемещаются из кровеносной системы в ткани и даже пересекают гематоэнцефалический барьер и могут обеспечивать лечение нарушений, которые поражают нервную ткань. Нанотела могут дополнительно способствовать транспорту лекарственного средства через гематоэнцефалический барьер. См. заявку на патент США 20040161738, опубликованную 19 августа 2004 года. Эти признаки в сочетании с низкой антигенностью у людей указывают на большой терапевтический потенциал. Кроме того, эти молекулы можно полностью экспрессировать в прокариотических клетках, таких как E. coli, и они экспрессируются в виде слитых белков с использованием бактериофага и являются функциональными.

Соответственно, признаком настоящего изобретения является антитело или нанотело верблюдовых, характеризующееся высокой аффинностью в отношении BMP6. В одном варианте осуществления в данном документе антитело или нанотело верблюдовых продуцируется в естественных условиях у животного семейства верблюдовых, т. е. оно продуцируется верблюдовыми после иммунизации с помощью BMP6 или фрагмента его пептида при применении методик, описанных в данном документе для других антител. В качестве альтернативы нанотело верблюдовых, связывающее BMP6, конструируют, т. е. получают посредством отбора, например, из библиотеки фагов, на которых проявляются подвергнутые соответствующему мутагенезу белки, представляющие собой нанотела верблюдовых, с применением процедур пэннинга с BMP6 в качестве мишени, как описано в примерах в данном документе. Сконструированные нанотела можно дополнительно адаптировать к конкретным требованиям с помощью генной инженерии так, чтобы они имели период полужизни у субъекта-реципиента от 45 минут до двух недель. В конкретном варианте осуществления антитело или нанотело верблюдовых получают посредством привития последовательностей CDR тяжелой или легкой цепей антител человека по настоящему изобретению на каркасные последовательности нанотела или однодоменного антитела, как описано, например, в PCT/EP93/02214.

БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЫ И МУЛЬТИВАЛЕНТНЫЕ АНТИТЕЛА

В другом аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическим или мультиспецифическим молекулам, содержащим антитело, связывающее BMP6, или его фрагмент по настоящему изобретению. Антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающие области можно дериватизировать или связать с другой функциональной молекулой, например, с другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом рецептора) с получением биспецифической молекулы, которая связывается с по меньшей мере двумя различными сайтами связывания или целевыми молекулами. Антитело по настоящему изобретению, по сути, можно дериватизировать или связать с более чем одной другой функциональной молекулой с получением мультиспецифических молекул, которые связываются с более чем двумя различными сайтами связывания и/или целевыми молекулами; также предполагается, что такие мультиспецифические молекулы охватываются используемым в данном документе термином "биспецифическая молекула". Для создания биспецифической молекулы по настоящему изобретению антитело по настоящему изобретению можно функционально связать (например, посредством химического связывания, генетического слияния, нековалентного соединения или иным образом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, как, например, другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, в результате чего получают биспецифическую молекулу.

Соответственно, настоящее изобретение включает биспецифические молекулы, содержащие по меньшей мере один первый элемент, обеспечивающий специфичность связывания в отношении BMP6, и второй элемент, обеспечивающий специфичность связывания в отношении второго целевого эпитопа. Например, второй целевой эпитоп представляет собой другой эпитоп BMP6, отличающийся от первого целевого эпитопа.

Кроме того, в случае настоящего изобретения, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифической, молекула может дополнительно включать третий элемент, обеспечивающий специфичность связывания, в дополнение к таковым в отношении первого и второго целевых эпитопов.

В одном варианте осуществления биспецифические молекулы по настоящему изобретению содержат в качестве элемента, обеспечивающего специфичность связывания, по меньшей мере одно антитело или его фрагмент антитела, в том числе, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Антитело также может представлять собой димер легких цепей или тяжелых цепей или любой их минимальный фрагмент, такой как Fv или одноцепочечная конструкция, которая описана в Ladner et al., патент США № 4946778.

Диатела представляют собой бивалентные биспецифические молекулы, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, соединенные линкером, который является слишком коротким для того, чтобы обеспечить возможность спаривания между двумя доменами на одной и той же цепи. Домены VH и VL образуют пары с комплементарными доменами другой цепи, таким образом создавая два сайта связывания антигена (см., например, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Диатела можно получать посредством экспрессии двух полипептидных цепей либо со структурой VHA-VLB и VHB-VLA (конфигурация VH-VL), либо VLA-VHB и VLB-VHA (конфигурация VL-VH) в одной и той же клетке. Большинство из них могут экспрессироваться в растворимой форме в бактериях. Одноцепочечные диатела (scDb) получают путем соединения двух образующих диатело полипептидных цепей с линкером из примерно 15 аминокислотных остатков (см. Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36). scDb могут экспрессироваться в бактериях в растворимой активной мономерной форме (см. Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2 (1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3 (2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7):617-21). Диатело можно сливать с Fc с получением "ди-диатела" (см. Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279 (4):2856-65).

Другие антитела, которые могут использоваться в биспецифических молекулах по настоящему изобретению, представляют собой мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.

Биспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получить посредством конъюгирования составляющих элементов, обеспечивающих специфичность связывания, с помощью способов, известных из уровня техники. Например, каждый элемент, обеспечивающий специфичность связывания, в биспецифической молекуле можно получить отдельно, а затем конъюгировать друг с другом. Если элементы, обеспечивающие специфичность связывания, представляют собой белки или пептиды, ряд связывающих или сшивающих средств можно применять для ковалентного конъюгирования. Примеры сшивающих средств включают белок A, карбодиимид, N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие способы включают способы, описанные в Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), и Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Конъюгирующие средства представляют собой SATA и сульфо-SMCC, оба из них доступны от Pierce Chemical Co. (Рокфорд, Иллинойс).

Если элементы, обеспечивающие специфичность связыванию, представляют собой антитела, их можно конъюгировать путем связывания посредством сульфгидрильной группы C-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. В конкретном варианте осуществления шарнирную область модифицируют таким образом, чтобы она содержала нечетное количество остатков с сульфгидрильной группой, например один, перед конъюгированием.

В качестве альтернативы оба элемента, обеспечивающие специфичность связывания, могут быть закодированы в одном векторе и могут экспрессироваться и собираться в одной клетке-хозяине. Этот способ является особенно применимым в случае, когда биспецифическая молекула представляет собой слитый белок mAb X mAb, mAb X Fab, Fab X F(ab')2 или лиганд X Fab. Биспецифическая молекула по настоящему изобретению может представлять собой одноцепочечную молекулу, содержащую одно одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, содержащую две связывающих детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США № 5260203; патенте США № 5455030; патенте США № 4881175; патенте США № 5132405; патенте США № 5091513; патенте США № 5476786; патенте США № 5013653; патенте США № 5258498 и патенте США № 5482858.

Связывание биспецифических молекул со своими специфическими мишенями можно подтвердить, например, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунологического анализа (REA), FACS-анализа, биологического анализа (например, ингибирования роста) или анализа посредством вестерн-блоттинга. В каждом из этих анализов обычно выявляют наличие комплексов белок-антитело, представляющих особый интерес, путем использования меченого реагента (например, антитела), специфичного в отношении комплекса, представляющего интерес.

В другом аспекте настоящее изобретении предусматривает мультивалентные соединения, содержащие по меньшей мере две идентичные или отличающиеся антигенсвязывающие части антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, связывающиеся с BMP6. Антигенсвязывающие части могут быть связаны вместе посредством слияния белков или ковалентной или нековалентной связи. В качестве альтернативы способы связывания были описаны для биспецифических молекул. Тетравалентные соединения можно получить, например, путем сшивания антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связываются с константными областями антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, например, Fc или шарнирной областью.

Тримеризующий домен описан, например, в патенте EP 1012280B1, принадлежащем Borean. Пентамеризующие модули описаны, например, в PCT/EP97/05897.

АНТИТЕЛА С УВЕЛИЧЕННЫМ ПЕРИОДОМ ПОЛУЖИЗНИ

В настоящем изобретении предусмотрены антитела, которые специфически связываются с BMP6, которые характеризуются увеличенным периодом полужизни in vivo.

Многие факторы могут влиять на период полужизни белка in vivo. Например, фильтрация в почках, метаболизм в печени, разрушение посредством протеолитических ферментов (протеаз) и иммунные ответы (например, нейтрализация белка посредством антител и поглощение макрофагами и дендритными клетками). Для увеличения времени полужизни антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению можно применять ряд стратегий. Например, химическое связывание с полиэтиленгликолем (PEG), reCODE PEG, остовом антитела, полисиаловой кислотой (PSA), гидроксиэтилкрахмалом (HES), альбуминсвязывающими лигандами и углеводными защитными фрагментами; генетическое слияние с белками, связывающимися с белками сыворотки крови, такими как альбумин, IgG, FcRn, и перенос; соединение (генетическое или химическое) с другими связывающими фрагментами, которые связываются с белками сыворотки крови, такими как нанотела, молекулы Fab, молекулы DARPin, авимеры, аффитела и антикалины; генетическое слияние с rPEG, альбумином, доменом альбумина, альбуминсвязывающими белками и Fc; или включение в наноносители, составы с медленным высвобождением или медицинские устройства.

Для продления циркуляции антител в сыворотке крови in vivo молекулы инертного полимера, такого как высокомолекулярный PEG, могут быть присоединены к антителам или их фрагментам с помощью многофункционального линкера или без него посредством сайт-специфической конъюгации PEG с N- или С-концом антител либо посредством эпсилон-аминогрупп, присутствующих в лизиновых остатках. Для пегилирования антитела антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, как правило, вводят в реакцию с полиэтиленгликолем (PEG), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное PEG, в условиях, при которых одна или более групп PEG присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Пегилирование можно осуществлять посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Предполагается, что используемый в данном документе термин "полиэтиленгликоль" охватывает любую из форм PEG, которые применяли для дериватизации других белков, как, например, моно(C1-C10)алокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В одном варианте осуществления антитело, подлежащее пегилированию, представляет собой агликозилированное антитело. Будет применяться дериватизация с помощью линейного или разветвленного полимера, которая приводит к минимальной потере биологической активности. Степень конъюгации можно тщательно контролировать посредством SDS-PAGE и масс-спектрометрии для обеспечения надлежащей конъюгации молекул PEG с антителами. Непрореагировавший PEG можно отделить от конъюгатов антитело-PEG посредством эксклюзионной или ионообменной хроматографии. PEG-дериватизированные антитела можно тестировать в отношении связывающей активности, а также в отношении эффективности in vivo с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, например, посредством иммуноанализов, описанных в данном документе. Способы пегилирования белков известны из уровня техники и могут применяться по отношению к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению. См., например, EP 0154316 за авторством Nishimura et al. и EP 0401384 за авторством Ishikawa et al.

Другие модифицированные технологии пегилирования включают технологию направленного конструирования, которая обеспечивает химическую ортогональность с использованием преобразованной системы биосинтеза (ReCODE PEG), при которой химически специфические боковые цепи включаются в биосинтетические белки посредством преобразованной системы, которая включает синтетазу tRNA и tRNA. Данная технология позволяет включать более чем 30 новых аминокислот в биосинтетические белки в E. coli, дрожжах и клетках млекопитающих. tRNA включает стандартную аминокислоту в любом месте, где расположен терминирующий кодон, преобразовывая кодон из терминирующего в такой, который передает сигнал о включении химически специфической аминокислоты.

Технология рекомбинантного пегилирования (rPEG) так же может применяться для увеличения периода полужизни в сыворотке крови. Данная технология предусматривает генетическое слияние хвоста белка из 300-600 аминокислот произвольной структуры с существующим фармацевтическим белком. Поскольку кажущаяся молекулярная масса такой белковой цепи произвольной структуры в приблизительно 15 раз превышает ее фактическую молекулярную массу, период полужизни белка в сыворотке крови значительно увеличивается. В отличие от традиционного пегилирования, для которого требуется химическая конъюгация и повторная очистка, способ изготовления значительно упрощается, и продукт является однородным.

Полисиалирование представляет собой другую технологию, в которой используется природный полимер, полисиаловая кислота (PSA), для продления срока действия и улучшения стабильности терапевтических пептидов и белков. PSA представляет собой полимер сиаловой кислоты (сахар). При применении для доставки лекарственного средства на основе белка и терапевтического пептида полисиаловая кислота обеспечивает защитную микросреду при конъюгации. Это увеличивает срок действия терапевтического белка в кровотоке и предотвращает его распознавание иммунной системой. Полимер, представляющий собой PSA, в естественных условиях обнаруживается в организме человека. Он был усвоен некоторыми бактериями, которые эволюционировали на протяжении миллионов лет с покрытием их стенок им. Данные полисиалированные в естественных условиях бактерии затем были способны благодаря молекулярной мимикрии противодействовать защитной системе организма. PSA, которую можно отнести к совершенной природной технологии малозаметности, можно с легкостью получить из таких бактерий в больших количествах и с заданными физическими характеристиками. Бактериальная PSA является полностью неимуногенной, даже когда связана с белками, так как она является химически идентичной PSA в организме человека.

Другая технология предусматривает применение производных гидроксиэтилкрахмала ("HES"), связанных с антителами. HES представляет собой модифицированный природный полимер, полученный из крахмала восковой кукурузы, и может быть метаболизирован посредством ферментов организма. Растворы HES обычно вводят для восполнения недостающего объема крови и улучшения реологических свойств крови. Модифицирование антитела с помощью HES позволяет продлить период полужизни в кровотоке за счет увеличения стабильности молекулы, а также за счет уменьшения почечного очищения, что приводит к увеличению биологической активности. Изменяя различные параметры, такие как молекулярная масса HES, можно адаптировать к конкретным требованиям широкий спектр конъюгатов HES-антитело.

Антитела, характеризующиеся увеличенным периодом полужизни in vivo, также можно получить путем введения одной или нескольких аминокислотных модификаций (т. е. замен, вставок или делеций) в константный домен IgG или его связывающий FcRn фрагмент (предпочтительно Fc или шарнирный фрагмент Fc домена). См., например, международную публикацию № WO 98/23289; международную публикацию № WO 97/34631 и патент США № 6277375.

Кроме того, антитела можно конъюгировать с альбумином, чтобы сделать антитело или фрагмент антитела более стабильными in vivo, или чтобы они характеризовали более длительным периодом полужизни in vivo. Методики являются хорошо известными из уровня техники, см., например, международные публикации №№ WO 93/15199, WO 93/15200 и WO 01/77137 и европейский патент № EP 413622.

Стратегии по увеличению периода полужизни являются особенно применимыми для нанотел, связующих молекул на основе фибронектина и других антител или белков, для которых требуется увеличенный период полужизни in vivo.

КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛ

В настоящем изобретении предусмотрены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с BMP6, слитые с помощью рекомбинантного способа или химически конъюгированные (в том числе посредством как ковалентного, так и нековалентного конъюгирования) с гетерологичным белком или полипептидом (или его антигенсвязывающим фрагментом, предпочтительно с полипептидом из по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аминокислот) с получением слитых белков. В частности, в настоящем изобретении предусмотрены слитые белки, содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, описанного в данном документе (например, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, VH-домен, CDR VH, VL-домен или CDR VL) и гетерологичный белок, полипептид или пептид. Способы слияния или конъюгирования белков, полипептидов или пептидов с антителом или фрагментом антитела известны из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851 и 5112946; европейские патенты №№ EP 307434 и EP 367166; международные публикации №№ WO 96/04388 и WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; и Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.

Дополнительные слитые белки можно создать посредством методик шаффлинга генов, шаффлинга мотивов, шаффлинга экзонов и/или шаффлинга кодонов (совокупно называемых "шаффлингом ДНК"). Шаффлинг ДНК можно использовать для изменения видов активности антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению (например, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты с более высокими значениями аффинности и более низкими значениями скорости диссоциации). См., в целом, патенты США №№ 5605793, 5811238, 5830721, 5834252 и 5837458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16 (2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; и Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313 (каждый из данных патентов и публикаций включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или кодируемые антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно изменить посредством воздействия на них случайного мутагенеза с помощью ПЦР с внесением ошибок, случайной вставки нуклеотидов или других способов перед рекомбинацией. Полинуклеотид, кодирующий антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с BMP6, может быть подвергнут рекомбинации с одним или несколькими компонентами, мотивами, секциями, частями, доменами, фрагментами и т. д. одной или нескольких гетерологичных молекул.

Более того, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно слить с маркерными последовательностями, таким как пептид, для облегчения очистки. В одном варианте осуществления маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид (SEQ ID NO: 97), как, например, метка, предусмотренная в векторе pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Чатсворт, Калифорния, 91311), среди прочих, многие из которых являются коммерчески доступными. Например, как описано в Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, гексагистидин (SEQ ID NO: 97) обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, применимые для очистки, включают без ограничения гемагглютининовую ("HA") метку, которая соответствует эпитопу, полученному из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), и метку "flag".

В одном варианте осуществления антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению конъюгированы с диагностическим или выявляемым средством. Такие антитела могут быть применимыми для контроля или прогнозирования начала проявления, развития, прогрессирования и/или степени тяжести заболевания или нарушения в рамках процедуры клинического тестирования, такой как определение эффективности конкретной терапии. Такую диагностику и выявление можно осуществлять посредством связывания антитела с выявляемыми веществами, в том числе без ограничения с различными ферментами, такими как без ограничения пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинтрансфераза; простетическими группами, такими как без ограничения стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентными материалами, такими как без ограничения умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин-изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресценин, дансил-хлорид или фикоэритрин; люминесцентными материалами, такими как без ограничения люминол; биолюминесцентными материалами, такими как без ограничения люцифераза, люциферин и экворин; радиоактивными материалами, такими как без ограничения йод (131I, 125I, 123I и 121I), углерод (14C), сера (35S), тритий (3H), индий (115In, 113In, 112In и 111In), технеций (99Tc), таллий (201Ti), галлий (68Ga, 67Ga), палладий (103Pd), молибден (99Mo), ксенон (133Xe), фтор (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn и 117Олово; и позитронно-активными металлами, применяющимися в различных методах позитронно-эмиссионной томографии, и ионами нерадиоактивных парамагнитных металлов.

Настоящим изобретением дополнительно охватываются пути применения антител и их антигенсвязывающих фрагментов, конъюгированных с терапевтическим фрагментом. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксин, например, цитостатическое или цитоцидное средство, терапевтическое средство или ион радиоактивного металла, например, излучатели альфа-частиц. Цитотоксин или цитотоксическое средство включает любое средство, которое является пагубным для клеток.

Кроме того, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент могут быть конъюгированы с терапевтическим фрагментом или фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, который модифицирует заданный биологический ответ. Терапевтические фрагменты или фрагменты, представляющие собой лекарственные средства, не следует рассматривать как ограниченные классическими химическими терапевтическими средствами. Например, фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, может представлять собой белок, пептид или полипептид, обладающие требуемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин A, экзотоксин синегнойной палочки, холерный токсин или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли, альфа-интерферон, бета-интерферон, фактор роста нервов, фактор роста тромбоцитов, тканевой активатор плазминогена, апоптическое средство, антиангиогенное средство или модификатор биологического ответа, такой как, например, лимфокин.

Более того, антитело можно конъюгировать с терапевтическими фрагментами, такими как ион радиоактивного металла, такого как излучатели альфа-частиц, как например, 213Bi, или с макроциклическими хелаторами, пригодными для конъюгирования ионов радиоактивных металлов, в том числе без ограничения 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, с полипептидами. В одном варианте осуществления макроциклический хелатор представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусную кислоту (DOTA), которая может быть прикреплена к антителу посредством молекулы линкера. Такие молекулы линкера являются широко известными в уровне техники и описаны в Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4 (10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4):553-7; и Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50, каждая из которых включена посредством ссылки во всей своей полноте.

Методики конъюгирования терапевтических фрагментов с антителами являются хорошо известными, см., например, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), и Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.

Антитела также могут быть прикреплены к твердым подложкам, которые являются особенно применимыми для иммунологических анализов или очистки целевого антигена. Такие твердые подложки включают без ограничения стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела

В настоящем изобретении предусмотрены в значительной степени очищенные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды, содержащие вышеописанные сегменты или домены цепей антитела, связывающего BMP6. Некоторые из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, показанную в любой из SEQ ID NO: 16; 36; 56 или 76, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, показанную в любой из SEQ ID NO: 26; 46; 66 или 86. В конкретном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы, идентифицированные в таблице 1. Некоторые другие молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержат нуклеотидные последовательности, которые являются практически идентичными (например, на по меньшей мере 65, 80%, 95% или 99%) нуклеотидным последовательностям, идентифицированным в таблице 1. При экспрессии с соответствующих векторов экспрессии полипептиды, кодируемые этими полинуклеотидами, способны проявлять способность к связыванию антигена BMP6.

В настоящем изобретении также предусмотрены полинуклеотиды, которые кодируют по меньшей мере одну CDR-область, а обычно все три CDR-области из тяжелой или легкой цепи антитела, связывающего BMP6, изложенного в таблице 1 и/или таблице 14. Некоторые другие полинуклеотиды кодируют все или практически все из последовательности вариабельной области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела, связывающего BMP6, изложенного в таблице 1 и/или таблице 14. Вследствие вырожденности кода ряд последовательностей нуклеиновой кислоты будут кодировать каждую из аминокислотных последовательностей иммуноглобулина.

Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут кодировать как вариабельную область, так и константную область антитела. Некоторые из последовательностей нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержат нуклеотиды, кодирующие зрелую последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая является практически идентичной (например, на по меньшей мере 80%, 90% или 99%) зрелой последовательности вариабельной области тяжелой цепи, изложенной в любой из SEQ ID NO: 16; 36; 56 или 76. Некоторые другие последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотид, кодирующий зрелую последовательность вариабельной области легкой цепи, которая является практически идентичной (например, на по меньшей мере 80%, 90% или 99%) зрелой последовательности вариабельной области легкой цепи, изложенной в любой из SEQ ID NO: 26; 46; 66 или 86.

Последовательности полинуклеотида можно получить с помощью твердофазного синтеза ДНК de novo или с помощью ПЦР-мутагенеза существующей последовательности (например, последовательностей, которые описаны в примерах ниже), кодирующей антитело, связывающее BMP6, или его связывающий фрагмент. Непосредственный химический синтез нуклеиновых кислот можно осуществлять с помощью способов, известных из уровня техники, таких как фосфотриэфирный способ из Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; фосфодиэфирный способ из Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; диэтилфосфорамидитный способ из Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; и способ с использованием твердой подложки из патента США № 4458066. Введение мутаций в последовательность полинуклеотида с помощью ПЦР можно осуществлять, как описано, например, в PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; и Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

Также в настоящем изобретении предусмотрены векторы экспрессии и клетки-хозяева для продуцирования вышеописанных антител, связывающих BMP6. Различные векторы экспрессии можно использовать для экспрессии полинуклеотидов, кодирующих цепи антитела, связывающего BMP6, или связывающие фрагменты. Как вирусные, так и невирусные векторы экспрессии можно применять для продуцирования антител в клетке-хозяине млекопитающего. Невирусные векторы и системы включают плазмиды, эписомные векторы, как правило, с кассетой экспрессии для экспрессии белка или РНК и искусственные хромосомы человека (см., например, Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997). Например, невирусные векторы, применимые для экспрессии полинуклеотидов и полипептидов, связывающих BMP6, в клетках млекопитающего (например, человека), включают pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), векторы MPSV и многочисленные другие векторы, известные из уровня техники для экспрессии других белков. Применимые вирусные векторы включают векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса, векторы на основе SV40, папилломавируса, вируса Эпштейна-Барра HBP, векторы на основе вируса коровьей оспы и вируса леса Семлики (SFV). См. Brent et al., выше; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; и Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

Выбор вектора экспрессии зависит от предполагаемых клеток-хозяев, в которых должен экспрессироваться вектор. Как правило, векторы экспрессии содержат промотор и другие регуляторные последовательности (например, энхансеры), которые функционально связаны с полинуклеотидами, кодирующими цепь антитела, связывающего BMP6, антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления индуцируемый промотор используют для предотвращения экспрессии вставленных последовательностей в условиях, отличающихся от индуцирующих. Индуцируемые промоторы включают, например, арабинозный, lacZ, металлотионеиновый промотор или промотор белка теплового шока. Культуры трансформированных организмов можно размножать в неиндуцирующих условиях, не оказывая влияния на популяцию кодирующими последовательностями, продукты экспрессии которых лучше переносятся клетками-хозяевами. Дополнительно к промоторам другие регуляторные элементы также могут быть необходимыми или требуемыми для эффективной экспрессии цепи антитела, связывающего BMP6, антигенсвязывающего фрагмента. Эти элементы, как правило, включают инициирующий кодон ATG и смежный сайт связывания рибосомы или другие последовательности. Кроме того, эффективность экспрессии можно повысить путем включения энхансеров, соответствующих применяемой клеточной системе (см., например, Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; и Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Например, энхансер SV40 или энхансер CMV можно применять для повышения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающего.

Векторы экспрессии также могут предусматривать положение сигнальной последовательности секреции с образованием слитого белка с полипептидами, кодируемыми вставленными последовательностями антитела, связывающего BMP6. Чаще вставляемые последовательности антитела, связывающего BMP6, связывают с сигнальными последовательностями перед включением в вектор. Векторы, подлежащие применению для получения последовательностей, кодирующих вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела, связывающего BMP6, иногда также кодируют константные области или их части. Такие векторы обеспечивают возможность экспрессии вариабельных областей в виде слитых белков с константными областями, таким образом приводя к продуцированию интактных антител и их антигенсвязывающих фрагментов. Как правило, такие константные области являются человеческими.

Клетки-хозяева для сборки и экспрессии цепей антитела, связывающего BMP6, могут быть прокариотическими либо эукариотическими. E. coli представляет собой один прокариотический хозяин, применимый для клонирования и экспрессии полинуклеотидов по настоящему изобретению. Другие микробные хозяева, подходящие для применения, включают бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. Для этих прокариотических хозяев также можно создать векторы экспрессии, которые, как правило, содержат последовательности для управления экспрессией, совместимые с клеткой-хозяином (например, точку начала репликации). Кроме того, будет присутствовать любое количество разнообразных хорошо известных промоторов, как, например, лактозная промоторная система, триптофановая (trp) промоторная система, бета-лактамазная промоторная система или промоторная система из фага лямбда. Промоторы, как правило, управляют экспрессией, необязательно с операторной последовательностью, и имеют последовательности сайта связывания рибосомы и т. п. для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Другие микробы, такие как дрожжи, также можно использовать для экспрессии полипептидов, связывающих BMP6, по настоящему изобретению. Также можно применять клетки насекомых в сочетании с бакуловирусными векторами.

В одном варианте осуществления клетки-хозяева млекопитающего применяют для экспрессии и продуцирования полипептидов, связывающих BMP6, по настоящему изобретению. Например, они могут представлять собой либо линию клеток гибридомы, экспрессирующую эндогенные гены иммуноглобулинов (например, клон 1D6.C9 гибридомы из миеломы, который описан в примерах), либо линию клеток млекопитающего, несущую экзогенный вектор экспрессии (например, клетки миеломы SP2/0, приведенные в качестве примера ниже). Они включают любые нормальные мортальные или нормальные или аномальные иммортальные клетки животного или человека. Например, был разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные иммуноглобулины, в том числе линии клеток CHO, различные линии клеток Cos, клетки HeLa, линии клеток миеломы, трансформированные B-клетки и гибридомы. Применение тканевой культуры клеток млекопитающего для экспрессии полипептидов в общем обсуждается, например, в Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Векторы экспрессии для клеток-хозяев млекопитающих могут включать последовательности для управления экспрессии, такие как точка начала репликации, промотор и энхансер (см., например, Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), и необходимые сайты процессинга информации, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминатора транскрипции. Эти векторы экспрессии обычно содержат промоторы, полученные из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Подходящие промоторы могут быть конститутивными, специфическими в отношении типа клеток, специфическими в отношении стадии развития и/или модулируемыми или регулируемыми. Применимые промоторы включают без ограничения металлотионеиновый промотор, конститутивный большой поздний промотор аденовируса, индуцируемый дексаметазоном промотор MMTV, промотор SV40, промотор poIIII MRP, конститутивный промотор MPSV, индуцируемый тетрациклином промотор CMV (такой как предранний промотор CMV человека), конститутивный промотор CMV и комбинации промотор-энхансер, известные из уровня техники.

Способы введения векторов экспрессии, содержащих последовательности полинуклеотидов, представляющие интерес, изменяются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию с использованием хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно применять для других клеток-хозяев. (См., в целом, Sambrook, et al., выше). Другие способы включают, например, электропорацию, обработку фосфатом кальция, трансформацию, опосредованную липосомами, инъекцию и микроинъекцию, баллистические способы, виросомы, иммунолипосомы, конъюгаты поликатион:нуклеиновая кислота, депротеинизированную ДНК, искусственные вирионы, слияние со структурным белком VP22 вируса герпеса (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), усиленное средством поглощение ДНК и трансдукцию ex vivo. Для длительного продуцирования рекомбинантных белков с высоким выходом часто будет требоваться стабильная экспрессия. Например, линии клеток, которые стабильно экспрессируют цепи антитела, связывающего BMP6, или связывающие фрагменты, можно получить с применением векторов экспрессии по настоящему изобретению, которые содержат вирусные точки начала репликации или эндогенные экспрессионные элементы и ген селектируемого маркера. После введения вектора можно обеспечивать рост клеток в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед их переносом на селективную среду. Целью селектируемого маркера является придание устойчивости к факторам отбора, и его присутствие обеспечивает возможность роста клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности в селективных средах. Пролиферация устойчивых стабильно трансфицированных клеток может обеспечиваться с применением методик тканевой культуры, соответствующих типу клеток.

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Моноклональные антитела (mAb) можно получать с помощью ряда методик, в том числе традиционного способа моноклональных антител, например, стандартной методики гибридизации соматических клеток по Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495. Можно использовать множество методик получения моноклонального антитела, например, вирусную или онкогенную трансформацию B-лимфоцитов.

Животная система для получения гибридом представляет собой мышиную систему. Получение гибридомы у мыши является хорошо отработанной процедурой. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны из уровня техники. Партнеры по слиянию (например, клетки миеломы мыши) и процедуры слияния также являются известными.

Химерные или гуманизированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно получить на основании последовательности моноклонального антитела мыши, полученной, как описано выше. ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепи иммуноглобулинов, можно получить из представляющей интерес мышиной гибридомы и подвергнуть конструированию таким образом, чтобы она содержала последовательности иммуноглобулина, отличные от мышиных (например, человеческие), с применением стандартных методик молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела вариабельные области мыши можно связать с константными областями человека с применением способов, известных из уровня техники (см., например, патент США № 4816567 за авторством Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела CDR-области мыши можно вставить в каркас человека с применением способов, известных из уровня техники. См., например, патент США № 5225539 за авторством Winter и патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 за авторством Queen et al.

В определенном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению представляют собой моноклональные антитела человека. Такие моноклональные антитела человека, направленные против BMP6, можно получать с применением трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека вместо мышиной системы. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, называемых в данном документе соответственно мыши HuMAb и мыши KM, и их совокупно называют в данном документе "мышами с Ig человека".

Мышь HuMAb® (Medarex, Inc.) содержит минилокусы генов иммуноглобулинов человека, которые кодируют не подвергшиеся перегруппировке последовательности тяжелых цепей (мю и гамма) и каппа-легкой цепи иммуноглобулина человека, вместе с целенаправленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы мю- и каппа-цепей (см., например, Lonberg, et al., 1994 Nature 368 (6474): 856-859). Соответственно, мыши проявляют пониженную экспрессию IgM или K мыши, и в ответ на иммунизацию введенные трансгены тяжелой и легкой цепей человека подвергаются переключению класса и соматической мутации с получением высокоаффинного моноклонального IgG-каппа человека (Lonberg, N. et al., 1994 выше; обзор в Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, и Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Получение и применение мышей HuMAb и геномные модификации, которые несут такие мыши, дополнительно описываются в Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; и Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, содержание всех из которых конкретно включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. См. также патенты США №№ 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; все за авторством Lonberg и Kay; патент США № 5545807 за авторством Surani et al.; публикации согласно PCT №№ WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все за авторством Lonberg и Kay; и публикацию согласно PCT № WO 01/14424 за авторством Korman et al.

В другом варианте осуществления антитела человека по настоящему изобретению можно получать с помощью мыши, которая несет последовательности иммуноглобулина человека на трансгенах и трансхромосомах, как, например, мыши, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Такие мыши, называемые в данном документе "мышами KM", подробно описаны в публикации согласно PCT WO 02/43478 за авторством Ishida et al.

Более того, альтернативные системы на основе трансгенных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, являются доступными из уровня техники, и их можно использовать для получения антител, связывающих BMP6, и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Например, можно применять альтернативную трансгенную систему, называемую Xenomouse (Abgenix, Inc.). Такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963 за авторством Kucherlapati et al.

Более того, альтернативные системы на основе трансхромосомных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, являются доступными из уровня техники, и их можно использовать для получения антител, связывающих BMP6, по настоящему изобретению. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому тяжелой цепи человека, так и трансхромосому легкой цепи человека, называемых "мышами TC"; такие мыши описаны в Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Кроме того, коровы, несущие трансхромосомы тяжелой и легкой цепей человека, были описаны в уровне техники (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), и их можно использовать для получения антител, связывающих BMP6, по настоящему изобретению.

Моноклональные антитела человека по настоящему изобретению также можно получать с применением способов фагового дисплея для скрининга библиотек генов иммуноглобулинов человека. Такие способы фагового дисплея для выделения антител человека определены в уровне техники или описаны в примерах ниже. См., например, патенты США №№ 5223409; 5403484 и 5571698 за авторством Ladner et al; патенты США № 5427908 и № 5580717 за авторством Dower et al; патенты США № 5969108 и № 6172197 за авторством McCafferty et al. и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 за авторством Griffiths et al.

Моноклональные антитела человека по настоящему изобретению также можно получить с использованием мышей SCID, в которых были перенесены иммунные клетки человека таким образом, что после иммунизации может генерироваться ответ в виде продуцирования антител человека. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5476996 и 5698767 за авторством Wilson et al.

КОНСТРУИРОВАНИЕ КАРКАСА ИЛИ Fc

Сконструированные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают таковые, в которых были осуществлены модификации в каркасных остатках в пределах VH и/или VL, например, для улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации каркаса осуществляют для снижения иммуногенности антитела. Например, один подход заключается в "мутировании к первоначальному виду" одного или нескольких каркасных остатков в соответствующую последовательность зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подверглось соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки могут быть идентифицированы посредством сравнения каркасных последовательностей антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых получено антитело. Для возвращения последовательностей каркасной области в их конфигурацию зародышевой линии соматические мутации можно ввести для "мутирования к первоначальному виду" в последовательности зародышевой линии, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза. Также предполагается, что такие "мутированные к первоначальному виду" антитела охватываются настоящим изобретением.

Другой тип модификации каркаса включает мутирование одного или нескольких остатков в пределах каркасной области или даже в пределах одной или нескольких CDR-областей для удаления T-клеточных эпитопов, чтобы снизить за счет этого потенциальную иммуногенность антитела. Этот подход также называется "деиммунизацией" и более подробно описан в публикации заявки на патент США № 20030153043 за авторством Carr et al.

В качестве дополнения или альтернативы модификациям, осуществляемым в пределах каркасных или CDR-областей, антитела по настоящему изобретению можно конструировать таким образом, чтобы они включали модификации в пределах Fc-области, как правило, для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке крови, фиксация комплемента, связывание с Fc-рецептором и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело по настоящему изобретению может быть химически модифицировано (например, к антителу могут быть прикреплены один или несколько химических фрагментов), или оно может быть модифицировано для изменения характера его гликозилирования, чтобы, опять-таки, изменить одно или несколько функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов осуществления более подробно описан ниже. Нумерация остатков в Fc-области производится согласно EU-индексу по Kabat.

В одном варианте осуществления шарнирную область CH1 модифицируют таким образом, что число цистеиновых остатков в шарнирной области изменяется, например, увеличивается или уменьшается. Этот подход дополнительно описан в патенте США № 5677425 за авторством Bodmer et al. Число цистеиновых остатков в шарнирной области CH1 изменяют, например, с целью облегчения сборки легких и тяжелых цепей или с целью повышения или снижения стабильности антитела.

В другом варианте осуществления область Fc-шарнир антитела подвергают мутации для снижения биологического периода полужизни антитела. Более конкретно, одну или несколько аминокислотных мутаций вводят в область на границе раздела доменов CH2-CH3 во фрагменте Fc-шарнир таким образом, чтобы антитело характеризовалось нарушенным связыванием с белком A стафилококка (SpA) по сравнению со связыванием нативного домена Fc-шарнир с SpA. Этот подход описан более подробно в патенте США № 6165745 за авторством Ward et al.

В другом варианте осуществления антитело модифицируют для увеличения его биологического периода полужизни. Различные подходы являются возможными. Например, могут быть введены одна или несколько из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США № 6277375 за авторством Ward. В качестве альтернативы для увеличения биологического периода полужизни антитело можно изменить в пределах CH1- или CL-области таким образом, чтобы оно содержало связывающий эпитоп рецептора реутилизации, взятый из двух петель CH2-домена Fc-области IgG, как описано в патентах США №№ 5869046 и 6121022 за авторством Presta et al.

В одном варианте осуществления Fc-область изменяют посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на отличный аминокислотный остаток с целью изменения эффекторных функций антитела. Например, одну или несколько аминокислот можно заменить на отличный аминокислотный остаток таким образом, чтобы антитело характеризовалось измененной аффинностью в отношении эффекторного лиганда, но сохраняло способность к связыванию антигена первичного антитела. Эффекторный лиганд, аффинность в отношении которого изменяют, может представлять собой, например, Fc-рецептор или компонент C1 комплемента. Этот подход описан более подробно в патентах США № 5624821 и 5648260, оба за авторством Winter et al.

В другом варианте осуществления одну или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков, можно заменить на отличный аминокислотный остаток таким образом, чтобы антитело характеризовалось измененным связыванием C1q и/или пониженной или устраненной комплементзависимой цитотоксичностью (CDC). Этот подход описан более подробно в патенте США № 6194551 за авторством Idusogie et al.

В другом варианте осуществления один или несколько аминокислотных остатков изменяют для изменения таким образом способности антитела к фиксации комплемента. Этот подход дополнительно описан в публикации согласно PCT WO 94/29351 за авторством Bodmer et al.

В еще одном варианте осуществления Fc-область модифицируют для повышения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или для повышения аффинности антитела в отношении Fc-гамма рецептора посредством модификации одной или нескольких аминокислот. Этот подход дополнительно описан в публикации согласно PCT WO 00/42072 за авторством Presta. Более того, сайты связывания на IgG1 человека для Fc-гамма RI, Fc-гамма RII, Fc-гамма RIII и FcRn были картированы, и были описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

В еще одном варианте осуществления характер гликозилирования антитела является модифицированным. Например, можно получить агликозилированное антитело (т. е. антитело без гликозилирования). Характер гликозилирования может быть изменен, например, для повышения аффинности антитела к "антигену". Такие модификации углеводов можно осуществлять, например, посредством изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, можно произвести одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к исключению одного или нескольких сайтов гликозилирования в каркасе вариабельной области с устранением за счет этого гликозилирования в этом сайте. Такое агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Такой подход описан более подробно в патентах США №№ 5714350 и 6350861 за авторством Co et al.

В качестве дополнения или альтернативы может быть получено антитело, которое характеризуется измененным типом гликозилирования, как, например, гипофукозилированное антитело, имеющее уменьшенные количества фукозильных остатков, или антитело, имеющее повышенное содержание структур с дополнительным остатком GlcNac в точке ветвления. Было продемонстрировано, что такой измененный характер гликозилирования повышает способность антител к ADCC. Такие модификации углеводов можно осуществлять, например, посредством экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в уровне техники, и их можно применять в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируются рекомбинантные антитела по настоящему изобретению, с получением таким образом антитела с измененным характером гликозилирования. Например, в EP 1176195 за авторством Hang et al. описывается линия клеток с функциональным нарушением гена FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего антитела, экспрессируемые в такой линии клеток, проявляют гипофукозилирование. В публикации согласно PCT WO 03/035835 за авторством Presta описывается вариант линии клеток CHO, клетки LecI3 с пониженной способностью к прикреплению фукозы к связанным посредством Asn (297) углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в такой клетке-хозяине (см. также Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации согласно PCT WO 99/54342 за авторством Umana et al. описываются линии клеток, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета-(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)), в результате чего антитела, эксперссирующиеся в сконструированных линиях клеток, характеризуются повышенным содержанием структур с дополнительным остатком GlcNac в точке ветвления, что приводит к повышенной активности ADCC у антител (см. также Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

СПОСОБЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ИЗМЕНЕННЫХ АНТИТЕЛ

Как обсуждалось выше, антитела, связывающие BMP6, имеющие последовательности VH и VL или полноразмерные последовательности тяжелой и легкой цепей, показанные в данном документе, можно применять для создания новых антител, связывающих BMP6, путем модификации полноразмерных последовательностей тяжелой цепи и/или легкой цепи, последовательностей VH и/или VL или константной(-ых) области(-ей), прикрепленной(-ых) к ним. Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения структурные признаки антитела, связывающего BMP6, по настоящему изобретению применяют для создания структурно родственных антител, связывающих BMP6, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, как, например, связывание с BMP6 человека, а также ингибирование одного или нескольких функциональных свойств BMP6 (например, ингибирование лизиса эритроцитов в анализе гемолиза).

Например, одну или несколько CDR-областей антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению или их мутантных вариантов можно объединить с помощью методик рекомбинации с известными каркасными областями и/или другими CDR с созданием дополнительных сконструированных с использованием методик рекомбинации антител, связывающих BMP6, и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, как обсуждалось выше. Другие типы модификаций включают модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для способа конструирования является одна или несколько из последовательностей VH и/или VL, представленных в данном документе, или одна или несколько их CDR-областей. Для создания сконструированного антитела не обязательно фактически получать (т. е. экспрессировать в виде белка) антитело, имеющее одну или несколько последовательностей VH и/или VL, представленных в данном документе, или одну или несколько их CDR-областей. Скорее, информацию, содержащуюся в последовательности(-ях), применяют в качестве исходного материала для создания последовательности(-ей) "второго поколения", полученных из исходной(-ых) последовательности(-ей), а затем последовательность(-и) "второго поколения" получают и экспрессируют в виде белка.

Измененную последовательность антитела также можно получить посредством скрининга библиотек антител, имеющих фиксированные последовательности CDR3 или минимальные необходимые связывающие детерминанты, которые описаны в US20050255552, и разнообразные последовательности CDR1 и CDR2. Скрининг можно осуществлять согласно любой технологии скрининга, подходящей для скрининга антител из библиотек антител, как, например, технология фагового дисплея.

Стандартные методики молекулярной биологии можно применять для получения и экспрессии измененной последовательности антитела. Антитело, кодируемое измененной(-ыми) последовательностью(-ями) антитела, является таким, которое сохраняет одно, некоторые или все функциональные свойства антител, связывающих BMP6, описанных в данном документе, при этом функциональные свойства включают без ограничения специфическое связывание с белком BMP6 человека; и антитело ингибирует лизис эритроцитов в анализе гемолиза.

Функциональные свойства измененных антител можно оценить с применением стандартных анализов, доступных из уровня техники и/или описанных в данном документе, таких как анализы, изложенные в примерах (например, разновидности ELISA).

В одном варианте осуществления способов конструирования антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению мутации можно вводить произвольно или селективно по всей кодирующей последовательности антитела, связывающего BMP6, или ее части и полученные модифицированные антитела, связывающие BMP6, можно подвергнуть скринингу в отношении активности связывания и/или других функциональных свойств, как описано в данном документе. Способы введения мутаций были описаны в уровне техники. Например, в публикации согласно PCT WO 02/092780 за авторством Short описываются способы создания и скрининга мутантных вариантов антител с применением насыщающего мутагенеза, сборки с лигированием синтезированных фрагментов или их комбинации. В качестве альтернативы в публикации согласно PCT WO 03/074679 за авторством Lazar et al. описываются способы применения способов компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТЕЛ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Характеристики антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению могут быть определены с помощью различных функциональных анализов. Например, их можно характеризовать по их способности к ингибированию BMP6.

Способность антитела к связыванию с BMP6 можно выявить посредством непосредственного мечения антитела, представляющего интерес, или антитело может быть немеченым, и связывание выявляют косвенно с применением различных форматов сэндвич-анализов, известных из уровня техники.

В одном варианте осуществления антитела, связывающие BMP6, и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению блокируют связывание эталонного антитела, связывающего BMP6, с полипептидом BMP6 или конкурируют с ним за связывание. Они могут представлять собой вышеописанные полностью человеческие антитела, связывающие BMP6. Они также могут представлять собой другие мышиные, химерные или гуманизированные антитела, связывающие BMP6, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело. Способность к блокированию связывания эталонного антитела или конкуренции с ним за связывание указывает на то, что тестируемое антитело, связывающее BMP6, связывается с одним и тем же или подобным эпитопом, что и определяемый эталонным антителом, или с эпитопом, который расположен достаточно близко к эпитопу, связываемым эталонным антителом, связывающим BMP6. Особенно вероятно, что такие антитела обладают преимущественными свойствами, идентифицированными для эталонного антитела. Способность к блокированию эталонного антитела или конкуренции с ним можно определить, например, с помощью конкурентного анализа связывания. В конкурентном анализе связывания тестируемое антитело оценивают в отношении способности к ингибированию специфического связывания эталонного антитела с общим антигеном, таким как полипептид BMP6. Тестируемое антитело конкурирует с эталонным антителом за специфическое связывание с антигеном, если избыток тестируемого антитела обеспечивает значительное ингибирование связывания эталонного антитела. Значительное ингибирование означает, что тестируемое антитело снижает специфическое связывание эталонного антитела обычно на по меньшей мере 10%, 25%, 50%, 75% или 90%.

Существует ряд известных конкурентных анализов связывания, которые можно применять для оценки конкуренции антитела с эталонным антителом за связывание с конкретным белком, в данном случае с BMP6. Они включают, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983); твердофазный прямой EIA с использованием биотина-авидина (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986); твердофазный анализ с прямым мечением, твердофазный сэндвич-анализ с прямым мечением (см. Harlow & Lane, выше); твердофазный RIA с прямым мечением с использованием метки I-125 (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988); твердофазный прямой EIA с использованием биотина-авидина (Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990) и RIA с прямым мечением (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990). Как правило, такой анализ включает применение очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих любой из них, немеченого тестируемого антитела, связывающего BMP6, и меченого эталонного антитела. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой поверхностью или клетками в присутствии тестируемого антитела. Обычно тестируемое антитело присутствует в избытке. Антитела, идентифицируемые с помощью конкурентного анализа (конкурирующие антитела), предусматривают антитела, связывающиеся с одним и тем же эпитопом, что и эталонное антитело, и антитела, связывающиеся со смежным эпитопом, который расположен достаточно близко к эпитопу, связываемому эталонным антителом, чтобы имело место стерическое затруднение.

Для определения того, связываются ли выбранные моноклональные антитела, связывающие BMP6, с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать с применением коммерчески доступных реагентов (например, реагентов от Pierce, Рокфорд, Иллинойс). Конкурентные исследования с применением немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно осуществлять с применением покрытых полипептидом BMP6 планшетов для ELISA. Связывание биотинилированного MAb можно выявить с помощью зонда на основе стрептавидина и щелочной фосфатазы. Для определения изотипа очищенного антитела, связывающего BMP6, можно выполнять разновидности ELISA с определением изотипа. Например, лунки микротитровальных планшетов можно покрывать 1 мкг/мл антитела к IgG человека в течение ночи при 4 градусах C. После блокирования с помощью 1% BSA планшеты приводят в реакцию с моноклональным антителом, связывающим BMP6, в концентрации 1 мкг/мл или меньше или очищенными изотипическими контролями при температуре окружающей среды в течение одного-двух часов. Затем содержимое лунок можно приводить в реакцию со специфическими в отношении IgG1 человека либо IgM человека зондами, конъюгированными со щелочной фосфатазой. Планшеты затем проявляют и анализируют таким образом, что можно определить изотип очищенного антитела.

Для демонстрации связывания моноклональных антител, связывающих BMP6, с живыми клетками, экспрессирующими полипептид BMP6, можно использовать проточную цитометрию. Вкратце, линии клеток, экспрессирующие BMP6 (выращиваемые при стандартных условиях выращивания), можно смешивать с различными концентрациями антитела, связывающего BMP6, в PBS, содержащем 0,1% BSA и 10% фетальной телячьей сыворотки, и инкубировать при 37 градусах C в течение 1 часа. После промывания клетки приводят в реакцию с меченым флуоресцеином антителом к IgG человека при тех же условиях, что и при окрашивании первичным антителом. Образцы можно анализировать с помощью прибора FACScan с использованием свойств светорассеяния и бокового светорассеяния в целях гейтирования отдельных клеток. Можно применять альтернативный анализ с использованием флуоресцентной микроскопии (в дополнение к или вместо) проточной цитометрии. Клетки можно окрашивать точно так же, как описано выше, и исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот способ позволяет визуализировать отдельные клетки, однако может характеризоваться сниженной чувствительностью в зависимости от плотности антигена.

Антитела, связывающие BMP6, и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно дополнительно тестировать в отношении реакционной способности в отношении полипептида BMP6 или антигенного фрагмента с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, очищенные полипептиды BMP6 или слитые белки на его основе или клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих BMP6, могут быть получены и подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокированные 10% фетальной телячьей сывороткой, и исследуют с помощью тестируемых моноклональных антител. Связывание IgG человека можно выявить с применением антитела к IgG человека со щелочной фосфатазой и проявить с помощью субстрата BCIP/NBT в виде таблеток (Sigma Chem. Co., Сент-Луис, Миссури).

Примеры функциональных анализов также описаны в разделе Примеры ниже.

ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПУТИ ПРИМЕНЕНИЯ

В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с повышенной активностью BMP6, посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ лечения анемии посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно применять, среди прочего, для предупреждения прогрессирования анемии. Их также можно применять в комбинации с другими средствами терапии для лечения пациентов с анемией.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения связанного с BMP6 заболевания или нарушения посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Примеры известных связанных с BMP6 заболеваний или нарушений включают анемию, в том числе в качестве неограничивающих примеров анемию, обусловленную хроническим заболеванием (ACD), анемию, обусловленную (например, ассоциированную с) хроническим заболеванием почек (CKD), анемию, обусловленную раком, анемию, обусловленную воспалением, анемию, резистентную к средству, стимулирующему эритропоэз (ESA) (например, анемию, резистентную к эритропоэтину (EPO), анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, анемию с гипореактивностью в отношении EPO), анемию, обусловленную функциональным дефицитом железа, и/или анемию, обусловленную нехваткой железа.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения связанного с BMP6 заболевания или нарушения посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где указанное заболевание или нарушение представляет собой анемию. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой рак. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой воспаление. В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения анемии посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения анемии посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием почек. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, ассоциированную с заболеванием почек, например, хроническим заболеванием почек. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы лечения анемии.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ снижения потребностей в дозе ESA (например, EPO) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой рак. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой воспаление. В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В вариантах осуществления способы и применение по настоящему изобретению приводят к снижению индекса резистентности к ESA (ERI) у пациентов.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы снижения потребностей в дозе ESA (например, EPO) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, где указанный субъект имеет анемию, обусловленную функциональным дефицитом железа. В варианте осуществления субъектом является пациент, находящийся на хроническом гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO). В варианте осуществления субъектом является пациент с хроническим заболеванием почек, находящийся на гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO).

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ снижения потребностей в дозе ESA (например, EPO) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению. В варианте осуществления субъект имеет анемию. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой рак. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой воспаление. В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы снижения потребностей в дозе ESA (например, EPO) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, где указанный субъект имеет анемию, обусловленную функциональным дефицитом железа. В варианте осуществления субъектом является пациент, находящийся на хроническом гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO). В варианте осуществления субъектом является пациент с хроническим заболеванием почек, находящийся на гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO).

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ снижения потребностей в дозе железа (например, железа IV) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. В варианте осуществления субъект имеет анемию. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой рак. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой воспаление. В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы снижения потребностей в дозе железа (например, железа IV) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, где указанный субъект имеет анемию, обусловленную функциональным дефицитом железа. В варианте осуществления субъектом является пациент, находящийся на хроническом гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO). В варианте осуществления субъектом является пациент с хроническим заболеванием почек, находящийся на гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO).

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ снижения потребностей в дозе железа (например, железа IV) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению. В варианте осуществления субъект имеет анемию. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой рак. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой воспаление. В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы снижения потребностей в дозе железа (например, железа IV) у субъекта посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению, где указанный субъект имеет анемию, обусловленную функциональным дефицитом железа. В варианте осуществления субъектом является пациент, находящийся на хроническом гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO). В варианте осуществления субъектом является пациент с хроническим заболеванием почек, находящийся на гемодиализе и получающий лечение с помощью ESA (например, EPO).

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ снижения потребностей в дозе железа (например, железа IV) у субъекта и снижения потребностей в дозе ESA (например, EPO) у субъекта, предусматривающий введение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению или композиции, содержащей указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, обусловленную хроническим заболеванием. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой хроническое заболевание почек. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой рак. В варианте осуществления субъект имеет анемию. В варианте осуществления хроническое заболевание представляет собой воспаление. В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, резистентную к ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию с гипореактивностью в отношении ESA (например, EPO). В варианте осуществления анемия (например, анемия, обусловленная хроническим заболеванием) представляет собой анемию, обусловленную нехваткой железа. В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъектом является субъект, находящийся на хроническом гемодиализе (HD). В вариантах осуществления, в том числе в любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, субъект имеет заболевание почек, например, терминальную стадию заболевания почек.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы мобилизации секвестированного железа посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы мобилизации секвестированного железа посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ улучшения (например, повышения) уровня гемоглобина у субъекта с анемией с одновременным снижением потребности в дозе эритропоэтина и/или железа (например, железа IV), при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, ассоциированную с хроническим заболеванием. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня до уровня, соответствующего требованиям руководства по клинической практике, например, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере приблизительно 11,0 г/дл, например, до уровня от приблизительно 11,0 г/дл до приблизительно 12,5 г/дл. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере 11,0 г/дл, например, до уровня от 11,0 г/дл до 12,5 г/дл.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ улучшения (например, повышения) уровня гемоглобина у субъекта с анемией с одновременным снижением потребности в дозе эритропоэтина и/или железа (например, железа IV), при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, ассоциированную с хроническим заболеванием. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня до уровня, соответствующего требованиям руководства по клинической практике, например, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере приблизительно 11,0 г/дл, например, до уровня от приблизительно 11,0 г/дл до приблизительно 12,5 г/дл. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере 11,0 г/дл, например, до уровня от 11,0 г/дл до 12,5 г/дл.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ поддержания уровня гемоглобина у субъекта с анемией с одновременным снижением потребности в дозе эритропоэтина и/или железа (например, железа IV), при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, ассоциированную с хроническим заболеванием. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня до уровня, соответствующего требованиям руководства по клинической практике, например, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере приблизительно 11,0 г/дл, например, до уровня от приблизительно 11,0 г/дл до приблизительно 12,5 г/дл. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере 11,0 г/дл, например, до уровня от 11,0 г/дл до 12,5 г/дл.

В варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ поддержания уровня гемоглобина у субъекта с анемией с одновременным снижением потребности в дозе эритропоэтина и/или железа (например, железа IV), при этом указанный способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей антитело по настоящему изобретению. В варианте осуществления анемия представляет собой анемию, ассоциированную с хроническим заболеванием. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня до уровня, соответствующего требованиям руководства по клинической практике, например, Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group. KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease. Kidney inter., Suppl. 2012; 2: 279-335, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере приблизительно 11,0 г/дл, например, до уровня от приблизительно 11,0 г/дл до приблизительно 12,5 г/дл. В варианте осуществления улучшение уровня гемоглобина предусматривает улучшение уровня гемоглобина до по меньшей мере 11,0 г/дл, например, до уровня от 11,0 г/дл до 12,5 г/дл.

В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в таблице 1 и/или таблице 14, можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, в сочетании с терапевтическим способом или процедурой, такими как описанные в данном документе или известные из уровня техники. Такой способ или процедура включают в качестве неограничивающих примеров введение терапевтически эффективного количества ESA (например, EPO), эритропоэтина или железа и переливание крови. Лечение, как правило, продолжают с интервалами в течение периода, составляющего неделю, месяц, три месяца, шесть месяцев или год. У некоторых пациентов лечение осуществляют до конца жизни пациента.

Если терапевтические средства по настоящему изобретению вводят вместе с другим средством, оба из них можно вводить последовательно в любом порядке или одновременно. В некоторых аспектах антитело по настоящему изобретению вводят субъекту, который также получает терапию с помощью второго средства или способа (например, ESA, эритропоэтин, препараты железа, переливание крови). В других аспектах связывающую молекулу вводят в сочетании с видами лечения, предусматривающими хирургическое вмешательство.

Подходящие средства для комбинированного лечения с помощью антител, связывающих BMP6, включают известные из уровня техники средства, которые ингибируют или снижают экспрессию, уровень, стабильность и/или активность BMP6. Такие средства включают антитела, siRNA и малые молекулы, нацеливающиеся на BMP6.

Различные антитела к BMP6 известны из уровня техники, в том числе, среди прочего, антитела, описанные в

Andriopoulos et al. 2009 Nat. Genet. 41: 482-487;

Arndt et al. 2010 Gastroent. 138: 372-382;

Bames et al. 1995 World J. Urol. 13: 337-343;

Camaschella et al. 2009 Nat. Genet. 41: 386-388;

Celement et al. 1999 Int. J. Cancer 80: 250-256;

Corradini et al. 2011 Hepatol. 54: 273-284;

Crews et al. 2010 J. Neuro. 30: 12252-12262;

Dai et al. 2005 Cancer Res. 65: 8274;

Darby et al. 2007 J. Pathol. 214: 394-404;

Hadziahmetovic et al. 2011 179: 335-348;

Hamdy et al. 1997 Cancer Res. 57: 4427;

Haudenschild et al. 2004 Cancer Res. 64: 8276;

Hee et al. 2008 J. Orth. Res. 27: 162-168;

Herrera et al. 2009 BMC Cell Biol. 10: 20;

Inagaki et al. 2005 Endocrin. 147: 2681-2689;

Jung et al. 2008 Stem Cells 26: 2042-2051;

Kaiser et al. 1998 J. Invest. Derm. 111: 1145-1152;

Kautz et al. 2011 Haematol. 96: 199-203;

Khalaf et al. 2012 Eur. J. Endocrin. 168: 437-444;

Kochanowska et al. 2002 Exp. Biol. Med. 227: 57-62;

Li et al. 2006 Int. J. Med. Sci. 3: 97-105;

Meynard et al. 2011 Blood 118: 747-756;

Pederson et al. 2008 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 20764-69;

Plant et al. 2002 J. Bone Min. Res. 17: 782-790;

Schluesener et al. 1994 Atheroscl. 113: 153-156;

Schluesener et al. 2004 GLIA 12: 161-164;

Shi et al. 2009 Fert. Steril. 92: 1794-1798;

Varley et al. 1996 Exp. Neur. 140: 84-94;

Wang et al. 2007 Mol. Cell. Neurosci. 34: 653-661; и

Zhang et al. 2006 Neurosci. 138: 47-53;

патент США № 8795665 и

WO 2010/056981.

Дополнительные антитела к BMP6 известны из уровня техники; многие из них являются коммерчески доступными.

Различные siRNA, нацеливающиеся на BMP6, известны из уровня техники, в том числе, среди прочего, siRNA, описанные в

He et al. 2003 Cell. Signal. 25: 1372-1378;

Ikeda et al. 2012 PLoS 0040465;

Kautz et al. 2008 Blood 112: 1503;

Mi et al. 2011 J. Cancer Res. Clin. Oncol. 137: 245;

Xia et al. 2007 J. Biol. Chem. 282: 18129-18140;

Xia et al. 2008 Blood 111: 5195; и

Yang et al. 2009 Int. J. Bioch. Cell Biol. 41: 853-861.

Известны дополнительные ингибиторы BMP6. Любые из них можно применять в комбинации с любым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, раскрытым в данном документе.

Схема комбинированной терапии может быть аддитивной, или она может обеспечивать синергичные результаты (например, эффекты в виде снижения активности BMP6, превышающие ожидаемые для комбинированного применения двух средств). В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает комбинированную терапию для предупреждения и/или лечения анемии или другого связанного с BMP6 заболевания, описанного выше, с помощью антитела, связывающего BMP6, по настоящему изобретению и противоанемического средства или способа, как, например, ESA, эритропоэтин, препараты железа или переливание крови.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПУТИ ПРИМЕНЕНИЯ

В одном аспекте настоящим изобретением охватываются диагностические анализы для определения BMP6 и/или экспрессии нуклеиновой кислоты, а также функционирования BMP6 в биологическом образце (например, крови, сыворотке крови, клетках, ткани) или от индивидуума, поражен заболеванием или нарушением или имеет риск развития нарушения, ассоциированного с анемией.

Диагностические анализы, такие как конкурентные анализы, основываются на способности меченого аналога ("меченого вещества") конкурировать с анализируемым веществом в тестируемом образце за ограниченное количество сайтов связывания на общем партнере по связыванию. Партнер по связыванию обычно переводят в нерастворимую форму до или после конкурирования, а затем меченное вещество и анализируемое вещество, связавшиеся с партнером по связыванию, отделяют от несвязавшихся меченного вещества и анализируемого вещества. Это отделение осуществляют посредством декантирования (где партнер по связыванию предварительно перевели в нерастворимую форму) или посредством центрифугирования (где партнер по связыванию осаждали после осуществления реакции конкурирования). Количество анализируемого вещества в тестируемом образце является обратно пропорциональным количеству связавшегося меченного вещества, которое измеряют по количеству маркерного вещества. Кривые доза-эффект с известными количествами анализируемого вещества строят и сравнивают с результатами тестирования с целью количественного определения количества анализируемого вещества, присутствующего в тестируемом образце. Эти анализы называют системами ELISA, когда в качестве выявляемых маркеров применяют ферменты. В данном формате анализа конкурентное связывание между антителами и антителами, связывающими BMP6, дает в результате связанный BMP6, предпочтительно эпитопы BMP6 по настоящему изобретению, которые являются измеряемым показателем содержания антител в образце сыворотки крови, наиболее конкретно нейтрализующих антител в образце сыворотки крови.

Существенным преимуществом анализа является непосредственное измерение содержания нейтрализующих антител (т. е. антител, которые препятствуют связыванию BMP6, в частности, эпитопов). Такой анализ, в особенности в форме анализа ELISA, имеет широкое применение в клинических условиях и при стандартном скрининге крови.

При клинической диагностике или мониторинге пациентов с нарушениями, ассоциированными с анемией, выявление белков BMP6 при сравнении с уровнями в соответствующем биологическом образце от нормального субъекта указывает на пациента с нарушениями, ассоциированными с анемией.

Диагностика или визуализация in vivo описаны в US2006/0067935. Вкратце, эти способы, в целом, предусматривают введение или предоставление пациенту диагностически эффективного количества молекулы, связывающей BMP6, которая функционально прикреплена к маркеру или метке, которые могут быть выявлены с помощью неинвазивных способов. Конъюгату антитело-маркер предоставляется достаточно времени для обнаружения и связывания с BMP6. Пациента затем подвергают воздействию выявляющего устройства для идентификации выявляемого маркера, получая таким образом изображение местоположения молекул, связывающих BMP6, в ткани пациента. Наличие антитела, связывающего BMP6, или его антигенсвязывающего фрагмента выявляют путем определения того, связывается ли антитело-маркер с компонентом ткани. Выявление повышенного уровня белков BMP6 или комбинации белка по сравнению с таковым у нормального индивидуума без анемии указывает на предрасположенность к нарушениям, ассоциированным с анемией, и/или на начало их проявления. Эти аспекты настоящего изобретения также относятся к применению в способах визуализации тканей и комбинированных способах диагностики и лечения.

Настоящее изобретение также относится к области предсказательной медицины, в которой диагностические анализы, прогностические анализы, фармакогеномные исследования и мониторинг в ходе клинических испытаний применяют для целей прогнозирования (предсказания), чтобы, благодаря этому, осуществлять профилактическое лечение индивидуума.

Настоящее изобретение также предусматривает прогностические (или предсказательные) анализы для определения того, имеет ли индивидуум риск развития нарушения, ассоциированного с нарушением регуляции активности пути с участием BMP6. Например, мутации в гене BMP6 можно анализировать в биологическом образце. Такие анализы можно применять с целью прогнозирования или предсказания, чтобы, благодаря этому, осуществлять профилактическое лечение индивидуума до начала проявления нарушения, характеризующегося экспрессией нуклеиновой кислоты или активностью BMP6 или ассоциированного с ними.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрены способы определения экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей BMP6, или активности BMP6 у индивидуума, чтобы, благодаря этому, выбрать соответствующие терапевтические или профилактические средства для этого индивидуума (называются в данном документе "фармакогеномными исследованиями"). Фармакогеномные исследования обеспечивают возможность выбора средств (например, лекарственных средств) для терапевтического или профилактического лечения индивидуума на основании генотипа индивидуума (например, генотипа индивидуума, оцениваемого для определения возможности ответа у индивидуума на конкретное средство).

В еще одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ мониторинга влияния средств (например, лекарственных средств) на экспрессию или активность BMP6 в клинических испытаниях.

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

В настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитело, связывающее BMP6, или его связывающий фрагмент, составленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции могут дополнительно содержать один или несколько других терапевтических средств, которые являются подходящими для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с BMP6 (например, анемии). Фармацевтические носители усиливают или стабилизируют композицию или облегчают получение композиции. Фармацевтически приемлемые носители включают растворители, дисперсионные среды, средства для покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т. п., которые являются физиологически совместимыми.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить с помощью ряда способов, известных из уровня техники. Путь и/или способ введения меняются в зависимости от требуемых результатов. Введение может быть внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным, или введение осуществляют вблизи сайта мишени. Фармацевтически приемлемый носитель должен быть подходящим для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, позвоночного или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединение, т. е. антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула, может быть покрыто материалом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.

Композиция должна быть стерильной и текучей. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию изотонических средств, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннит или сорбит, и хлорида натрия. Длительная абсорбция инъекционых композиций может быть обеспечена включением в композицию средства, которое замедляет абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получить в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники и обычно осуществляемыми в данной области техники. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; и Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Фармацевтические композиции предпочтительно изготовляют в соответствии с положениями GMP. Как правило, терапевтически эффективную дозу или эффективную дозу антитела, связывающего BMP6, используют в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. Антитела, связывающие BMP6, составляют в фармацевтически приемлемые лекарственные формы с помощью традиционных способов, известных специалистам в данной области техники. Схемы дозирования корректируют для обеспечения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько разделенных доз в течение некоторого времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, как показано согласно потребностям терапевтической ситуации. Особенно преимущественным является составление композиций для парентерального применения в единичной дозированной форме для удобства введения и однородности дозирования. Единичная дозированная форма, как используется в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению; при этом каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

Фактические уровни дозы активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно изменять для того, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа для конкретного пациента, эффективным в отношении композиции и способа введения, не являясь токсичным для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от ряда фармакокинетических факторов, в том числе активности конкретных используемых композиций по настоящему изобретению, или их присутствия в форме сложного эфира, соли или амида, пути введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, длительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и анамнеза пациента, подлежащего лечению, и подобных факторов.

Врач или ветеринар может начинать введение доз антител и их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, используемых в фармацевтической композиции, с уровней ниже, чем уровни, которые необходимы для достижения требуемого терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу до тех пор, пока не будет достигнут требуемый эффект. В целом, эффективные дозы композиций по настоящему изобретению для лечения аллергического воспалительного заболевания, описанного в данном документе, меняются в зависимости от многих разных факторов, в том числе от способов введения, сайта-мишени, физиологического состояния пациента, от того, является ли пациентом человек или животное, от других вводимых лекарственных препаратов и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Дозы для лечения необходимо подбирать для оптимизации безопасности и эффективности. В случае системного введения антитела доза находится в диапазоне от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг и чаще 0,001-15 мг/кг веса тела хозяина. Иллюстративная схема лечения подразумевает системное введение (например, внутривенное или подкожное) один раз или, в качестве альтернативы, более чем один раз согласно режиму дозирования (например, с повторным дозированием), например, один раз через каждые две недели, один раз в три недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. В случае интравитреального введения антитела доза находится в диапазоне от приблизительно 0,0001 до приблизительно 10 мг. Иллюстративная схема лечения подразумевает системное введение один раз через каждые две недели, один раз в три недели, или один раз в месяц, или один раз в 3-6 месяцев.

Антитело обычно вводят по несколько раз. Интервалы между отдельными дозами могут составлять недели, месяцы или года. Интервалы также могут быть нерегулярными, на что указывает измерение уровней антитела, связывающего BMP6, в крови у пациента. В некоторых способах системного введения дозу корректируют для достижения концентрации антитела в плазме крови, составляющей 1-1000 мкг/мл, и в некоторых способах - 25-500 мкг/мл. В качестве альтернативы антитело можно вводить в виде состава с замедленным высвобождением, в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота меняются в зависимости от периода полужизни антитела у пациента. В целом, гуманизированные антитела проявляют более длительный период полужизни, чем химерные антитела и антитела, отличные от человеческих. Доза и частота введения могут меняться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях относительно низкую дозу вводят с относительно большими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца своей жизни. В терапевтических применениях иногда необходимо введение относительно высокой дозы с относительно короткими интервалами до тех пор, пока прогрессирование заболевания не уменьшится или завершится, и предпочтительно до тех пор, пока у пациента не будет наблюдаться частичное или полное облегчение симптомов заболевания. После этого пациенту можно осуществлять введение по профилактической схеме.

В конкретном варианте осуществления композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, вводят в дозе (антитела или его антигенсвязывающего фрагмента) от 0,001 мг/кг до 0,1 мг/кг. В конкретном варианте осуществления композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, вводят в дозе от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 0,1 мг/кг. В конкретном варианте осуществления композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, вводят в дозе, составляющей 0,001 мг/кг, 0,0016 мг/кг, 0,0025 мг/кг, 0,0040 мг/кг, 0,0063 мг/кг, 0,01 мг/кг, 0,016 мг/кг, 0,025 мг/кг, 0,040 мг/кг, 0,063 мг/кг или 0,1 мг/кг. В конкретном варианте осуществления композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, вводят в дозе, составляющей приблизительно 0,001 мг/кг, приблизительно 0,0016 мг/кг, приблизительно 0,0025 мг/кг, приблизительно 0,0040 мг/кг, приблизительно 0,0063 мг/кг, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,016 мг/кг, приблизительно 0,025 мг/кг, приблизительно 0,040 мг/кг, приблизительно 0,063 мг/кг или приблизительно 0,1 мг/кг. В варианте осуществления композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, вводят, в том числе, например, в любой из доз, перечисленных выше, внутривенно. В вариантах осуществления внутривенное введение представляет собой внутривенную инфузию. В вариантах осуществления инфузия длится в течение 30-60 минут. В вариантах осуществления инфузия длится в течение приблизительно 30-60 минут.

УРОВЕНЬ ФЕРРИТИНА

Раскрытые способы могут включать определение уровня ферритина в биологическом образце, например, крови или сыворотке крови, и в вариантах осуществления пациентов, например, пациентов, имеющих заболевание, описанное в данном документе, например анемию, отбирают для лечения с помощью антагониста BMP6 (например, который описан в данном документе, например, антитела к BMP6, например, антитела 7, например, которое описано в таблице 1), или у них предсказывают наличие ответа на терапию с помощью антагониста BMP6 на основании уровня ферритина.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет ≤ приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет ≤ 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет < 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≤ приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет ≤ 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет < приблизительно 2000 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет ≤ приблизительно 1450 нг/мл, например, ≤ приблизительно 1400 нг/мл, ≤ приблизительно 1350 нг/мл, ≤ приблизительно 1300 нг/мл, ≤ приблизительно 1250 нг/мл, ≤ приблизительно 1200 нг/мл, ≤ приблизительно 1150 нг/мл, ≤ приблизительно 1100 нг/мл, ≤ приблизительно 1050 нг/мл или ≤ приблизительно 1000 нг/мл и т. д.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет ≥ приблизительно 200 нг/мл, например, ≥ приблизительно 250 нг/мл, ≥ приблизительно 300 нг/мл, ≥ приблизительно 350 нг/мл, ≥ приблизительно 400 нг/мл, ≥ приблизительно 450 нг/мл, ≥ приблизительно 500 нг/мл, ≥ приблизительно 550 нг/мл, ≥ приблизительно 600 нг/мл, ≥ приблизительно 650 нг/мл, ≥ приблизительно 700 нг/мл, ≥ приблизительно 750 нг/мл, ≥ приблизительно 800 нг/мл, ≥ приблизительно 850 нг/мл, ≥ приблизительно 900 нг/мл, ≥ приблизительно 950 нг/мл, ≥ приблизительно 1000 нг/мл или ≥ приблизительно 1500 нг/мл и т. д. В вариантах осуществления уровень ферритина находится в диапазоне от любого из уровней, перечисленных выше, до приблизительно 2000 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет ≥ приблизительно 500 нг/мл, ≥ приблизительно 550 нг/мл, ≥ приблизительно 600 нг/мл, ≥ приблизительно 650 нг/мл, ≥ приблизительно 700 нг/мл, ≥ приблизительно 750 нг/мл, ≥ приблизительно 800 нг/мл, ≥ приблизительно 850 нг/мл, ≥ приблизительно 900 нг/мл, ≥ приблизительно 950 нг/мл, ≥ приблизительно 1000 нг/мл или ≥ приблизительно 1500 нг/мл и т. д. В вариантах осуществления уровень ферритина находится в диапазоне от любого из уровней, перечисленных выше, до приблизительно 2000 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет ≥ приблизительно 500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 1500 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1500 нг/мл до приблизительно 1600 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1500 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1600 нг/мл до приблизительно 1700 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1500 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1600 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1700 нг/мл до приблизительно 1800 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1500 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1600 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1700 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1800 нг/мл до приблизительно 1900 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 200 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 300 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 400 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 500 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 600 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 700 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 800 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 900 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1000 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1100 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1200 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1300 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1400 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1500 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1600 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1700 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1800 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от приблизительно 1900 нг/мл до приблизительно 2000 нг/мл.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 200 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 300 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 400 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 500 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 600 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 700 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 800 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 900 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1000 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1100 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1200 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1300 нг/мл до 1500 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1400 нг/мл до 1500 нг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления все диапазоны включают перечисленные крайние значения.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 200 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 300 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 400 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 500 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 600 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 700 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 800 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 900 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1000 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1100 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1200 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1300 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1400 нг/мл до 1600 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1500 нг/мл до 1600 нг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления все диапазоны включают перечисленные крайние значения.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 200 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 300 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 400 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 500 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 600 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 700 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 800 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 900 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1000 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1100 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1200 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1300 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1400 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1500 нг/мл до 1700 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1600 нг/мл до 1700 нг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления все диапазоны включают перечисленные крайние значения.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 200 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 300 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 400 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 500 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 600 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 700 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 800 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 900 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1000 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1100 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1200 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1300 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1400 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1500 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1600 нг/мл до 1800 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1700 нг/мл до 1800 нг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления все диапазоны включают перечисленные крайние значения.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 200 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 300 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 400 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 500 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 600 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 700 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 800 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 900 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1000 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1100 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1200 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1300 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1400 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1500 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1600 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1700 нг/мл до 1900 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1800 нг/мл до 1900 нг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления все диапазоны включают перечисленные крайние значения.

В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 200 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 300 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 400 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 500 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 600 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 700 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 800 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 900 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1000 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1100 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1200 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1300 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1400 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1500 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1600 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1700 нг/мл до 2000 нг/мл. В вариантах осуществления уровень ферритина, например уровень ферритина, предсказывающий ответ (например, повышенный ответ) на лечение с помощью BMP6, составляет от 1800 нг/мл до 2000 нг/мл. В предпочтительных вариантах осуществления все диапазоны включают перечисленные крайние значения.

В вариантах осуществления уровни ферритина, описанные выше, измеряют в биологическом образце, выбранном из крови и сыворотки крови. В вариантах осуществления уровни ферритина, описанные выше, измеряют в сыворотке крови.

МЕТОДИКИ АНАЛИЗА, СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИГОДНОЙ ДЛЯ ПЕРЕДАЧИ ФОРМЫ ИНФОРМАЦИИ

Раскрытые способы являются применимыми для лечения, предупреждения или ослабления тяжести заболеваний, ассоциированных с низкими уровнями железа, например, заболеваний, описанных в данном документе, например, анемии, а также для предсказания вероятности ответа пациента с заболеванием на лечение с помощью антагониста BMP6, например, антитела 7 (например, которое описано в таблице 1). В этих способах используется, среди прочего, определение того, имеет ли пациент конкретный уровень ферритина, например, который описан в данном документе, в образце от пациента.

Биологический образец от пациента можно анализировать в отношении уровня ферритина с помощью любых применимых традиционных способов.

Многочисленные биологические образцы можно применять для идентификации присутствия маркера, например, белков, уровня экспрессии генов или белков и активности белка, например, в крови, синовиальной жидкости, лейкоцитарной пленке, сыворотке крови, плазме крови, лимфе, кале, моче, слезе, слюне, спинномозговой жидкости, буккальных мазках, мокроте или ткани. В контексте биологического образца в раскрытых способах можно применять различные источники, например, можно анализировать биологический образец, например, кровь или сыворотку крови, от пациента в отношении уровня ферритина.

Авторы настоящего изобретения определили, что уровень ферритина может быть применимым биомаркером при определении или предсказании ответа на терапию с помощью антагониста BMP9. Соответственно, квалифицированному специалисту будет понятно, что можно идентифицировать, имеет ли субъект заданный уровень ферритина посредством осуществления анализа биологического образца, например, крови или сыворотки крови, от пациента в отношении уровня ферритина. В предпочтительных вариантах осуществления сыворотку крови пациента анализируют для определения того, имеется ли у субъекта конкретный уровень ферритина. В других предпочтительных вариантах осуществления кровь пациента анализируют для определения того, имеется ли у субъекта конкретный уровень ферритина.

Как описано в данном документе, настоящее изобретение отчасти основывается на заключении, что уровень ферритина может быть полезен для предсказания улучшенного ответа на анатагонизм в отношении BMP6 (например, у антитела 7, которое описано в таблице 1) в случае анемии или другого заболевания, описанного в данном документе. Выявление ферритина можно осуществлять с помощью любого известного из уровня техники способа, в том числе без ограничения иммуноцитохимического окрашивания, ELISA, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, спектрофотометрии, HPLC и масс-спектрометрии. Один способ выявления продуктов, представляющих собой полипептиды, в образце осуществляют с помощью зонда, который представляет собой связывающий белок, способный специфически взаимодействовать с маркерным белком (например, антитело, способное связывать белок ферритин). Предпочтительно можно применять меченые антитела, их связывающие части или другие партнеры по связыванию. Антитела по происхождению могут быть моноклональными или поликлональными, или они могут быть получены с помощью биосинтеза. Партнеры по связыванию также могут представлять собой встречающиеся в природе молекулы или полученные с помощью синтеза. Количество находящихся в комплексе белков определяют с помощью стандартных методик выявления белка, описанных в уровне техники. Подробный обзор схемы, теории и протоколов иммунологического анализа можно найти во многочисленных книгах в уровне техники, в том числе Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984. Доступен ряд анализов для выявления белков с использованием меченых антител. Метки для прямого измерения включают флуоресцентные или люминесцентные метки, металлы, красители, радионуклиды и т. п., прикрепленные к антителу. Метки для непрямого измерения включают различные ферменты, хорошо известные из уровня техники, такие как щелочная фосфатаза, пероксидаза перекиси водорода и т. п. В одностадийном анализе продукты, представляющие собой полипептиды, если они присутствуют, иммобилизируют и инкубируют с меченым антителом. Меченое антитело связывается с иммобилизированной целевой молекулой. После отмывки для удаления несвязанных молекул образец подвергают анализу в отношении метки.

Настоящее изобретение также предполагает применение иммобилизированных антител, специфических в отношении белков или полипептидов. Антитела можно иммобилизировать на ряде твердых подложек, таких как магнитные частицы или частицы, являющиеся матрицей для хроматографии, поверхность места для анализа (такого как лунки микротитровального планшета), кусочки подложки из твердого материала (такого как пластик, нейлон, бумага) и т. п. Полоску для анализа можно получить посредством нанесения антитела или множества антител в виде покрытия в ряд на твердой подложке. Полоску затем можно погрузить в тестируемый образец, а затем подвергнуть быстрой обработке посредством стадий отмывки и выявления для образования измеряемого сигнала, такого как окрашенное пятно.

В двухстадийном анализе иммобилизированный маркер (например, ферритин) можно инкубировать с немеченым антителом. Комплекс с немеченым антителом, если он присутствует, затем связывается со вторым меченым антителом, которое является специфическим в отношении немеченого антитела. Образец промывают и анализируют в отношении присутствия метки. Выбор маркера, применяемого для мечения антител, будет меняться в зависимости от применения. Тем не менее, выбор маркера может легко определить специалист в данной области техники. Антитела можно метить радиоактивным атомом, ферментом, хромофорным или флуоресцентным фрагментом или колориметрической меткой. Выбор метки для мечения также будет зависеть от требуемых ограничений по выявлению. Ферментативные анализы (разновидности ELISA), как правило, обеспечивают возможность выявления окрашенного продукта, образующегося при взаимодействии меченого ферментом комплекса с субстратом фермента. Некоторые примеры радиоактивных атомов включают 32P, 125I, 3H и 14P. Некоторые примеры ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу. Некоторые примеры хромофорных фрагментов включают флуоресцеин и родамин. Антитела можно конъюгировать с этими метками с помощью способов, известных из уровня техники. Например, ферменты и хромофорные молекулы можно конъюгировать с антителами с помощью связывающих средств, таких как диальдегиды, карбодиимиды, дималеимиды и т. п. В качестве альтернативы конъюгирование может осуществляться посредством пары лиганд-рецептор. Некоторые подходящие пары лиганд-рецептор включают, например, биотин-авидин или -стрептавидин и антитело-антиген.

В одном аспекте настоящее изобретение предполагает применение сэндвич-методики для выявления продуктов, представляющих собой полипептиды, в биологических образцах. В методике необходимы два антитела, способные связываться с представляющим интерес белком, например, одно иммобилизированное на твердой подложке, и одно несвязанное, находящееся в растворе, но меченое неким легко выявляемым химическим соединением. Примеры химических меток, которые можно применять для второго антитела, включают без ограничения радиоизотопы, флуоресцентные соединения и ферменты или другие молекулы, которые образуют окрашенные или электрохимически активные продукты при воздействии на них реактива или субстрата фермента. Когда образцы, содержащие продукты, представляющие собой полипептиды, помещают в эту систему, продукты, представляющие собой полипептиды, связываются как с иммобилизированным антителом, так и с меченым антителом. Результатом является иммунный комплекс в виде "сэндвича" на поверхности подложки. Белок, находящийся в комплексе, выявляют посредством отмывания несвязанных компонентов образца и избытка меченого антитела и измерения количества меченого антитела, находящегося в комплексе с белком, на поверхности подложки. Иммунологический сэндвич-анализ является высоко специфическим и очень чувствительным при условии, что применяют метки с надлежащими пределами выявления.

Предпочтительно, наличие продуктов, представляющих собой полипептиды, в образце выявляют с помощью радиоиммунологических анализов или иммуноферментных анализов, конкурентных иммуноферментных анализов связывания, дот-блоттинга, вестерн-блоттинга, хроматографии, предпочтительно, высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), или других анализов, известных из уровня техники. Специфическое иммунное связывание антитела с белком или полипептидом можно выявить прямо или косвенно.

Дот-блоттинг обычно применяется на практике квалифицированным специалистом для выявления требуемого белка с применением антитела в качестве зонда (Promega Protocols and Applications Guide, Second Edition, 1991, Page 263, Promega Corporation). Образцы наносят на мембрану с применением устройства для дот-блоттинга. Меченый зонд инкубируют с мембраной и выявляют наличие белка.

Анализ посредством вестерн-блоттинга является хорошо известным квалифицированному специалисту (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Vol. 3, Chapter 18, Cold Spring Harbor Laboratory). При вестерн-блоттинге образец разделяют с помощью SDS-PAGE. Гель переносят на мембрану. Мембрану инкубируют с меченым антителом для выявления требуемого белка.

Анализы, описанные выше, включают стадии, такие как без ограничения иммуноблоттинг, иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез или иммунопреципитация. В некоторых вариантах осуществления автоматический анализатор применяют для определения наличия и/или уровня ферритина.

Уровень активности ферритина можно анализировать с помощью различных способов, раскрытых в уровне техники, например, посредством способов, изложенных в Kochan et al. (2011) Proc Natl Acad Sci U S A. 108(19):7745-50.

С целью сравнения уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина у пациента можно сравнивать с уровнем экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина у контроля. Контроль может представлять собой эталонный уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина, полученный у субъектов (например, пациентов с анемией), у которых известен хороший ответ на лечение с помощью антагониста BMP6 (например, антитела 7, описанного в таблице 1), или субъектов, у которых известен слабый ответ на лечение с помощью антагониста BMP6 (например, антитела 7, описанного в таблице 1), в зависимости от конкретного случая. Контрольный уровень экспрессии можно получить из биологических образцов от эталонных субъектов (т. е. пациентов с анемией, у которых известен хороший ответ на лечение с помощью антагониста BMP6 (например, антитела 7, описанного в таблице 1), или субъектов, у которых известен слабый ответ на лечение с помощью антагониста BMP6 (например, антитела 7, описанного в таблице 1), или он может представлять собой просто числовой стандарт (например, среднее значение, медианное значение, диапазон, [+/- стандартное отклонение]), ранее полученный у эталонных субъектов. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой эталонный уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина, полученный у субъекта, у которого известен слабый ответ на лечение с помощью антагониста BMP6, и уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина (в зависимости от конкретного случая) у пациента сравнивают с этим контролем. В других вариантах осуществления контроль представляет собой эталонный уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина, полученный у субъекта, у которого известен хороший ответ на лечение с помощью антагониста BMP6, и уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина у пациента, подлежащего лечению, сравнивают с этим контролем, при этом подобный (например, статистически подобный) уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина у пациента (в сравнении с контролем) обеспечивает указание того, что пациент будет характеризоваться повышенной вероятностью ответа на лечение с помощью антагониста BMP6 (например, антитела 7, описанного в таблице 7).

При осуществлении любого из способов, описанных в данном документе, которые требуют определения наличия или уровня экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина, такое определение можно выполнить с помощью обращения к банку данных, который содержит достаточную информацию о характеристиках пациента для определения того, имеет ли пациент маркер (или уровень маркера), представляющий интерес. Предпочтительно банк данных содержит перечень маркеров и уровень маркера, представляющего интерес, у индивидуумов. Банк данных может включать историю болезни индивидов, карту с медицинскими данными, файл (например, файл ASCII в одноуровневой базе данных), доступные с помощью компьютера или другого электронного носителя или носителя, отличного от электронного, на котором может хранится соответствующая информация или генетические данные. В контексте данного документа карта с медицинскими данными представляет собой переносное накопительное устройство, такое как магнитная карта с данными, интеллектуальная карточка, которая имеет встроенный блок обработки и которая реализуется поставщиками, такими как Siemens из Мюнхена, Германия, или карта флэш-памяти. Если банк данных представляет собой файл, доступный с помощью компьютера; такие файлы могут располагаться на различных носителях, в том числе сервер, клиент, жесткий диск, CD-диск, DVD-диск, персональный цифровой помощник, такой как смартфон, карманный компьютер Palm Pilot, устройство для записи на магнитную ленту, zip-диск, внутреннее ROM (постоянное запоминающее устройство) компьютера, или Интернет, или всемирную паутину. Другие носители для хранения файлов, доступных с помощью компьютера, будут очевидны для специалиста в данной области техники.

Как правило, после определения уровней экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина врачи, или генетики-консультанты, или пациенты, или другие исследователи могут быть проинформированы о результате. В частности, результат может быть реализован в виде информации в пригодной для передачи форме, которую можно сообщить или передать другим исследователям, или врачам, или генетикам-консультантам, или пациентам. Такая форма может изменяться и может быть материальной или нематериальной. Результат у тестируемого индивидуума может быть реализован в виде описательных заключений, графиков, фотографий, диаграмм, изображений или любых других визуальных форм. Например, изображения результатов гель-электрофореза или анализов захвата можно использовать при пояснении результатов. Заключения, касающиеся уровней экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина, также являются применимыми при указании результатов тестирования. Эти заключения и визуальные формы могут быть записаны на материальных носителях, таких как разновидности бумаги, машиночитаемых носителях, таких как гибкие магнитные диски, компакт-диски и т. д., или на нематериальных носителях, например, электронных носителях в форме сообщения электронной почты или веб-сайта в сети Интернет или внутренней электронной сети. Кроме того, результаты также могут быть записаны в звуковой форме, и их можно передавать с помощью любой подходящей системы связи, например, аналоговых или цифровых кабельных линий, оптоволоконных кабелей и т. д., посредством телефона, факсимильных сообщений, беспроводного мобильного телефона, телефона с доступом в сеть Интернет и т. п. Все такие формы (материальные и нематериальные) будут составлять "пригодную для передачи форму информации". Таким образом, информация и данные о результате исследования можно получить в любом месте в мире и передать в другое место. Результат исследования в пригодной для передаче форме, таким образом, можно импортировать в U.S. Соответственно, настоящее изобретение также охватывает способ получения информации в пригодной для передачи форме, предусматривающей уровни экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина у индивидуума. Эта форма информации является применимой для предсказания восприимчивости пациента, имеющего заболевание, описанное в данном документе, например, анемию, к антагонисту BMP6 для выбора курса лечения на основании этой информации и для селективного лечения пациента на основании этой информации.

В данном документе раскрыты способы предсказания вероятности того, что пациент с уровнями белка ферритина будет отвечать (например, отвечать с увеличенной эффективностью, например, по сравнению с общей популяцией пациентов, страдающих от того же или подобного заболевания) на лечение с помощью антагониста BMP6, предусматривающие выявление уровня ферритина в биологическом образце от пациента, где уровень ферритина, описанный в данном документе, например, ≤ 1500 нг/мл, указывает на повышенную вероятность того, что пациент будет отвечать на лечение с помощью антагониста BMP6.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию получения биологического образца от пациента, причем стадию получения выполняют перед стадией осуществления анализа.

В некоторых вариантах осуществления биологический образец выбран из группы, состоящей из синовиальной жидкости, крови, сыворотки крови, кала, плазмы крови, мочи, слезы, слюны, спинномозговой жидкости, образца лейкоцитов и образца ткани. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой кровь или сыворотку крови.

В некоторых вариантах осуществления наличие и/или уровень экспрессии ферритина, белка ферритина или активности ферритина выявляют с помощью методики, выбранной из группы, состоящей из иммунологических анализов, иммуногистохимического анализа, ELISA, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга, HPLC и масс-спектрометрии.

В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов и применений антагонист BMP6 представляет собой молекулу, связывающую BMP6, или молекулу, связывающую рецептор BMP6. В некоторых вариантах осуществления молекула, связывающая BMP6, или молекула, связывающая рецептор BMP6, представляет собой молекулу, связывающую BMP6. В некоторых вариантах осуществления молекула, связывающая BMP6, представляет собой антитело к BMP6 или его антигенсвязывающую часть.

В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов и применений антитело к BMP6 представляет собой антитело 7, например, которое описано в таблице 1.

СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПУТИ ПРИМЕНЕНИЯ АНТАГОНИСТОВ BMP6

Раскрытые способы позволяют врачам-клиницистам обеспечивать персонализированную терапию для пациентов, страдающих заболеванием, описанным в данном документе, например, пациентов с анемией, т. е. они обеспечивают возможность определения того, назначать ли пациенту селективное лечение с помощью антагониста BMP6 (например, антитела 7, например, которое описано в таблице 1). Таким образом, врач-клиницист может увеличить до максимума благоприятное воздействие и сводить к минимуму риск антагонизма BMP6 в целой популяции пациентов, пораженных заболеванием, описанным в данном документе, например, анемией. Будет понятно, что антагонисты BMP6, например, молекулы, связывающие BMP6 (например, антитело к BMP6 или его антигенсвязывающая часть, например, антитело 7, например, которое описано в таблице 1) или молекулы, связывающие рецептор BMP6 (например, антитело к рецептору BMP6 или его антигенсвязывающая часть), являются применимыми для лечения, предупреждения или облегчения тяжести заболевания, описанного в данном документе, например, анемии (например, признаков и симптомов и т. д.), как раскрыто в данном документе, в частности, у пациентов, которые имеют уровень ферритина, описанный в данном документе.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предусмотрены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения его объема. Другие варианты настоящего изобретения будут полностью очевидны специалисту в данной области техники и охвачены прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕР 1. Активность in vitro и in vivo и PK/PD антител к BMP6

Материалы

Исследуемые соединения представляли собой антитела 5, 6 и 7 (таблица 8) в концентрации ~8 мг/мл в 50 мM цитратного буфера, pH 7,0, 150 мM NaCl и разбавленные в PBS перед введением животному. Использовали самцов мышей C56BL/6 или крыс Sprague Dawley (таблица 9).

Таблица 8. Свойства антагонистических антител к BMP6

ID антитела	Каркас	KD (нM) BMP6	IC50 (мкг/мл) репортера BMP6
АНТИТЕЛО 5	VH3_15, Vl1	0,1	0,06
АНТИТЕЛО 6	VH3_15, Vl1	<0,1	0,08
АНТИТЕЛО 7	VH3_15, Vl1	0,1	0,07

Таблица 9. Характеристики животных

Вид	Порода	Категория	Поставщик	Пол	Возраст
Мышь (Mus musculus)	C57BL/6	Дикий тип	Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мэн	Самец	8-9 недель
Крыса (Rattus norvegicu)	Sprague Dawley	Дикий тип	Charles River Laboratory, Уилмингтон, Массачусетс	Самец	8-12 недель

Для анализов репортерного гена BMP конструировали лентивирусный вектор, содержащий чувствительный к BMP элемент BRE в промоторе [Korchynskyi et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 4882-91], контролирующий люциферазу светлячка, полученный из pGL4-BRE2-Luc2. Лентивирусный вирус использовали для стабильной трансфекции линии клеток гепатомы HEP3B. Линию клеток поддерживали в EMEM с использованием 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина и 5 мкг/мл бластицидина. Рекомбинантные белки человека BMP приобретали у R&D Systems.

Антиген для кольцевого теста Brucella abortus (штамм 1119-3) в колбах объемом 60 мл приобретали в Департаменте сельского хозяйства США, Служба контроля здоровья животных и растений, Национальные лаборатории ветеринарной службы, Эймс, Айова. Бруцеллезный антиген для кольцевого теста содержит суспензию уничтоженных окрашенных клеток штамма 1119-3 B. abortus в фенолизированном буфере. Концентрация в каждой колбе объемом 60 мл составляет примерно 10⁹ частиц/мл. Исходный раствор 5×10⁹ промывали и получали следующим образом. Сначала колбы объемом 60 мл извлекали из холодильника и тщательно перемешивали. Затем 500 мл BA переносили в колбу для центрифугирования объемом 500 мл. Затем их центрифугировали при 10000 об./мин. в течение 15 минут с помощью ультрацентрифуги. Надосадочную жидкость удаляли и ресуспендировали в 100 мл PBS, в результате чего получали исходный раствор 5×10⁹ частиц/мл, который разделяли на аликвоты и замораживали при -80°C.

Условия содержания животных

Животных содержали вместе в микроизолированных клетках с твердым дном во время периодов акклиматизации и исследования. Животных содержали при стандартном цикле света следующим образом: 12 часов темноты, 12 часов света (свет включали в 6:30 утра, свет выключали в 6:30 вечера) при комнатной температуре 21-23°C и влажности 30-70%. Во время периодов акклиматизации и исследования животным предоставляли неограниченный (ad lib) доступ к рациону для грызунов и воде.

Экспериментальные условия

Определение активности антител в анализе репортерного гена BMP

В типичном анализе 0,6×10⁴ клеток BRE-Luc2 HEP3B высевали на 384-луночных планшетах в 25 мкл основной культуральной среды помимо того, что сыворотку восстанавливали до 2%. На следующий день добавляли антитела, разведенные в PBS, после этого добавляли BMP6 до конечной концентрации 10 нг/мл. Объем доводили до 50 мкл средой EMEM без какой-либо сыворотки, получая конечную концентрацию сыворотки 1%. В качестве противоположных анализов параллельно выполняли активацию BMP2/4/7. Анализ BrighGlo (Promega) осуществляли через 24 часа после добавления антител в соответствии с инструкцией производителя с использованием планшет-ридера Envision (PerkinElmer). Данные рассчитывали в виде процента ингибирования каждого антитела по сравнению с полной репортерной активацией контрольным антителом.

Фармакокинетическое исследование однократной дозы антитела у крысы

Исследование PK с сортировкой крыс не предполагало определение классических РК-параметров с определенной статистической значимостью, а вместо этого получение оценки периода полужизни исследуемого антитела в сыворотке крови. 3 животным вводили одну IV дозу антитела.

В случае PK/PD исследования "доза-эффект" у мышей животных поровну разделяли на 2 отдельные когорты. В каждую когорту включали как мышей, обрабатываемых средой-носителем, так и мышей, обрабатываемых соединением. Одну когорту подвергали анализу в день 2, 4, в то время как вторую когорту анализировали в день 6, 8 после инъекции антитела. Причиной разделения когорт было снижение потребности в периодическом заборе крови, таким образом, что влияние на параметры железа в сыворотке крови поддерживали минимальным. Группы животных представлены в таблице 10.

Таблица 10. Дизайн, размещение животных и дозы исследуемых препаратов

Эксперимент	Группа	Количество	Доза (мг/ кг, IV)	Частота
PK/PD у мышей	Контрольный hIgG	5	0,5	Однократно
	0,05 мг/кг АНТИТЕЛО 6	5	0,05	Однократно
	0,1 мг/кг АНТИТЕЛО 6	5	0,1	Однократно
	0,5 мг/кг АНТИТЕЛО 6	5	0,5	Однократно
Анемия у мышей, обработанных BA	Имитация (без BA)	6	0	0
	BA, EPO+ контрольный hIgG	6	2	Однократно
	BA, EPO+ АНТИТЕЛО 5	6	2	Однократно
	BA, EPO+ АНТИТЕЛО 6	7	2	Однократно
	BA, EPO+ АНТИТЕЛО 7	6	2	Однократно

Возникновение анемии, обусловленной воспалением, у мышей и терапевтическое лечение

5×10⁸ частиц BA для инъекции получали следующим образом (пример в случае 10 мышей). Исходная концентрация должна составлять 2,5×10⁹ частиц/мл, поскольку вводили 200 мкл/мышь. Исходный раствор разводили в 2 раза с помощью PBS. Например, для 10 мышей с умножением на 0,200 мкл требовалось 2 мл+20% допустимого избытка=2,2 мл 2,5×10⁹ частиц/мл. 1,1 мл исходного раствора BA +1,1 мл PBS. Показано, что введение BA за 1-8 дней до обработки ESA, приводило к ослабленному ответу HGB через 6-7 дней.

Мышам C57BL/6 вводили BA (3×10⁸ частиц/мышь), и уровни IL6 в сыворотке крови измеряли через 5 часов после ELISA (KMC0061, Life Technologies) с определением воспалительного ответа. Животных с концентрацией IL6 ниже 95% доверительного интервала среднего в случае BA-обработанных животных исключали из исследования, что приводило в результате к наличию менее 5-6 мышей в некоторых группах. Этот процесс исключения осуществляли для уменьшения вероятности ложноположительных результатов, получаемых в результате включения животных, которые не характеризовались достаточным воспалением для ослабления ответа ESA. После процесса исключения мышам IV вводили антитела, как указано, в день 6, и EPO (100 г/кг подкожно, дарбэпоэтин альфа, Amgen) вводили при 100 мг/кг в день 7 относительно обработки с помощью BA. Ответ на ESA, а также результаты терапии антителами измеряли через 6 дней.

Анализы фармакокинетики, фармакодинамики и конечных точек эффективности

В случае PK/PD исследований у мышей и крыс образцы сыворотки крови собирали в указанные временные точки после инъекции антитела. Аликвоты сыворотки крови использовали для определения концентрации циркулирующих антител с помощью автоматизированной системы иммунологического анализа с высокой пропускной способностью (Gyros) с биотинилированным антителом к IgG в качестве первичного захватывающего антитела. Вторую аликвоту сыворотки крови каждого образца использовали для количественного колориметрического анализа железа (Quntichrom, DIFE-250, Bioassay Systems). Третью аликвоту обрабатывали для количественной оценки с помощью LC-MS пептида гепсидин-25 крысы или мыши в соответствии с модифицированной процедурой, описанной ранее. Li et al. 2009. J. Pharm. Tox. Meth. 59: 171-80.

В случае BA-индуцированной анемии и исследования с обработкой антителами конечный забор крови в покрытые EDTA пробирки BD Microtainer выполняли по завершению исследования посредством пункции сердца. В случае развернутых анализов крови на гематологическом анализаторе XT-2000iV использовали цельную кровь. Конечные точки эффективности включали HGB, HCT, RETA и RET-HE.

Статистические анализы

Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным критерием Бонферрони выполняли для анализа групповых различий (с p<0,05, считавшимся значимым) гематологических параметров. Данные представлены в виде средних значений ± SEM.

Результаты

Биологическая активность антагонистических антител к BMP6 в клеточных BMP-зависимых анализах транскрипции

Все три антагонистические антитела 5, 6 и 7 к BMP6 полностью подавляли биологическую активность репортера BMP, индуцированного BMP6 человека (BRE-luc) в линии клеток гепатомы человека Hep3B (IC50=0,4 нM по сравнению с 0,3 нM rhBMP6) и, таким образом, были активными при молярном соотношении Ag/mAb 1:1 или выше. Антитела характеризовались хорошей селективностью по отношению к соответствующим белкам семейства BMP, в том числе BMP2, 5 и 7, с 500-кратным или более окном. См. фиг. 1.

Одномоментные фармакокинетические и фармакодинамические профили антагонистических антител к BMP6 у крысы

Фармакокинетическое исследование однократной дозы с сортировкой у крыс Sprague Dawley осуществляли в случае антител 5, 6 и 7 к BMP6 путем IV инъекции посредством катетера яремной вены при 10 мг/кг веса тела. Сравнение взаимоотношения общей концентрации антитела и времени (в частности, t_1/2, MRT) в сыворотке крови в случае трех антител со стандартным профилем указывало на характеристики, сопоставимые с типичным IgG человека (см. фиг. 2 и таблицу 11). Доказательства мишень-опосредованного распределения лекарственного средства отсутствовали. При этой дозе все антитела к BMP6 подавляли гепсидин сыворотки крови до уровней ниже предела обнаружения в день 1 после инъекции. Устойчивое выраженное подавление экспрессии гепсидина было все еще явным в день 16, указывая на длительную продолжительность активности. Соответственно, временное увеличение пика концентрации циркулирующего железа наблюдали в день 2 после инъекции антитела, и уровни оставались повышенными до дня 16.

Концентрацию антитела в сыворотке крови измеряли в динамике после одной инъекции антитела. Образцы собирали через 1 ч., 6 ч., 1, 2, 4, 8, 16, 28 дней после введения дозы (10 мг/кг, IV).

Таблица 11. Ключевые параметры исследования PK однократной дозы с сортировкой у крыс

Параметры	АНТИТЕЛО 5	АНТИТЕЛО 6	АНТИТЕЛО 7
T_1/2(дни)	9,1	7,8	9,2
C_max (мкг/мл)	140,7	189,0	146,2
Среднее время контакта (дни)	8,6	7,0	6,9

Кроме того, общую концентрацию антитела 7 (как свободного, так и BMP6-связанного) в сыворотке крови измеряли у крыс и макаков-крабоедов после одной IV инъекции антитела 7 (у крыс в дозах 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мг/кг; у макаков при 3 мг/кг) в указанное время с помощью ELISA с использованием LLOQ 46 нг/мл (пунктирная линия) у крыс и LLOQ 0,2 мкг/мл (пунктирная линия) у макаков. Результаты представлены на фиг. 9 (крыса) и 12 (обезьяна).

Дозозависимый ответ в отношении параметров железа в сыворотке крови после обработки антителом к BMP6 у мышей и макаков-крабоедов

Для дальнейшего определения дозозависимого ответа метаболизма железа на обработку антителом к BMP6 наивным мышам C57BL/6 вводили возрастающую дозу антитела 6 в диапазоне от 0,02 до 0,5 мг/кг, как указано. Антитело 6 выбирали в качестве представителя 3 антител, поскольку они имеют аналогичный каркас, PK профиль у грызунов и активности in vitro. Однократная доза 0,5 или 0,1 мг/кг значительно подавляла уровень гепсидина в сыворотке крови и соответственно повышала концентрацию железа в сыворотке крови через 2 дня после обработки. Однако лишь при 0,5 мг/кг наблюдали выраженный устойчивый эффект в отношении метаболизма железа до 8 дней после инъекции. См. фиг. 3. Эти результаты указывают на то, что дозозависимую насыщаемую нейтрализацию мишени можно легко достичь с помощью сильнодействующих антагонистических антител к BMP6.

См. фиг. 3, дозозависимые эффекты антитела к BMP6 в отношении биомаркеров сыворотки крови метаболизма железа, вверху: концентрация hIgG в сыворотке крови в зависимости от времени после одной IV инъекции антитела 6 в указанных дозах, внизу: левая панель представляет собой количественный анализ концентрации гепсидина в сыворотке крови после одной инъекции антитела 6 или контрольного IgG человека, тогда как правая панель представляет собой концентрацию железа в сыворотке крови.

Аналогичные эксперименты осуществляли в случае антитела 7. Дозозависимое и зависимое от времени подавление циркулирующего в сыворотке крови гепсидина посредством антитела 7 исследовали у самцов крыс Sprague-Dawley. Образцы сыворотки собирали через 0,25, 1, 2, 6 ч. и через 1, 2, 4, 7 и 14 дней после введения однократной дозы антитела 7 путем IV введения в дозе, находящейся в диапазоне от 0,03 мг/кг до 10 мг/кг. Уровни гепсидина в сыворотке измеряли с помощью LC/MS с использованием LLOQ=9 нг/мл. У тех же животных также измеряли уровня железа в сыворотке крови. Результаты представлены на фиг. 11.

Эти результаты указывают на то, что антитела к BMP6 по настоящему изобретению способны вызывать дозозависимое повышение уровня железа в сыворотке крови. Эффекты были стабильными и устойчивыми в течение по меньшей мере 2 недель после введения антитела.

Эффекты в отношении параметров железа в сыворотке крови в ответ на антитело к BMP6 также исследовали у макака-крабоеда. Самцам макаков-крабоедов вводили одну внутривенную инъекцию антитела 7 в дозе 3 мг/кг. В указанные дни после инъекции образцы сыворотки крови собирали и анализировали в отношении общей концентрации железа (Fe) и гепсидина в сыворотке крови. Результаты представлены на фиг. 13. Представлены данные от 3 отдельных животных (отмеченные на графике по отношению к исходным уровням до введения дозы). Средние значения указаны с помощью линии "x". Повышение уровня железа в сыворотке крови и подавление уровня гепсидина в сыворотке крови наблюдали через 24 ч. после введения антител, и эффекты сохранялись (по отношению к уровням до введения дозы) до конца 28-дневного исследования. Эти результаты указывают на то, что антитела к BMP6 по настоящему изобретению значительно индуцируют экспрессию гепсидина и снижают концентрацию циркулирующего железа у отличных от человека приматов.

Эффект антител к BMP6 в отношении параметров эритроцитов при обусловленной воспалением резистентной к ESA анемии у мышей

Эксперименты осуществляли для оценки терапевтической пригодности антител к BMP6 на мышиной модели анемии, обусловленной воспалением. См. фиг. 4. У мышей, обработанных антигеном Brucella abortus (BA), анемия возникала через 6 дней. Животных с анемией обрабатывали антителом к BMP6 совместно с рекомбинантным эритропоэтином (EPO), который начинали вводить спустя один день, и эффект терапии антителами в отношении прогрессирования анемии контролировали в день 13 относительно введения BA. Значения HGB и HCT снижались между началом обработки и днем 13, что было устойчивым при обработке EPO в отдельности. Комбинированная обработка антителом к BMP6 и EPO эффективно восстанавливала ответ к EPO и значительно повышала уровни HGB и HCT. Этот эффект был ассоциирован с сопутствующей стимуляцией активности эритропоэтина, что отражалось устойчивым повышением RETA, а также восстановленным содержанием гемоглобина ретикулоцитов, указывая на коррекцию синтеза гема вследствие функционального дефицита железа в компартменте эритропоэза.

См. фиг. 4, терапевтическая обработка антителом к BMP6 на мышиной модели резистентной к ESA анемии, обусловленной воспалением. Вверху: схема эксперимента в модели индуцированной с помощью BA резистентной к ESA анемии, обусловленной воспалением. Внизу: Параметры эритропоэза через 13 дней после обработки с помощью BA. HGB: гемоглобин; HCT: гематокрит; RETA: количество ретикулоцитов; RET-HE: эквивалент гемоглобина ретикулоцитов.

* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 в сравнении с BA+EPO+hIgG1.

ПРИМЕР 2. Клинический план исследования антител к BMP6 у человека

План клинического исследования. Оценка терапии с использованием антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают BMP6 человека.

Пациенты с терминальной стадией заболевания почек (ESRD) вырабатывают незначительное количество или вообще не вырабатывают эритропоэтин (EPO) и в целом требуют периодического введения экзогенного EPO и внутривенных инфузий (IV) железа для обеспечения EPO-индуцированного синтеза Hgb. До трети пациентов, находящихся на хроническом гемодиализе (HD), не отвечают соответствующим образом на EPO вследствие преимущественно внутриклеточной секвестрации железа. Гепсидин преимущественно выводится почками, а удаление путем диализа является неэффективным. Таким образом, пациенты, находящиеся на хроническом HD, как правило, характеризуются значимо повышенными уровнями гепсидина, который блокирует мобилизацию железа для эритропоэза. IV терапия препаратами железа более не является эффективной или рекомендуемой, когда запасы железа организма достигают критического уровня (о чем свидетельствуют высокие уровни ферритина в сыворотке крови). Текущие руководства не рекомендуют IV введение железа пациентам с анемией, находящимся на диализе, с высокими уровнями ферритина, и, таким образом, эти пациенты могут получать даже более высокие дозы EPO с потенциальным ассоциированным риском анемии с пониженной чувствительностью к EPO (Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012). Анемия с пониженной чувствительностью к EPO вызывает значительно повышенный риск смертности от любой причины, связанной как с анемией, так и с более высокой дозой EPO у пациентов, находящихся на гемодиализе (Kilpatrick et al 2008, Lopez-Gomez et al 2008, Fukuma et al 2012), и пациентов, находящихся на перитонеальном диализе (Suttorp et al 2013). Выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают BMP6 человека по настоящему изобретению, могут оказывать благоприятное воздействие на пациентов с хроническим заболеванием почек с анемией, обусловленной нехваткой железа, посредством повышения уровней гемоглобина (Hgb), при этом одновременно снижаются потребности во введении доз EPO и IV железа. Более низкий индекс резистентности к EPO (соотношение дозы EPO и уровня Hgb) коррелирует с более низким риском смертности.

В общем, целью терапии с использованием выделенных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают BMP6 человека по настоящему изобретению, является мобилизация секвестрированного железа, что может затем снижать потребности в дозе EPO и железа и улучшать уровни Hgb, при этом ожидается, что все из этого улучшит результаты лечения пациента. Это впервые проводящееся на людях исследование с применением однократных доз средства терапии с использованием выделенных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают BMP6 человека. В этом исследовании будут оценивать безопасность, переносимость, фармакокинетику, фармакодинамику и эффективность в популяции пациентов, находящихся на хроническом гемодиализе. Целью настоящего исследования является оценка того, оправдывает ли терапия с использованием выделенных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связывают BMP6 человека, дальнейшие клинические исследования анемии, ассоциированной с хроническим заболеванием почек.

План исследования

Дизайн исследования

Это впервые проводящееся на людях, состоящее из двух частей, неподтверждающееся исследование с применением однократной дозы выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6, для оценки безопасности, переносимости, PK, PD и эффективности в популяции пациентов, находящихся на хроническом гемодиализе. Часть 1 представляет собой впервые проводящееся на людях открытое исследование с применением однократной дозы с подбором дозы. Часть 2 представляет собой рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование с применением однократной дозы, в котором будут сравнивать два уровня дозы выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека.

Оценки безопасности будут включать физическое обследование, ECG, показатели жизнедеятельности, стандартные клинические оценки лабораторных показателей (общий анализ крови, биохимический анализ крови, показатели железа в сыворотке крови), контроль нежелательных явлений и серьезных нежелательных явлений.

Часть 1

Целями части 1 являются (a) оценка безопасности однократной дозы, PK, PD и переносимости, и (b) определение минимальной PAD выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека, определенной в виде минимальной дозы, исследуемой в части 1, которая приводит к повышению уровня Hgb (медианное изменение относительно исходного уровня ~ 0,5 г/дл) через 29 дней после введения дозы.

Во время проведения части 1 будет проходить скрининговый визит, при котором будут определять пригодность пациента для участия в исследовании (фигура 6). Пациенты, подходящие для участия в исследовании, будут определены в исследовательский центр и повторно оценены в отношении критериев пригодности во время визита исходного уровня. Все результаты оценки безопасности исходного уровня должны быть доступны и изучены до введения дозы.

На фигуре 6 представлено обобщение дизайна исследования в случае части 1. Пациентов попросят прибыть в исследовательский центр в день 1, непосредственно после их стандартного визита, связанного с диализом. Затем пациенты получат инфузию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека (точная доза будет зависеть от когорты). При возможности введение дозы должно предпочтительно осуществляться в день диализа до двухдневного интервала между диализами (например, пятница или суббота) и будет происходить после сеанса диализа в этот день. Однако, если это невозможно, тогда введение дозы может происходить в день диализа, и при этом не предшествовать двухдневному интервалу между диализами. После введения дозы первые два пациента в части 1 будут госпитализированы в течение по меньшей мере 48 часов для оценки безопасности и PK/PD. Пациенты вернутся в исследовательский центр в дни 4 и 6 для оценки PK/PD, а затем еженедельно в общей сложности в течение 29 дней для оценки PK, и в общей сложности в течение 12 недель для оценки безопасности, при этом визит окончания исследования будет происходить примерно в день 85. Визиты исследования, в том числе все лабораторные тесты, за исключением оценки PK после диализа, должны проходить перед запланированным визитом пациента, связанным с диализом.

Часть 1 будет начинаться с дозы, которая, как предполагается, не является фармакологически активной. Дозу будут корректировать для каждой последующей когорты части 1, исходя из медианного изменения уровня Hgb для каждой когорты после однократной дозы выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека, и уровня насыщения трансферрина (TSAT), как описано в разделе Статистическая оценка и показано на фигуре 7. Целью этого дерева решений является идентификация минимально возможной дозы, которая индуцирует мобилизацию железа (о чем свидетельствуют уровни насыщения трансферрина (TSAT) > 50%, наблюдаемые по меньшей мере у 4 пациентов в когорте из 6 пациентов через одну неделю после введения дозы) и повышение уровня Hgb. Если железо мобилизуется, но уровень Hgb не повышается на по меньшей мере 0,5 г/дл через 29 дней после введения дозы, то для определения потенциальных искажающих факторов будут анализировать клинические данные (например, потерю крови в результате избыточной не связанной с исследованием флеботомии). Соответствующие исследователи и представитель(-и) спонсора будут изучать нежелательные явления в каждой когорте и будут определять эти явления в контексте (a) известных медицинских проблем, ассоциированных с хронической почечной недостаточностью, и (b) доклиническими токсикологическими результатами. Последующим когортам не будут вводить дозу до тех пор, пока исследователи и спонсор не укажут, что она является безопасной для продолжения исследования.

На фигуре 7 представлен алгоритм коррекции доз в части 1. Анализ крови, в том числе измерения уровня Hgb, будут проводить перед диализом. Исходная доза будет составлять 0,01 мг/кг. В части 1 пациентов будут распределять в одну из не более 6 открытых когорт для подбора дозы из не более 6 пациентов в каждой. Минимальная PAD выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека, как определено выше, будет включена в группу с более низкой дозой для части 2. Дозу для каждой последующей когорты можно корректировать выше или ниже, как показано на фигуре 7. Если минимальная возможная доза (0,001 мг/кг) приводит в результате к среднему повышению уровня Hgb ≥ 0,5 г/дл, то она будет представлять собой минимальную PAD и более низкую дозу, выбранную для части 2, а следующая максимальная доза, оцененная в части 1, будет включена в группу с более высокой дозой для части 2. Если максимальная доза (0,1 мг/кг), оцененная в части 1, представляет собой минимальную PAD, то в части 2 будут продолжать исследование только с 2 группами: плацебо и минимальная PAD. В случае, если в части 1 необходимы дополнительные когорты с дозами, то эти когорты будут добавлены, как описано в данном документе.

В каждую когорту части 1 будет включено 6 пациентов. Первым 2 пациентам в первой когорте части 1 будут вводить дозы с интервалом по меньшей мере 7 дней. Расчет по времени последующих доз для пациентов когорт части 1 будет происходить по мере возможности графика работы соответствующего исследовательского центра и ресурсов поддержки. За всеми пациентами части 1 будут наблюдать в течение 12 недель после введения дозы.

Часть 2

Целями части 2 являются (a) оценка безопасности, PK, PD и переносимости, а также (b) определение эффективности на основании изменений уровня Hgb в ответ на однократную дозу антитела, которое связывает BMP6, по сравнению с плацебо. Часть 2 будет включать не более трех групп: не более двух групп с дозами Ab и одной группой с плацебо (фигура 8). Две группы с дозами Ab будут получены исходя из данных, полученных в части 1. В часть 2 будут включены примерно 60 пациентов с рандомизацией на три группы 1:1:1. В случае, если в части 1 минимальная PAD также является максимальной оцененной дозой (0,1 мг/кг), то в части 2 будет только две группы: минимальная PAD и плацебо. В этом случае 40 пациентов будут рандомизированы на две группы с соотношением рандомизации 1:1. Размер выборки части 2 можно корректировать на основании вариабельности изменения от исходного уровня Hgb в части 1.

На фигуре 8 представлен дизайн исследования в случае части 2. Во время проведения части 2 будет проходить скрининговый визит, при котором будут определять пригодность пациента для участия в исследовании. Пациенты, подходящие для участия в исследовании, будут повторно оценены на соответствие критериям пригодности, во время визита исходного уровня. Все результаты оценки безопасности исходного уровня должны быть доступны и изучены до введения дозы.

Пациентов попросят прибыть в исследовательский центр в день 1, непосредственно после их стандартного визита, связанного с диализом. Затем пациенты будут получать либо инфузию Ab, либо плацебо, как определено в результате распределения в соответствии с рандомизацией. При возможности введение дозы должно предпочтительно осуществляться в день диализа до двухдневного интервала между диализами (например, пятница или суббота) и будет происходить после сеанса диализа в этот день. Однако, если это невозможно, последующее введение дозы может происходить в день диализа, и при этом не предшествовать двухдневному интервалу между диализами. Пациенты будут возвращаться в исследовательский центр в дни 4 и 6, затем еженедельно для последующих оценок. Во время визитов последующего наблюдения пациенты будут проходить стандартные оценки безопасности, а также будут собраны данные PK в день 85. Визиты исследования могут проходить после запланированного визита пациента, связанного с диализом, для соответствия графику диализа пациента. За всеми пациентами, включенными в часть 2, будут наблюдать в течение 12 недель после введения дозы Ab (или плацебо).

Контроль доз EPO (обе части)

Коррекция отдельных доз EPO во время обеих частей будет контролироваться в соответствии со стандартом протоколом лечения каждого исследовательского центра диализа. Протоколы исследовательских центров будут изучены в качестве части оценки клинического центра, и будут проверены на соответствие стандартам лечения (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012). Пациентов, которые достигают уровня Hgb ≥ 13 г/дл в любой момент во время исследования, можно контролировать с помощью терапевтической флеботомии, на усмотрение исследователя, в дополнение к специфическим для исследовательского центра руководствам по контролю значений Hgb выше целевых уровней.

Контроль внутривенного введения железа (обе части)

Пациенты, получающие ударные IV дозы железа (100 мг/неделя) будут исключены из исследования. Пациенты, получающие еженедельно поддерживающие IV дозы железа (< 100 мг/неделя), могут быть включены в данное исследование. Еженедельная поддерживающая IV доза железа будет сохраняться в начале 1-й недели введения доз Ab. Показатели железа будут контролироваться во время первой недели после введения доз Ab и резервная терапия препаратами железа и IV контроль железа будут следовать стандарту лечения в соответствии с протоколом отделения контроля гемодиализа. Протоколы исследовательских центров будут изучены в качестве части оценки клинического центра, и будут проверены на соответствие стандартам лечения (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012).

Обоснование дизайна исследования

Обоснование дизайна состоящего из двух частей исследования

Обоснованием наличия двух частей в одной и той же популяции пациентов является выявление безопасности и эффективности минимальной PAD, направленной на сведение к минимуму количества пациентов и когорт, подверженных воздействию потенциально субтерапевтических доз. В части 2 будут определять эффективность минимальной PAD и одного уровня дозы выше минимальной PAD (как определено в части 1) по сравнению с группой плацебо.

Дизайн части 1 разрабатывали для оценки безопасности, переносимости, PK/PD однократных доз, а также минимальной PAD Ab в открытом исследовании. Минимальную PAD будут определять на основании медианного изменения в когорте каждой дозы Hgb через 29 дней после введения дозы Ab. Обоснованием для определения критериев PAD является то, что для клинически значимых ответов на EPO может потребоваться до 4 недель после изменения дозы EPO. Если Ab мобилизует железо в целевой популяции, то это может способствовать тому, что текущая доза EPO пациента оказывает более устойчивый эритропоэтический эффект. Диапазоны уровня Hgb в течение 29 дней, приведенные при определении критериев PAD, основаны на клинически значимых и безопасных значениях скорости повышения уровня Hgb в ответ на дозу EPO (~ 0,5 г/дл в течение 29 дней). Обоснованием для поиска минимальной PAD, а не максимального эффекта, является то, что чрезмерно устойчивый ответ Hgb является риском для безопасности в этой популяции пациентов, что отражается целевыми диапазонами уровня Hgb в текущем стандарте лечения (Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) Anemia Work Group 2012). Целями оценок безопасности и переносимости в части 1 являются (a) выявление сигналов безопасности, и (b) сообщение о решениях по поводу коррекции доз, благодаря чему дозы, выбранные для части 2 (минимальная PAD+1 более высокая доза) являются подходящими для дальнейшей оценки как безопасности, так и эффективности относительно плацебо. В то время как в части 1 мощность является недостаточной для того, чтобы получить несмещенную оценку безопасности, группа плацебо и выборки более крупного размера в части 2 будут обеспечивать несмещенную оценку безопасности при минимальной PAD и одной более высокой дозе. Помимо безопасности, переносимости и PK/PD, дизайн части 2 разработан таким образом, чтобы оценить эффективность по сравнению с плацебо в двойном слепом исследовании. Оценка эффективности будет основана преимущественно на Hgb наряду с индексом резистентности к EPO (ERI=еженедельная скорректированная на вес доза EPO, деленная на Hgb) в качестве ключевого второстепенного критерия оценки. ERI обеспечивает количественное измерение количества EPO, необходимого для достижения определенного значения Hgb, и тем самым, обеспечивает клинически важную информацию в дополнение к Hgb в отдельности.

Обоснование FIH у пациентов, находящихся на диализе

Это впервые проводящееся на людях (FIH) исследование будут проводить на пациентах, находящихся на хроническом гемодиализе (HD), а не на здоровых добровольцах (HV). Оценку безопасности, переносимости и PK/PD ответа на Ab к BMP6 человека у HV, по-видимому, нельзя переносить на пациентов, находящихся на хроническом HD, по нескольким причинам.

В отличие от HV, пациенты, находящиеся на хроническом HD, с анемией, высоким содержанием ферритина в сыворотке крови и низким TSAT, имеют хронически накопленные внутриклеточные запасы железа. Таким образом, безопасность, переносимость и фармакологические эффекты, связанные с мобилизацией железа в ответ на низкие дозы Ab, наиболее подходящим образом оцениваются у пациентов, находящихся на хроническом HD. У пациентов, находящихся на HV, с нормальной функцией почек, гепсидин (основным регулятором которого является BMP6) фильтруется почками и эффективно выводится в моче, приводя к низким циркулирующим уровням. В отличие от этого, с помощью диализа гепсидин фильтруется менее эффективно и скоротечно, приводя к более высоким циркулирующим уровням у пациентов, находящихся на хроническом HD (Zaritsky et al 2010). Кроме того, нормальные почки будут динамически корректировать уровни эндогенного EPO и изменение уровня Hgb может быть неочевидным в ответ на Ab. Таким образом, безопасность и переносимость, связанные с модуляцией гепсидина с помощью пути BMP6, и эффект Ab в отношении Hgb наиболее подходящим образом оцениваются у пациентов, находящихся на хроническом HD.

Обоснование целевой популяции пациентов

Дизайн данного исследования разработан для оценки Ab к BMP6 человека в условиях анемии, обусловленной нехваткой железа, с пониженной чувствительностью к EPO. С помощью общепринятых клинических руководств (KDIGO Clinical Practice Guideline for Anemia in Chronic Kidney Disease Anemia Work Group 2012) определяют недостаточную чувствительность к EPO в качестве потребности для двух повышений дозы EPO, на 50% выше стабильной дозы, для поддержания стабильной концентрации Hgb. Предложенные критерии пригодности разработаны для отбора пациентов, находящихся на стабильном хроническом HD с анемией и клиническими симптомами нехватки железа: повышенным содержанием ферритина и низкой TSAT (TSAT=уровень железа в сыворотке крови/общая железосвязывающая способность; TSAT очень сильно коррелирует с уровнем железа в сыворотке крови). Кроме того, при коррекции доз EPO и IV железа будут придерживаться строгих стандартов лечения в случае мишеней Hgb, TSAT и ферритина. Такой дизайн снижает риск отклонения от необходимых мишеней Hgb, поскольку изменения параметров железа и гематологических параметров будут продолжать контролировать в соответствии со стандартном лечения. Кроме того, пациенты, получающие ударные дозы IV железа в течение 1 недели до исходного уровня будут исключены. Пациенты, получающие поддерживающие дозы IV железа могут быть включены (если все другие критерии пригодности соответствуют). Обоснованием для включения этих пациентов является то, что текущий стандарт лечения в США диктует, чтобы Hgb и TSAT поддерживались в узких пределах, и, тем самым, полный отказ от поддерживающей терапии железом с целью соответствия критериям пригодности при более низком TSAT подвергал бы пациентов риску TSAT ниже 25%, делая необходимым курс ударных IV доз препаратов железа в соответствии со стандартом лечения. Однако пациенты, подходящие для участия в исследовании, получающие поддерживающую IV терапию препаратами железа, будут иметь свою еженедельную IV дозу препаратов железа, поддерживаемую в начале недели введения доз Ab, и будут возобновлять поддерживающую IV терапию препаратами железа только, как определяется протоколом стандарта лечения исследовательского центра, на основании показателей железа.

Обоснование дозы/режима, продолжительности лечения

Обоснование исходной дозы

Максимальную рекомендуемую исходную дозу (MRSD) рассчитывали на основании уровня отсутствия нежелательных явлений (NOAEL), исходя из 13-недельных (14 доз) токсикологических исследований GLP, проведенных на крысах и макаках-крабоедах. Животные получали еженедельно IV болюсные дозы по 0,1, 1, 10 и 100 мг/кг. За группами с дозами 1 и 100 мг/кг (только) впоследствии наблюдали в течение 16 недель в случае крыс или 24 недель в случае макаков-крабоедов после последней дозы выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека. MRSD оценивали вначале путем расчета эквивалентной дозы для человека (HED) в случае NOAEL, исходя из этих исследований (0,1 мг/кг), подхода, считающегося подходящим для лекарственных средств с молекулярной массой > 100 кДа, и затем с использованием фактора безопасности 10, для объяснения различий между видами в доклинических исследованиях и пациентами, такого как количество запасенного железа и потребность в эритропоэзе. Параметры PK в случае видов для доклинических исследований получали из токсикокинетических (TK) данных, собранных во время обеспечивающих IND токсикологических исследований. Затем соответствующие параметры PK у пациентов оценивали с помощью аллометрического масштабирования и эти параметры использовали для прогноза концентрации свободного или выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека, в зависимости от времени у пациентов в случае определенной дозы. Сравнение данных TK из токсикологических исследований с PK Ab на основе модели у пациентов указывало, что доза, в 10 раз ниже, чем NOAEL/HED, предположительно приводила к (минимальному) 10-кратному пределу на основании концентрации Ab.

Максимальные уровни железа в сыворотке крови, наблюдаемые в ответ на Ab, в исследованиях на животных могут давать заниженную оценку прогнозируемого ответа на Ab в отношении железа у человека, поскольку пациенты, находящиеся на HD, которым назначали IV терапию препаратами железом, имеют более высокие запасы железа в тканях, чем здоровые животные. Однако в отличие от здоровых животных без анемии, предполагается, что пациенты, находящиеся на HD, используют высвобождаемое железо сыворотки крови для эритропоэза; тем самым, животные модели могут давать заниженную оценку продолжительности повышения уровня железа. Патологию печени, наблюдаемую в 13-недельных исследованиях, не наблюдали в 4-недельных исследованиях, что указывало на то, что токсичность является следствием кумулятивного воздействия железа сыворотки крови, а не ответа на острое высвобождение железа.

Для объяснения предполагаемых различий в запасенном железе между видами в доклинических исследованиях и пациентами также прогнозировали MRSD на основе анализа с использованием модели концентраций железа в сыворотке крови. Кумулятивное воздействие железа сыворотки крови, которое приводило в результате к токсикологическим результатам, представляли в виде площади под кривой железа (Fe AUC). В данном подходе Fe AUC, рассчитанную для дозы NOAEL (0,1 мг/кг), рассматривали в качестве достаточно безопасной. Затем прогнозировали Fe AUC при предложенной MRSD у пациентов и сравнивали с Fe AUC у видов в доклинических исследованиях при NOAEL. Поскольку прогнозируемое с использованием модели воздействие железа сыворотки крови при MRSD у пациентов являлось в > 10 раз меньшим, чем при NOAEL у видов при доклинических исследованиях, то снижение NOAEL/HED на фактор безопасности 10, считалось достаточным для оценки MRSD. Таким образом, предполагаемая MRSD составляла 0,01 мг/кг.

Обоснование коррекции дозы

В случае данного исследования максимальная исследуемая доза (xmax) будет представлять собой HED, соответствующую NOAEL в каждом из 2 обеспечивающих IND токсикологических исследований: 0,1 мг/кг. Минимальная возможная исследуемая доза (xmin) представляет собой наименьшую технически возможную дозу на основе исследований совместимости: 0,001 мг/кг. MRSD (x0) будут оценивать в соответствии с критериями безопасности, TSAT и Hgb (фигура 7). Если x0 приводит к медианному изменению уровня Hgb < 0,5 г/дл относительно состояния до введения дозы, то выбор x+(фигура 7) будет контролироваться линейной экстраполяцией по шкале оснований натуральных логарифмов (в ожидании сигмоидальной зависимости доза-эффект) от x0 до xmax. Предварительные дозы для данного повышения дозы представлены выше. Эти предварительные дозы можно корректировать на основании изучения данных во время неформального промежуточного анализа между каждой когортой. Данный подход будет продолжаться до тех пор, пока не будет выявлена PAD или достигнута xmax. Если xmax приводит к медианному изменению уровня Hgb < 0,5 г/дл, то безопасность этой дозы будут оценивать и будет приниматься решение о том, необходимо ли изменять протокол с добавлением дополнительных когорт при дозах, которые превосходят xmax, на основании данных безопасности, PK и PD. Если максимальная исследуемая доза в части 1 приводит в результате к среднему повышению уровня Hgb < 0,5 г/дл, не повышает TSAT выше 50%, а также эта доза составляет ниже xmax, то протокол может быть изменен с добавлением дополнительных когорт.

Если вместо этого x0 приводит в результате к медианному изменению уровня Hgb ≥ 0,5 г/дл относительно состояния до введения дозы, то доза для следующей когорты будет корректироваться до xmin. Если xmin также приводит к медианному изменению уровня Hgb ≥ 0,5 г/дл, то xmin будет считаться минимальной PAD, и xmin и x0 будут оцениваться в части 2. Если xmin приводит к медианному изменению уровня Hgb < 0,5 г/дл и TSAT ≤ 50% (фигура 7), то дозы будут повышаться в результате линейной экстраполяции в интервале (xmin, x0) по шкале оснований натуральных логарифмов до тех пор, пока либо не будет выявлена минимальная PAD, либо не будут оценены 6 доз (когорт). Предварительные дозы в интервале (xmin, x0) представлены выше. Эти предварительные дозы можно корректировать на основании изучения данных во время неформального промежуточного анализа между каждой когортой. Минимальная PAD будет определена в виде наименьшей исследуемой дозы, которая приводит в результате к медианному изменению уровня Hgb ≥ 0,5 г/дл относительно состояния до введения дозы.

Ab будут вводить в виде IV инфузии одной дозы с тем, чтобы обеспечить меньшее воздействие железа сыворотки крови (Fe AUC), чем таковое, ассоциированное с нежелательными результатами в доклинических токсикологических исследованиях. Будут осуществлять инфузию раствора Ab непосредственно после сеанса гемодиализа в день 1 со сведением к минимуму потенциального влияния диализа на PK или биодоступность железа непосредственно после введения дозы. Предполагается, что дополнительные примерно 30 минут инфузии дозы после диализа (лишь в день введения дозы) не создадут какой-либо значительный риск или дискомфорт для пациентов.

Обоснование выбора препарата-сравнения

Плацебо используют в качестве препарата сравнения в части 2 для обеспечения несмещенной оценки клинических результатов.

Цель и время проведения промежуточного анализа/адаптаций дизайна

В части 1 после того, как каждая когорта из 6 пациентов завершает оценку на 4-й неделе после приема дозы, будет проводиться неформальный промежуточный анализ для того, чтобы принять решение о коррекции дозы для следующей когорты. Маркеры безопасности и PD будут изучены всеми членами команды по коррекции дозы, в том числе соответствующими исследователями и представителем(-ями) спонсора. Новые когорты будут образованы только в том случае, если подтверждена безопасность и переносимость, и если соблюдены условия PD, как описано на фигуре 7. В части 1 будет проведено не более 5 неформальных промежуточных анализов. Неформальный промежуточный анализ планируют после того, как все пациенты из последней когорты части 1 завершают оценку на 4-й неделе после приема дозы, в целях оценки клинических эффектов исследуемых доз и потенциально инициации дополнительных доклинических исследований, и могут сообщать о последующих клинических исследованиях. Будет включены температура тела, кровяное давление, частота пульса, оценка ECG, биохимический анализ крови, гематологические показатели железа, индекс резистентности к EPO и нежелательные побочные явления, полученные ко дню 29 последней когорты, проведенной в части 1.

Минимальная PAD и доза на один уровень выше чем минимальная PAD будут выбраны для части 2. Если наименьшая возможная исследуемая доза индуцирует повышение уровня Hgb ≥ 0,5 г/дл, то две наименьшие исследуемые дозы будут выбирать для части 2.

Риски и преимущества

Потенциальное преимущество для пациентов, участвующих в данном исследовании, может включать сниженные потребности в EPO и IV железа и улучшенные уровни Hgb во время лечения и в течение некоторого периода после этого.

Риск для пациентов в этом исследовании будет сведен к минимуму в результате соблюдения критериев пригодности и тщательного клинического наблюдения всех пациентов (и госпитализации двух первых пациентов в части 1) в течение первых 48 часов после введения Ab.

Потенциальные риска, ассоциированные с мобилизацией железа, включают (a) перераспределение железа в ткани и органы, такие как селезенка, печень, сердце, поджелудочная железа и гипофиз, и (b) незначительное повышение восприимчивости к бактериальной инфекции, в частности у пациентов с имплантированными сосудистыми катетерами. Несколько из критериев пригодности снижают риск осложнений. Повышенные уровни печеночных функциональных тестов могут наблюдаться в ассоциации с перераспределением железа. Функцию печени можно контролировать параллельно с гематологическими параметрами и параметрами железа. Отклонение от стандарта лечения мишеней Hgb может приводить к полицитемии. Может осуществлять контроль терапии Hgb, EPO и терапии препаратами железа.

Пациенты, находящиеся на HD, которым назначали терапию IV препаратами железа, могут иметь более высокие запасы железа в тканях, чем здоровые животные; тем самым, максимальные уровни железа в сыворотке крови, наблюдаемые у пациентов, получавших лечение выделенным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которые связывают BMP6 человека, может превосходить таковые, наблюдаемые в исследованиях на животных. Однако в отличие от здоровых животных, предполагается, что пациенты, находящиеся на HD, используют высвобождаемое железо сыворотки крови для эритропоэза; тем самым, животные модели могут давать заниженную оценку продолжительности повышения уровня железа. Предполагается, что прогнозируемое с использованием модели воздействие Ab (например, Cmax, AUC) при MRSD будет в 10 раз меньше, чем наблюдаемое при NOAEL в доклинических исследованиях. Не предполагается, что такое воздействие будет приводить к уровням воздействия железа сыворотки крови (AUC), ассоциированным с повышением трансаминаз печени и некрозом одиночных клеток в печени, наблюдаемыми в доклинических исследованиях. Повышение дозы Ab по отношению к NOAEL будет происходить после оценок безопасности. Клинический опыт у пациентов с хронической перегрузкой железом, а также у таковых, которые получают парентеральное железо, вероятно не обязательно прогнозирует эффекты, которые могут произойти вследствие острого повышения внутриклеточного содержания железа, индуцированного Ab. Таким образом, потенциальный риск Ab-индуцированной острой токсичности железа, вероятно, является низким. Острая токсичность железа может влиять на сердце, печень и/или поджелудочную железу. Клинические проявления острой токсичности железа могут включать нарушения проводимости сердца, повышение уровня трансаминаз печени и нарушение толерантности к глюкозе/гипергликемию. Тяжелая острая токсичность железа может также включать метаболический ацидоз, нарушения электролитов и неврологические проявления. В случае, когда появляется острая токсичность железа, пациенты могут незамедлительно получать лечение в виде терапии хелаторами железа, такими как дефероксамин, в сочетании с гемодиализом. Максимальное количество 134 мл (часть 1) и 172 мл (часть 2) крови планируется собрать в течение периода, составляющего 115 дней, от каждого пациента в виде части исследования. Дополнительные образцы для наблюдения любых результатов по безопасности будут собирать в дополнение к этому. Это не считается риском для данной популяции.

К настоящему времени исследований, токсичности для репродуктивной системы, с использованием антител к BMP6 человека не проводили. Потенциальные эффекты в отношении мужских или женских половых органов определяли с помощью тщательного стандартного гистопатологического исследования яичников и семенников и дополнительных половых органов в 13-недельном исследовании токсичности у макаков-крабоедов. Связанных с лечением эффектов не наблюдали. Мыши с нокаутом по BMP6 характеризовались замедленным окостенением грудины и перегрузкой железом (Meynard et al 2009).

Значительная внутриутробная и материнская заболеваемость и смертность ассоциированы с хроническим гемодиализом. В одном ретроспективном когортном исследовании, в котором сравнивали женщин, находящихся на хроническом гемодиализе (267 родов), с женщинами, которые получали трансплантат почки (264 родов), женщины, находящиеся на гемодиализе, характеризовались более высокими частотами отслоения плаценты, переливания крови, гипотрофии новорожденных и материнской смертности (Saliem et al 2015). Таким образом, женщины с репродуктивным потенциалом должны применять высокоэффективные средства контрацепции для предупреждения беременности во время введения выделанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека, и в течение 125 дней после последней дозы.

Популяция

Исследуемая популяция будет состоять из пациентов с терминальной стадией заболевания почек, которые нуждаются в терапии в виде хронического гемодиализа по меньшей мере два раза в неделю, и которые имеют клинические признаки анемии, обусловленной функциональным дефицитом железа, определяемой как анемия в присутствии очевидно достаточных запасов железа, определяемых по уровням ферритина и насыщения трансферрина. Часть 1 включает план оценки не более 36 пациентов изначально в 6 когортах (6 пациентов/когорта). Если после 6 когорт эффекты в отношении TSAT и Hgb не наблюдаются и проблемы безопасности (определяемые соответствующими исследователями и представителем(-ями) спонсора) отсутствуют, то можно добавлять не более 2 дополнительных когорт из 6 пациентов (в общей сложности 48 пациентов в части 1). Часть 2 состоит из 3 групп (2 уровня дозы, выбранные для дополнительной оценки из части 1, и группа плацебо), включающих не более примерно 20 пациентов на группу (в общей сложности 60 пациентов в части 2). Таким образом, планируется включение в общей сложности примерно 96 пациентов (максимум до 108), из которых примерно 60 будут рандомизированы в части 2. Предполагается, что примерно 60 пациентов (12 - в части 1, 48 - в части 2) завершат исследование. Исследователь должен обеспечить, чтобы все пациенты, рассматриваемые для участия в исследовании, соответствовали следующим критериям пригодности. Никаких дополнительных критериев не должно использоваться исследователем для того, чтобы исследуемая популяция была репрезентативной для всех пациентов, подходящих для участия в исследовании.

Отбор пациентов осуществляется путем проверки всех критериев пригодности при скрининге и первом исходном уровне. Соответствующая запись (например, контрольный перечень) всех критериев пригодности должна храниться с первичной документацией в исследовательском центре.

Отклонение от любого критерия включения исключает пациента от включения в исследование.

Критерии включения (обе части)

Пациенты, подходящие для участие в данном исследовании, должны соответствовать всем из следующих критериев.

До того, как будет выполняться какая-либо оценка, должно быть получено письменное информированное согласие. Если согласие не может быть выражено в письменной форме, оно должно быть формально задокументировано и засвидетельствовано, в идеальном случае независимым доверенным свидетелем.

Возраст при скрининге ≥ 18 лет.

Зависимость от гемодиализа в течение по меньшей мере 2 месяцев до скрининга.

Получение соответствующего гемодиализа по меньшей мере 2 раза в неделю в случае терминального заболевания почек; отвечающее требованиям определяется в виде Kt/V ≥ 1,2 при самой последней месячной оценке перед скринингом.

Получение хронической терапии эритропоэтином (EPO) в соответствии с протоколом контроля анемии исследовательского центра диализа. Доза EPO не возрастала на 50% или больше в течение 14 дней до исходного уровня. Терапия EPO должна включать только быстродействующий состав (не дарбопоэтин) и вводиться IV (не SC).

Уровень Hgb ≥ 8,5, в том числе уровень Hgb ≥ 8,5 и < 11,5 г/дл, и не повышен на ≥ 0,5 г/дл на исходном уровне по сравнению с предшествующими 14 днями.

Ферритин <1500 нг/мл (включительно) в течение по меньшей мере 28 дней до исходного уровня (может включать скрининг). В качестве альтернативы, уровень ферритина > 500 нг/мл и ≤ 1000 нг/мл при скрининге.

TSAT ≤ 30% в минимум одной временной точке во время 90-дневного периода до исходного уровня и TSAT ≤ 30% при исходном уровне.

Критерии исключения (обе части)

Пациенты, соответствующие некоторым из следующих критериев, не подходят для включения в данное исследование. Никаких дополнительных критериев не может использоваться исследователем для того, чтобы исследуемая популяция была репрезентативной для всех пациентов, подходящих для участия в исследовании.

1. Применение других исследуемых лекарственных средств в пределах 5 периодов полужизни от периода включения в исследование, или до тех пор, пока предполагаемый фармакодинамический эффект возвращается к исходному уровню, в зависимости от того, что дольше.

2. В анамнезе гиперчувстительность к исследуемому лекарственному средству или терапевтическим антителам.

3. Подтвержденный диагноз гемохроматоза.

4. Подтвержденная злокачественная опухоль костного мозга, злокачественная опухоль лимфатической системы или миелодиспластический синдром.

5. В анамнезе диализ с тромбозом AV-фистулы в течение 2 месяцев до скрининга или 2 или несколько эпизодов тромбоза AV-фистулы в пределах 6 месяцев до скрининга.

6. Тяжелое сопутствующее заболевание/нарушение функции печени (балл Чайлд-Пью ≥ 6) или предшествующая трансплантация печени 7. Сердечная недостаточность (функциональный класс III или IV в соответствии с Нью-йоркской кардиологической ассоциацией (NYHA)).

8. Желудочно-кишечное кровотечение, требующее вмешательства в течение последних 2 месяцев до скрининга. Пациенты с инфекцией, вызванной вирусом гепатита C (HCV), могут быть включены, если соблюдены все другие критерии пригодности печеночной функции.

9. ALT, AST или билирубин ≥ 1,5x ULN в течение 4 недель до исходного уровня.

10. Неконтролируемая нефрогенная остеодистрофия, определяемая как PTH ≥ 750 пг/мл при скрининге.

11. Состояния, предрасполагающие к повышенному риску серьезной инфекции, такие как имплантированный сосудистый катетер (центральный венозный катетер или катетер для гемодиализа) или активная инфекция, требующая антибиотикотерапии в любое время в течение 2 недель до скрининга.

12. Переливание крови, назначаемое в течение 4 недель до исходного уровня.

13. Получение ударной дозы (100 мг/неделя) IV железа в течение 1 недели до исходного уровня.

14. В анамнезе злоупотребление наркотическими средствами и алкоголем в течение 12 месяцев до введения дозы, или симптомы такого злоупотребления, как свидетельствуют лабораторные анализы, проведенные во время скрининга.

15. Положительный результат теста на поверхностный антиген вируса гепатита A.

16. В анамнезе иммунодефицитные заболевания, в том числе положительный результат теста на HIV (ELISA и вестерн-блоттинг).

17. Женщины с репродуктивным потенциалом могут быть включены в данное исследование, если применяется высокоэффективная контрацепция, в течение минимум 125 дней после введения дозы антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека. Высокоэффективная контрацепция определяется как одно из следующего: a. полное воздержание (в случае, если это находится в соответствии с предпочтительным или обычным образом жизни пациента; периодическое воздержание (например, календарные, овуляционные, симптотемпературные, постовуляционные способы) и извлечение не являются приемлемыми способами контрацепции); b. стерилизация мужчины/женщины; с. применение пероральных, инъекционных или имплантируемых гормональных способов контрацепции или введение внутриматочной спирали (IUD) или внутриматочной системы (IUS) или других форм гормональной контрацепции, которые характеризуются сопоставимой эффективностью (частота неэффективности <1%), например, гормонального вагинального кольца или трансдермальной гормональной контрацепции.

Лечение

Исследовательское лечение

Исследовательская терапия в данном исследовании представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связывают BMP6 человека, например, IgG1 к BMP6, полностью человеческое антитело. Антитело предоставляют в жидком растворе. Исходную концентрацию будут разводить в исследовательском центре в соответствии с дозой, подлежащей введению. Время инфузии будут поддерживать относительно постоянным во всех когортах на уровне примерно 30 минут. Часть 1 будет представлять собой открытое исследование с применением однократных доз, а часть 2 будет представлять собой двойное слепое исследование с применением однократных доз в сравнении с соответствующим плацебо (контроль, представляющий собой среду-носитель). Активное вещество в виде Ab к BMP6 человека и плацебо будут поставлять в виде жидкости во флаконах. Наполнители в активном веществе и плацебо являются идентичными.

Группы лечения

В части 1 пациентов будут распределять в одну из не более 6 когорт для подбора дозы, состоящих из 6 пациентов в каждой. Часть 1 представляет собой открытое лечение. Исходная доза, максимальная доза и обоснование коррекции дозы описаны выше. Предварительные дозы для части 1 приведены в таблице 12 (Hgb < 0,5 г/дл при MRSD) и таблице 13 (Hgb ≥ 0,5 г/дл при MRSD).

Таблица 12. Уровни предварительных доз для части 1

В случае содержания Hgb менее 0,5 г/дл при уровне дозы MRSD	Предварительная доза	Увеличение предыдущей дозы
1 (MRSD)	0,010 мг/кг	Исходная доза
2	0,016 мг/кг	60% ↑
3	0,025 мг/кг	60% ↑
4	0,040 мг/кг	60% ↑
5	0,063 мг/кг	60% ↑
6 (NOAEL)	0,100 мг/кг	60% ↑

Данная таблица предусмотрена в качестве примера коррекции дозы в части 1 исключительно для ознакомления. Могут быть использованы промежуточные или более высокие уровни доз, а некоторые уровни доз могут быть пропущены на основании оценки данных во время неформального промежуточного анализа между каждой когортой. Фактические уровни доз могут быть подтверждены в письменной форме Novartis и предоставлены всем участвующим в исследовании исследовательским центрам перед лечением пациентов в новой когорте.

Таблица 13. Уровни предварительных доз для части 1

В случае содержания Hgb, равного 0,5 г/дл или больше при уровне дозы MRSD	Предварительная доза	Увеличение предыдущей дозы
1 (MRSD)	0,0100 мг/кг	Исходная доза
2	0,0010 мг/кг	90% ↓
3	0,0016 мг/кг	60% ↑
4	0,0025 мг/кг	60% ↑
5	0,0040 мг/кг	60% ↑
6	0,0063 мг/кг	60% ↑

Виды исследовательского лечения определяют следующим образом:

A: однократная доза плацебо.

B: однократная доза Ab к BMP6 человека при минимальной PAD, определяемой в части 1.

С: однократная доза Ab к BMP6 человека при одном уровне дозы выше минимальной PAD, определяемой в части 1.

Сопутствующее лечение

Все рецептурные лекарственные препараты, отпускаемые без рецепта лекарственные средства и значительные виды немедикаментозной терапии (в том числе физическая терапия и переливание крови), вводимые или принимаемые в течение периода времени, определяемого в критериях включения в исследовании перед началом исследования и во время исследования, должны фиксироваться в соответствующем разделе CRF "Сопутствующие препараты/Значительные виды немедикаментозной терапии". Ввод лекарственных препаратов должен быть специфичным в отношении торговой марки, однократной дозы и формы, частоты и пути введения, даты начала и прекращения приема и причины лечения.

Эффективность/фармакодинамика

Оценки эффективности определены ниже. Образцы для оценок эффективности будут собирать в различные временные точки. Будут определять гематологические лабораторные показатели. Показатели Hgb и Fe будут изучаться во время каждого неформального промежуточного анализа между когортами в виде части оценки коррекции дозы во время части 1 исследования. Если временные точки для сбора анализов, установленные изначально, признаются субоптимальными для понимания связи между содержанием железа и PK, то временные точки для сбора образцов могут быть изменены в последующих когортах в части 1.

Панель показателей железа

Предполагается, что Ab к BMP6 человека, мобилизует Fe, полученное из запасов организма, приводя к изменениям параметров Fe в сыворотке крови, в том числе: уровня Fe в сыворотке крови, насыщения трансферрина (TSAT), способности к связыванию несвязанного Fe (UIBC), общей способности к связыванию Fe (TIBC), уровня ферритина и содержания гемоглобина в ретикулоцитах (CHr). Их будут измерять в сыворотке крови с помощью валидированных анализов.

Безопасность

Оценки безопасности определены ниже.

Физическое обследование

Полное физическое обследование будет включать исследование общего внешнего вида, кожи, шеи (в том числе щитовидной железы), глаз, ушей, носа, горла, легких, сердца, живота, спины, лимфатических узлов, конечностей, сосудистой и неврологической системы. При необходимости, на основании медицинского анамнеза и/или симптомов, могут осуществляться исследования прямой кишки, наружных половых органов, молочной железы и/или таза.

Важные результаты, которые присутствуют до начала исследования, должны быть включены в скрининг "Соответствующий медицинский анамнез/текущие медицинские состояния" в eCRF пациента. Важные результаты, полученные после начала применения исследуемого лекарственного средства, которые соответствуют критериям определения "нежелательное явление", должны быть записаны в скрининге "Нежелательные явления" в eCRF пациента.

Показатели жизнедеятельности

Температура тела

Кровяное давление (BP)

Пульс

Рост и вес

Рост

Вес тела

Индекс массы тела (BMI) будет рассчитываться в виде (вес тела (кг)/[рост (м)]2).

Оценки лабораторных показателей

Клинически значимые отклонения результатов лабораторных тестов будут оценивать в отношении критериев, определяющих нежелательное явление, и сообщать как таковое в случае, если они соответствуют критериям. Повторные оценки являются обязательными до тех пор, пока не произойдет нормализация результата(-ов) или до тех пор пока изменение больше не будет клинически значимым.

Общий анализ крови

Будут измерять содержание гемоглобина, гематокрит, количество эритроцитов, количество лейкоцитов с лейкоцитарной формулой и содержание тромбоцитов. Будут контролировать показатели железа.

Клинический биохимический анализ крови

Будут контролировать содержание натрия, калия, креатинина, мочевины, хлорида, альбумина, кальция, щелочной фосфатазы, общего билирубина, LDH, GGT, AST и ALT. Если концентрация общего билирубина повышается выше чем в 1,5 раза от верхнего предела нормы, то необходимо проводить дифференциацию между прямым и непрямым билирубином.

Электрокардиограмма (ECG)

Будут измерять PR-интервал, длительность QRS, частоту сердечных сокращений, RR, QT, QTc.

Для принятия клинических решений необходимо использовать формулу Фридерика для коррекции QT (QTcF).

Беременность и оценки фертильности

Тесты на беременность требуются для всех пациентов женского пола вне зависимости от заявленного репродуктивного/менопаузального статуса.

В данном исследовании будут выполнять тесты на беременности на основании сыворотки крови. В случае положительного результата пациент должен досрочно завершить исследование.

При выполнении при скрининге или на исходном уровне результат этого теста должен быть получен до того, как пациент может получить дозу.

Фармакокинетика

Будут собирать PK образцы. РК данные будут изучаться во время каждого неформального промежуточного анализа между когортами в виде части оценки коррекции дозы во время части 1 исследования. Если временные точки для сбора анализов, установленные изначально, признаются недостаточными или неподходящими для понимания характеристики PK профиля, то временные точки для сбора образцов могут быть изменены в последующих когортах. Количество заборов крови и общий объем собранной крови не будут превосходить таковые, указанные в протоколе.

PK образцы будут собирать и оценивать при всех уровнях дозы у всех пациентов.

Концентрацию свободного Ab к BMP6 будут определять с помощью ELISA-анализа. Предполагаемый нижний предел количественного определения (LLOQ) составляет 10 пг/мл.

Не подвергнутые воздействию (плацебо) образцы не будут анализировать.

Концентрации свободного Ab к BMP6 будут выражаться в мкг/мл. Все концентрации ниже LLOQ или пропущенные данные будут помечены как таковые в перечнях данных по концентрации. Концентрации ниже LLOQ будут обрабатываться как нулевое значение в обобщенном статистическом анализе в случае только данных по концентрации. Их не будут учитывать при расчете PK параметров.

PK образцы, оставшиеся после определения свободного Ab к BMP6 человека, могут быть использованы для исследовательских оценок или других биоаналитических целей (например, перекрестной проверки между различными исследовательскими центрами, оценки стабильности).

Следующие фармакокинетические параметры будут определены (при возможности) с помощью некомпартментного(-ых) способа(-ов) с использованием Phoenix WinNonlin (версия 6.2 или выше): Cmax, tmax, AUC(0-t), AUC(0-tlast), Cmax/D и AUC/D на основе данных зависимости концентрации в сыворотке крови от времени. Для расчетов AUC будут использовать линейное правило трапеций. Конечный период полужизни антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые связывают BMP6 человека (t1/2), также будут оценивать, при возможности, на основании этих данных.

Другие оценки

Иммуногенность

Для выявления антител к BMP6 будут использовать ELISA. Образцы IG, оставшиеся после анализа иммуногенности, могут быть использованы для исследовательской оценки или других биоаналитических целей (например, перекрестной проверки между различными исследовательскими центрами).

Исследовательские оценки

Биомаркеры представляют собой объективно измеряемые и оцениваемые показатели нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство (Biomarkers Definitions Working Group 2001).

BMP6-гепсидиновый путь является следующим. Передача сигнала с помощью BMP6 в гепатоцитах требуется для индуцированной экспрессии гепсидина, подавления поглощения железа энтероцитами и экспорта железа макрофагами. Нейтрализующее BMP6 антитело в качестве терапии, понижающей содержание гепсидина, должно быть эффективным у пациентов с анемией, обусловленной нехваткой железа, в результате снижения требования к EPO и повышения количества пациентов, которые достигают целевого уровня Hgb.

На основании описанного выше биологического механизма исследовательские оценки биомаркеров включают без ограничения содержание гепсидина (измерение с помощью LC-MS-анализа).

Дополнительные исследовательские оценки могут изучать потенциальные роли маркеров диминерализации кости, а также реагировать на воспаление как фактор, содействующий механизму действия.

Исследовательские цели являются следующими:

определение связей между уровнями гепсидина и несколькими ключевыми показателями, такими как ERI и показатели железа;

изучение динамики между первичными и вторичными конечными точками и исследовательскими биомаркерами в течение длительного времени;

определение фармакогенетики;

определение иммуногенности.

Образец(-цы) будут собирать в различные временные точки.

Дополнительные подробности касательно сбора, нумерации, обработки и отправки образцов будут предоставлены в руководстве для центральной лаборатории.

ДНК

Научные исследования ДНК планируются как часть данного исследования в целях выявления генетических факторов, которые могут (1) быть связаны с пациентами, получающими лечение эритропоэтином, находящимися на хроническом гемодиализе, с анемией, обусловленной функциональным дефицитом железа, (2) прогнозировать ответ на лечение Ab к BMP6 человека или (3) прогнозировать генетическую предрасположенность к побочным эффектам.

Помимо этого, последние достижения в технологиях генотипирования сделали полногеномные подходы возможными. Полногеномные подходы также можно осуществлять в пределах ограниченного объема данных исследований, как описано выше.

Растворимые биомаркеры

Гепсидин будут количественно определять в плазме крови в качестве потенциального PD/биомаркера.

Подробные описания анализов будут включены в отчеты по биоаналитическим данным.

Другие биомаркеры

Платформы с отсутствием гипотез можно использовать для понимания гетерогенности заболеваний, способа действия и/или потенциального выявления маркеров стратификации. Образцы для изучения иммуногенности (IG) будут собирать в различные временные точки. Иммуногенность Ab к BMP6 человека будут определять с помощью измерения антител, распознающих антитело к BMP6 человека.

Список литературы

Fukuma S, Yamaguchi T, Hashimoto S et al (2012) Erythropoiesis-stimulating agent responsiveness and mortality in hemodialysis patients: results from a cohort study from the dialysis registry in Japan. Am J Kidney Dis; 59(1): p. 108-16.

Kilpatrick RD, Critchlow CW, Fishbane S et al (2008) Greater epoetin alfa responsiveness is associated with improved survival in hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol; 2008. 3(4):1077-83.

Lopez-Gomez JM, Portoles JM, and Aljama P (2008), Factors that condition the response to erythropoietin in patients on hemodialysis and their relation to mortality. Kidney Int Suppl; (111):S75-81.

Meynard D, Kautz L, Darnaud V et al (2009) Lack of the bone morphogenetic protein BMP6 induces massive iron overload. Nat Genet; 41(4):478-81.

Saliem S, Patenaude V, Abenhaim HA (2015) Pregnancy outcomes among renal transplant recipients and patients with end-stage renal disease on dialysis. J Perinat Med (электронная публикация перед печатью) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25719292.

Suttorp MM, Hoekstra T, Rotmans JI et al (2013) Erythropoiesis-stimulating agent resistance and mortality in hemodialysis and peritoneal dialysis patients. BMC Nephrol; 14(1):200.

Zaritsky J, Young B, Gales B, et al (2010) Reduction of serum hepcidin by hemodialysis in pediatric and adult patients. Clin J Am Soc Nephrol; 5(6):1010-14.

ПРИМЕР 3. Уровни TSAT для пациентов, получавших лечение в виде 0,01 мг/кг антитела 7

Данные, включающие уровни TSAT (насыщения железом, %) оценивали для первых 10 пациентов, получавших лечение в соответствии с клиническим протоколом, описанным в примере 2, при этом каждый пациент получал однократную инфузию 0,01 мг/кг антитела 7. Ни у кого из пациентов не проявлялись какие-либо сигналы по безопасности со стороны печени, что определяло уровень, не вызывающий наблюдаемых нежелательных явлений (NOAEL), равный 0,1 мг/кг/неделя. Когорта 1 включала 5 пациентов с анемией, находящихся на гемодиализе, с низкими уровнями ферритина, равными 500 нг/мл или меньше, в то время как когорта 2 включала 5 пациентов с анемией, находящихся на гемодиализе, с более высокими уровнями ферритина (от 500 до 1000 нг/мл).

У пяти пациентов когорты 1 (низкий уровень ферритина), которые получали 0,01 мг/кг антитела 7, уровни TSAT после введения дозы повышались в среднем лишь на 9,8% (среднее 38,6% после введения дозы по сравнению с 24,8% до введения дозы). В отличие от этого, уровни TSAT после введения дозы повышались в среднем на 17,6% (среднее 48,4% после введения дозы по сравнению с 30,8% до введения дозы) у пяти пациентов когорты 2 (высокий уровень ферритина), которые получали 0,01 мг/кг антитела 7. Данные представлены на фигуре 14, на которой показаны пиковые уровни TSAT до введения антитела 7 по сравнению с 72 часами после введения антитела 7 в 2 когортах. Неожиданным образом, в отличие от пациентов когорты 1, пациенты с анемией из когорты 2 демонстрировали отчетливое повышение TSAT по сравнению с исходным уровнем. Эти данные указывают на то, что пациенты с уровнями ферритина, равными 500 нг/мл или больше, представляли собой подходящих кандидатов для ответа на терапию антителами к BMP6, и что уровень ферритина, например, уровень ферритина, равный 500 нг/мл или больше, может быть показателем ответа.

Если не определено иное, технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Если не указано иное, все способы, стадии, методики и манипуляции, которые конкретно не описаны подробно, можно осуществлять и осуществляли способом, известным самим по себе, как будет ясно специалисту в данной области техники. Например, отсылку повторно делают на стандартные руководства и общий уровень техники, упоминаемый в данном документе, и на дополнительные источники литературы, цитируемые в данном документе. Если не указано иное, каждый из источников литературы, цитируемых в данном документе, включен в своей полноте посредством ссылки.

Пункты формулы изобретения являются неограничивающими и представлены ниже.

Несмотря на то, что определенные аспекты и пункты формулы изобретения были подробно раскрыты в данном документе, это было выполнено в качестве примера лишь в целях иллюстрации, и не предназначено для ограничения по отношению к объему прилагаемой формулы изобретения или объему объекта формулы изобретения с любым соответствующим дальнейшим применением. В частности, авторами настоящего изобретения предполагается, что различные замены, изменения и модификации могут быть выполнены по отношению к настоящему изобретению без отклонения от сути и объема настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Считается, что выбор исходного материала в виде нуклеиновой кислоты, клона, представляющего интерес, или типа библиотеки, является привычным вопросом для специалиста в данной области техники со знанием аспектов, описанных в данном документе. Считается, что другие аспекты, преимущества и модификации, находятся в пределах объема следующей формулы изобретения. Специалистам в данной области техники будут понятны многие эквиваленты конкретных аспектов настоящего изобретения, описанного в данном документе, или с помощью проведения только лишь обычных экспериментов они будут способны установить такие эквиваленты. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения. Изменение объема пункта формулы изобретения в позднее поданных соответствующих заявках может быть связано с ограничениями патентных законов различных стран и не должна пониматься как отказ от объекта формулы изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NOVARTIS AG

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНГИБИТОРОВ КОСТНОГО

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО БЕЛКА 6 (BMP6)

<130> PAT057354-WO-PCT

<140>

<141>

<150> 62/350,257

<151> 2016-06-15

<160> 99

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 1

Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 2

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp

<210> 3

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 3

Gln Gly Ile Trp Gly Thr Pro Leu Thr

<210> 4

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ile Trp Gly Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ile Trp Gly Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 6

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 6

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala Met His

1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 7

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 8

Arg Pro Phe Gly Asn Ala Met Asp Ile

<210> 9

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 9

Ser Tyr Val Val His

<210> 10

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 10

Arg Ile Lys Asp His Lys Gln Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 11

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 11

Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 12

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 13

Lys Asp His Lys Gln Gly Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 14

Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Asp His Lys Gln Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 16

caggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg cctccggatt caccttttct tcttacgttg ttcattgggt gcgccaggcc 120

ccgggcaaag gtctcgagtg ggtgggccgt atcaaagacc acaaacaggg ctacactact 180

gcttatgccg cctctgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt 300

gttgaacgtt ctaaatctgg tttcgataac tggggccaag gcaccctggt gactgttagc 360

tca 363

<210> 17

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Asp His Lys Gln Gly Tyr Thr Thr Ala Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 18

<211> 1353

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 18

caggtgcaat tggtggaaag cggcggtggc ctggtgaaac caggcggcag cctgcgcctg 60

agctgcgccg cctccggatt caccttttct tcttacgttg ttcattgggt gcgccaggcc 120

ccgggcaaag gtctcgagtg ggtgggccgt atcaaagacc acaaacaggg ctacactact 180

gcttatgccg cctctgtgaa aggccgcttt accattagcc gcgatgattc gaaaaacacc 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaagatacgg ccgtgtatta ttgcgcgcgt 300

gttgaacgtt ctaaatctgg tttcgataac tggggccaag gcaccctggt gactgttagc 360

tcagcctcca ccaagggtcc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900

aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1080

gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353

<210> 19

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 19

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Val His

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 20

Gly Ser Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 21

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 21

Gln Ser Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val Val

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 22

Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser

1 5 10

<210> 23

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 23

Gly Ser Ser

<210> 24

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 24

Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val

1 5

<210> 25

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 25

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser

85 90 95

Gln Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 26

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 26

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt 60

agctgtaccg gcagcagcag caacattggt gctggttact ctgtgcattg gtaccagcag 120

ctgccgggca cggcgccgaa actgctgatc tatggtagct ctgaacgccc gagcggcgtg 180

ccggatcgct ttagcggatc caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggcctg 240

caagcagaag acgaagcgga ttattactgc cagtcttggg actcttctca gactctggtt 300

gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtc cta 333

<210> 27

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 27

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Ser Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser

85 90 95

Gln Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 28

<211> 651

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 28

cagagcgtgc tgacccagcc gccgagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt 60

agctgtaccg gcagcagcag caacattggt gctggttact ctgtgcattg gtaccagcag 120

ctgccgggca cggcgccgaa actgctgatc tatggtagct ctgaacgccc gagcggcgtg 180

ccggatcgct ttagcggatc caaaagcggc accagcgcca gcctggcgat taccggcctg 240

caagcagaag acgaagcgga ttattactgc cagtcttggg actcttctca gactctggtt 300

gtgtttggcg gcggcacgaa gttaaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540

agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651

<210> 29

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 29

Ser Tyr Val Val His

1 5

<210> 30

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 30

Arg Ile Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Met Tyr Ala Ala Pro

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 31

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 31

Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 32

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 32

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 33

Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 34

Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 35

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Met Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 36

caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga ctggtcaagc ctggcggtag cctgagactg 60

agctgcgctg ctagtggctt caccttctct agctacgtgg tgcactgggt cagacaggcc 120

cctggtaaag gcctggagtg ggtcggacgg attaagagag agtcctctag ctacactact 180

atgtacgccg ctcccgtgaa gggccggttc actatctcta gggacgactc taagaacacc 240

ctgtacctgc agatgaatag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtctacta ctgcgctaga 300

gtggaacggt ctaagtcagg cttcgataac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgtct 360

agc 363

<210> 37

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Arg Glu Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Met Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 38

<211> 1353

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 38

caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga ctggtcaagc ctggcggtag cctgagactg 60

agctgcgctg ctagtggctt caccttctct agctacgtgg tgcactgggt cagacaggcc 120

cctggtaaag gcctggagtg ggtcggacgg attaagagag agtcctctag ctacactact 180

atgtacgccg ctcccgtgaa gggccggttc actatctcta gggacgactc taagaacacc 240

ctgtacctgc agatgaatag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtctacta ctgcgctaga 300

gtggaacggt ctaagtcagg cttcgataac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgtct 360

agcgctagca ctaagggccc aagtgtgttt cccctggccc ccagcagcaa gtctacttcc 420

ggcggaactg ctgccctggg ttgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480

tcctggaact ctggggctct gacttccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540

agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccct ccagctctct gggaacccag 600

acctatatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660

cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc cagctccaga actgctggga 720

gggccttccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780

cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900

aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960

aaagaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgccag ccccaatcga aaagacaatc 1020

agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080

gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgat 1140

atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200

gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260

tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320

acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353

<210> 39

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 39

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Val His

1 5 10

<210> 40

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 40

Gly Gln Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 41

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

<400> 41

Gln Ser Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val Val

1 5 10

<210> 42

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 42

Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ser

1 5 10

<210> 43

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 43

Gly Gln Ser

<210> 44

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 44

Trp Asp Ser Ser Gln Thr Leu Val

1 5

<210> 45

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 45

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Gln Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser

85 90 95

Gln Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 46

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 46

cagtcagtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60

agctgcaccg gctctagctc taatatcggc gctggctata gcgtgcactg gtatcagcag 120

ctgcccggca ccgcccctaa gctgctgatc tacggtcagt cagagcggcc tagcggcgtg 180

cccgataggt ttagcggctc taagtcaggc actagcgcta gtctggctat caccggcctg 240

caggctgagg acgaggccga ctactactgt cagtcctggg actctagtca gaccctggtg 300

gtgttcggcg gaggcactaa gctgaccgtg ctg 333

<210> 47

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 47

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Gln Ser Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Ser Ser

85 90 95

Gln Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 48

<211> 651

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 48

cagtcagtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60

agctgcaccg gctctagctc taatatcggc gctggctata gcgtgcactg gtatcagcag 120

ctgcccggca ccgcccctaa gctgctgatc tacggtcagt cagagcggcc tagcggcgtg 180

cccgataggt ttagcggctc taagtcaggc actagcgcta gtctggctat caccggcctg 240

caggctgagg acgaggccga ctactactgt cagtcctggg actctagtca gaccctggtg 300

gtgttcggcg gaggcactaa gctgaccgtg ctgggtcagc ctaaggctgc ccccagcgtg 360

accctgttcc cccccagcag cgaggagctg caggccaaca aggccaccct ggtgtgcctg 420

atcagcgact tctacccagg cgccgtgacc gtggcctgga aggccgacag cagccccgtg 480

aaggccggcg tggagaccac cacccccagc aagcagagca acaacaagta cgccgccagc 540

agctacctga gcctgacccc cgagcagtgg aagagccaca ggtcctacag ctgccaggtg 600

acccacgagg gcagcaccgt ggaaaagacc gtggccccaa ccgagtgcag c 651

<210> 49

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 49

Ser Tyr Val Val His

1 5

<210> 50

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 50

Arg Thr Arg His Ser Asp Met Gly Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Ala Pro

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 51

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 51

Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 52

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 52

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 53

Arg His Ser Asp Met Gly Tyr Ala

1 5

<210> 54

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид"

<400> 54

Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn

1 5 10

<210> 55

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Thr Arg His Ser Asp Met Gly Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 56

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 56

caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga ctggtcaagc ctggcggtag cctgagactg 60

agctgcgctg ctagtggctt caccttctct agctacgtgg tgcactgggt cagacaggcc 120

cctggtaaag gcctggagtg ggtcggacgg actagacact cagatatggg ctacgctact 180

agctacgccg ctcccgtgaa gggccggttc actatctcta gggacgactc taagaacacc 240

ctgtacctgc agatgaatag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtctacta ctgcgctaga 300

gtggaacggt ctaagtcagg cttcgataac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgtct 360

agc 363

<210> 57

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид"

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Thr Arg His Ser Asp Met Gly Tyr Ala Thr Ser Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Val Glu Arg Ser Lys Ser Gly Phe Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 58

<211> 1353

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид"

<400> 58