Способ определения хиноксидоредуктазной активности

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОЬРИтИНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (11) 552556

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 09.09,74 (21) 2059451/13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 30.03.77. Бюллетень № 12

Дата опубликования описания 07.04.77 (51) М. Кл. G Ol N 33/16

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 577.15(088.8) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Е. Ф. Лунец, Э, П. Титовец и Г. Г. Петровский

Белорусский научно-исследовательский институт неврологии, нейрохирургии и физиотерапии (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗНОЙ

АКТИВНОСТИ

Изооретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и патофизиологических исследованиях обменных процессов во всех тканях и жидкостях человека.

Известен способ определения НАД (Ф) Н никотинамид аденин динуклеотид фосфат восстановленный хинон-оксидоредуктазной активности, основанный па регистрации убыли

НАДН Н+ нли НАДФН Н+ в среде инкубации фермента путем измерения оптической плотности при длине волны 340 нм, или по восстановлению 2,6-дихлорфенолиндофенола— измерение поглощения света с длиной волны

600 нм.

Однако известный способ нельзя применять, если исследуемые препараты поглощают свет в той we области спектра, что и применяемые субстраты, или сильно рассеивают свет (мутвые образцы). Кроме того, при использовании этого способа нельзя проводить определение

НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности в тех объектах, в которых наряду с определяемой активностью присутствуют и другие ферменты, взаимодействующие с пиридиннуклеотидами.

С целью расширения диапазона исследуемых объектов в качестве субстрата используют 4-аннлин — 5 - метокси — 1,2 - бензохинон (АМОБХ) и проводят полярографическое определение количества кислорода, подошедшего на окисление восстановленной формы этого хинона.

Способ определения НАД(Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности заключается в том, что определение проводят при комнатной температуре в закрытой полярографической ячейке, в которую последовательно помещают среду инкубации (солевой буфер) рН 7,5, НАД (Ф) Н. Н+ (400 мкМ), АМОБХ (150 мкМ), дезоксихолат (1500 мкМ), цианид (2000мкМ), после чего в ячейку добавляют исследуемый материал.

При наличии в исследуемом материале

НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности в среде, содержащей все требуемые по предлагаемому способу компоненты, начинаются реакции, протекающие в такой последовательности:

НАД (Ф) Н Н++АМОБХ=

=НАД(Ф)+АМОБХ Н (1)

АМ О БХ Н + 0,50 — АМО БХ+ Н20 (2)

Уменьшение концентрации кислорода вследствие использования его на окисление

АМОБХ. Н> (реакция 2), который появляется в среде в результате НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности исследуемого материала (реакцня 1), измеряется полярографи30 чески.

552556

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор М. Дмитриева Текред А. Камышникова Корректор Л. Орлова

Заказ 685/13 Изд. Мв 310 Тираж 1054 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

На прилагаемой полярограмме изображена типичная кривая, отражающая изменение концентрации кислорода в среде инкубацип исследуемого материала, обладающего

HAgI(Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активностью, где М вЂ” добавление исследуемого материала.

По полярограмме рассчитывают максимальные скорости потребления кислорода в среде, которые равны тангенсам углов наклона касательных к кривым в точках с максимальными скоростями. Согласно представленной последовательности протекающих в ячейке реакций стехиометрические соотношения НАД(Ф) Н.

° Н+; АМОБХ; О равны 1: 1: 1. Следовательно, скорость потребления кислорода в системе будет количественно отражать величину

НАД (Ф) Н: хинон-оксидоредуктазной активности исследуемого материала, которая может быть выражена в единицах: мк атом кислорода

7 сек г белка или с учетом стехио метр ии компонентов мк моль НАД(Ф)Н Н+ сек г белка

Если исследуемый материал представляет собой гомогенную систему, то определение проводят без добавления в среду дезоксихолата.

Если исследуемый объект не обладает свойством поглощать кислород в результате собственного дыхания, то определЕние

1-1АД(Ф)Н: хинон-оксидоредуктазной активности проводят без добавления в среду цианида.

В качестве среды может быть использован любой солевой буфер изотонической llëè близкой к изотонической концентрации (предпочтительно использовать фосфатный буфер в концентрации 1/15 М). рН буфера может варьировать и пределах

5,5 — 8,5 ед. (оптимальная величина 7,5).

Предлагаемый способ позволяет определить

НАД(Ф) Н: хинон-оксидоредуктазную активность в образцах с различными спектральными характеристиками, в сильно рассеивающих свет или полностью непрозрачных объектах, в присутствии различных ферментативных активностей, окпсляющих или восстанавливающих пириди нуклеотиды, независимо от по20 бочных неферментативных реакций, в которые вовлекаются применяемые субстраты.

25 Способ определения хинон-оксидоредуктазной активности, заключающийся в определении концентрации субстрата, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью расширения диапазона исследуемых объектов, в качестве субстрата

30 используют 4-анилин - 5 - метокси-1,2 - бензохинон и проводят полярографическое определение количества кислорода, пошедшего на окисление восстановленной формы этого хинона.