Способ очистки водных растворов соединений инсулина с щелочным металлом или аммонием

 

О П Н-С А Н -И- Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических республик (11) 598545 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 06,02,75(21) 2105543/04 (51) М. Кл.и

А 61 К 37/26 (23) Приоритет (32) Гасударственный иамитет

Саввта . Министров СССР ае делам иаобрвтений н атиритий (31) (33) . (43) Опубликовано 15,03,78.Бюллетень рй 10 (53) УДК 547.964.4 ,07(088.8) (45} Дата опубликования описания 28.02.78

Иностранец

Ричард Ли Джексон (США) (72) Автор изобретении

Иностранная фирма

Эли Лилля энд Компани (США}. (71) Заявитель

1Е Для улучшения качества и увеличения выхода инсулина по предлагаемому способу набухший гель, поглощающий в сухом состоянии 4>S-б,б вес. % воды, с диаметром частиц 20 - 80 мкм помешают в колонку в качестве насадки, вводят в колонку с ге лем водный раствор комплекса инсулина с щелочным металлом или аммонием, чистота которого составляет 80%, с концентрацией инсулина 1-8 вес Ъ sa l объем и общим ро количеством инсулина 0,8-6,7 г/л насадки при рН раствора 2,0-3,5 элюируют инсулин водным элюентом, подкисленным той же кислотой, в которой растворен инсулин, и имеющим рН в том же интервале, что и раствор инсулина. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ

СОЕДИНЕНИЙ ИНСУЛИНА С ЩЕЛОЧНЫМ МЕТАЛЛОМ

ИЛИ АММОНИЕМ

1 2

Изобретение относится к улучшенному путем гель-филвграции через сефадекс способу очистки, инсулина - препарата, ко- g -50 f i п е, заполняющий шестисекдиои торый нашел применение в медицине для . ную колонку, Элюирование инсулина проволечения сахарного диабета. дят 0,1М соляной кислотой при комнатной

Йрименяемые в промышленности способы а температуре $4). очистки инсулина включают в себя такие Однако описанный способ очистки инсуоперации, как осаждение при изоэлектричес- лина не позволяет получить препарат трекой точке неинсулиновых белков, содержа- буемой чистоты. щихся в водном экстракте поджелудочной же лезы, дифференцированное высаливание инсу лина из экстракта хлористым натрием 11, осаждение или кристаллизация инсулина из растворов в виде комплекса с цинком(21.

Однако, как выяснилось в последние годы, извлеченный таким образом инсулин содержит в незначительных количествах белки неинсулинового характера (проинсулин и проинсулиновый белок), которые имеют антигенный и имунногенный характер 1 3 1, Для более полного отделения неинсулиновых компонентов от препаратов инсулина было предложено использовать гель-фильтрацию.

Так, известен способ очистки водного раствора инсулина с концентрацией 6,5 %, 598545

Как предпочтительный вариант в качестве геля используют поперечносшитый декстран, загрузка колонки составляет 3,55,0 г инсулина ga 1 л носителя; .обычно инсулин растворяют в 0,5 н.уксусной кислоте и рН устанавливают разбавленной соляной кислотой, элюент содержит 0,5 н.уксусную кислоту.

Пример l. Гель поперечносшитого декстрана, поглошающего 5% воды и имеющего частицы размером 20-80 мкм, уравновешивают в 0,5 М уксусной кислоте, В лабораторную колонну К100(100/Фармациа Файн Кемикалс) с внутренним диаметром, 10 см и длиной 100 см помещают набухший гель объемом слоя равным 7 л (глубина слоя 89 см), Натрий-инсулин (из бычьей поджелудочной железы) (17,5г),, обладаюший активностью, равной 23,8 ед/мг и содержащий 4,21 вес. % проинсулина, раство- 2О ряют в., 400 мл 0,5 н. уксусной кислоты.

Раствор пропускают через колонну и элюируют 0,5 н. уксусной кислотой при давлении 0,35 кг/см .

Скорость потока — 900 мл/ч (линейная

25 скорость 0,19 мл/см ° мин). После элюиро2 вания пустотного объема (1725 мл) отбирают фракции по 23,5 мл каждая, Содержаwe протеина определяют, измеряя ультрафиолетовую, адсорбцию при 280 нм. Опредезо ляют также содержание твердых веществ в мгlмл. Собиоают всего 240 фракций, которые делят на 4 группы. Данные результатов приведены в табл, l. .К группе С добавляют 3,0 мл 20%-ного раствора хлористого пинка и полученный раствор разбавляют до 3О25 мл 0,5 н,раствором гидроокиси аммония. Устанавливают рН 6,0 конечного раствора разбавленным раствором гидроокиси аммония, Выпав40 ший.в осадок цинкинсулин отделяют центрифугированием, промывают последовательно водой, абсолютным спиртом и эфиром и сушат в вакууме. Выход цинкинсулина 13,9 г; потенция инсулина - 25,6 ед/мг, содержа45 ние проинсулина 0,44%, Поскольку группа С содержала 86,4% общего количества .элюированных твердых вешеств максимальный выход твердых веI

50 шеств из группы С 86,4% 17,5 г или

15,1 г, В пересчете ga единицы максимальный выход был равен примерно 360000ед.

Таким образом, выход цинкинсулина из груп. пы С соответствует 91,9% по весу и 98,9% в пересчете на единицы. В пересчете на исходный продукт выход по весу и в пересчете на единицы/мг:был равен 79,4и85,4%соответственно.

Группу В-2 осаждают избытком ионов. цинка, как описано выше цля группы С, осадок перерастворяют в 0,5 М уксусной кислоте и снова фильтруют через колонку меньшего размера. Выделенный инсулин церекристаллнзовывают, как.рписано для группы С, получают дополнительно 1,0 г цинкинсулина, имеюшего потенцию, соот« ветствуюшую 26,7 ед,/мг. Таким образом, общий выход цинкинсулина s пеоесчете на исходный продукт был равен 85,1% по весу и в пересчете на единицы 91,8%.

На чертеже приведена диаграмма элюирь» вания, которая имеет форму кривой зависимости оптической плотности при 280 мкм разных фракций от количества фракций. Диаграмма показывает содержание протеина во фракциях, отобранных во время элюирования.

Отдельные фракции, собранные в несколько групп, описанных в примере 1, показаны пунктирными вертикальными линиями. Из диаграммы видно, что исходный продукт со стоял в основном из инсулина и что инсулиновый компонент эффективно отделен от проинсулина и подобных протеинов.

Пример 2. Опыт проврдят по примеру 1, но вместо бычьего берут 30 г сви» ного натрий-инсулина и количество 0,5 М уксусной кислоты, в которой растворяют инсулин, увеличивают до 600 мл, Свиной . натрий-инсулин".4меет потенцию 23,3 ед/мг и содержит 2,42 вес.% проинсулина. Данные, результатов приведены в табл. 2, Из группы С получают 26,5 г цинкинсу . лина, имеющего потенцию, соответствуюшую

25,3 ед./мг, и содержащего 0,57% проинсулина, Таким образом, выход цинкинсулина соответствует выделению 98,1% по весу или 95,9%, в пересчете на единицы.

Ыинкинсулин, приготовленный из той же партии поджелудочной железы, способом, при котором шелочная кристаллизация и филжрование через гель заменены обычным нзоэлектрическнм осаждением из водного и водно-спиртового раствора, получают с та» ким же выходом на 1 единицу поджелудочной железы. Однако потенция инсулина со» ответствует 24,3 ед/мгпи продукт содержич

3, 18% проинсулина.

$98545

Табли ца 1

Высокомолекулярные протеины и энзимы

1,4

l0-6 9

1405

2,4

Главным образом проинсулин

70-1 19

1193

В-1

1 20-160

9,7

978

В-2

Инсулин

161-225

86,4

1520

Таблица 2

l,3

10-60

70-119

120-154

1200

2,7

В-1

820

В-2

6,0

90,0

155-235

1920

Формула изобретения с

1. Способ очистки водных растворов соединений инсулина с щелочным металлом или аммонием с помощью гель-фильтрации указанного раствора и алюированием кислым раствором, включающим соляную кислоту, при комнатной температуре, о т л и ч а ющ н и с я тем, что, с целью повышения степени очистки и устранения потерь продукта, используют набухший гель, поглошающий в сухом состоянии 4,5-5,5 вес. %. воды, с диаметром частиц 20-80: мкм, который помешают в качестве насадки в колонПромежуточные продукты проинсулина и инсулина ху, в последнюю добавляют укаэанный ра,створ соединений инсулина, с чистотой 80%, концентрацией инсулина 1-8 вес.% на 1 объем, общим количеством инсулина 0,8-6,7 г/л слоя геля и рН 2,0-3,5, и проводят элюиро ванне водым злюентом, подкисленным той же кислотой, в которой растворен инсулин, и имеющим рН, соответствующий значению рН раствора инсулина.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю m и йс я тем, что в качестве геля используют поперечносшитый декстран.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю m и йс я тем, что общее количество инсулина со598545 ставляет 3,5«5,0 г инсулина на 1 л слоя геля.

4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют раствор инсулина в 0„5 М уксусной кислоте и рН этого раст5 вора устанавливают разбавленной соляной:Р кислотой.

1б

Составитель В. Волкова

Техред О. Луговая КорректоР A Лакнда

Редактор Л, Емельянова

Заказ 1289/52 Тираж 703 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент",:r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5. Сп,особ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют элюент содержащийся

0,5 н.уксусную кислоту.

Источники информапии, принятые во внимание при экспертизе:

l. Патент США l4 2449086, кл. 260-112.7, 1948.

2. -Патент США N 2626228, кл, 260-112,7, 1953, ЗЛ.E.СИаисе, R.Ì.Е_#_ie, Ф.Ф.Вгоняла, oscine Р о пьцГ п: Сла ас1еилаЬои .аао Ам но Acid Sequence,&ñèìàå.,МЯ .166 (1968)

4;4.СЛаиьои, CDEumrt 1оi Levee-Sca

Ee gef Г И аЬон or> Porous фвРэ-VràñЙоиа6он о1 Ма1е seed Pro

3 ьибн,У.АЯ .Гаос1 Caew.,ЖТ4 19 (4) . р.585..