Способ получения антибиотика 3(n-4-аминобутил)- аминопропиламиноблеомицина (блеомицина а5)

 

Союз Сааетсиии

Сбщваяистических

Реснфлин к ПАтВКУУ (61) Дополнительный к патенту (22) 3аявлено 13.02.70(Я) 1403688/28-13 (51) М. Кл .

С 07 6 11/00 (23) Приоритет - (33) . 15.02,69

Гасудерстееииый комитет

Сввете Миииетреа Сыр ее делим изееретеиий и еткрытий (31) 10774/69 (ЗЗ) Япония (43} Опубликовано25.03. 76,бюлщтень Юе 11 (53) УДК

61 5. 779. 931 (оеа.a) (45) Дата опубликования описания 07.05,76

Иностранцы

Хамво Умезввв, Кендзи Мведв, Томохисв Твкита, Ууя Нвквямв, Акио Фудзии, Нобууоси Симвдв и Хидео Чимурв (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

«Звйдвн Ходзин Бисейбупу Квгвку Кенкю Кай"

; Япония)" (71) Заявитель

{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА 3-(М 4-АМИНОБУТИЛ)-АМИНОПРОПИЛАМИНО-БЛЕОМИЦИНА (БЛЕОМИЦИНА А5) Изобретение относится к ферманевтичес кой промышленности.

Известен способ нситччения антибиотика блеомииинв А путем культивирования про дуценте ЬВфЬ Фиуесб 44 ga nu твтельной среде, содержащей источники азота, углерода. минеральных солей, целевой продукт выделяют известными приемами.

Однако таким способом получали незна= чительные количества антибиотика в смеси с другими блеомипинамн.

С целью повышения выхода целевого. продукта. выращивание осуществляют s apir eymvsam 3-(Й -4-вминобутил)-вминопропилвминв или Я,M -бис (3-вминопропил)-1.4дивминобутвнв, П р н м е р 3 К среде, состоящей{в

%) нз 6,4 просяного желе; 0,5 глюкозы, 3,5 порошка соевых бобов, 0,75 крепкого отвара кукурузы, 0,3 хлористого натрия, О, 1 вторичного фосфвта калия, О;05 сульфата цинка, 0,01 сульфата меди, 0,2 нич . рвчв натрия н 0,01 Тойо % 1 {торговое наименование поверхностно активного вген

2 та), прибавляют Al Ж -бис-(3-амннопропил)"1*4-дивминобутвн в количестве 0,2 мг/мл, устанавливая рн среды 6,5. Каждые 100 мл обработанной среды отдельно звгружвиэт s колбы Свкагуши и затем стерилизуют.

Затем В среду инокулнруют ЯМ Ь О муббь И МИ е (pea %15003) у тивируют арн 27 С и течение 192 час прн переменжввнни со скоростью 130 o6/мин. щ После этого культуральную жидкость собирают и фильтруют, получая 1,1 л фильтратв {эффективность 150 мг/мл, общва эф.фективность 165,0 мг). Этот культуральный фильтрвт пронускают через холопку, ® заполненную 70 мл Амберлитв 1ЯС-50 (торговое наименование ноно- обменной смолы К-.чипа) и вдсорбируют нв нем. промьеввют водой. и элюнруют 0„5 Н соляной кислотой. 300 мл элюатв нейтрализуя) ют„пропускают через колонку, звполненнух;

30 мл вктивированного угля, и вдсорбнруют нв нем, промывают водой, затем элюнруют, используя смесь 1:1 (по объему) ацетона и 0,02 Н соляной кислоты, соби35 реют фракции, актнвиые к.Мусо4 йсЬи,и+и

508211

607, и концентрируют д уха. Полученный остаток растворяют в 2 мл 80%-ного водного метанола и загружают в колонку, заполненную 10 мл нейтральной окиси алюми-: ния, затем элюируют 80%-ным водным метанолом. После чего собирают фракции, содержащие блеомицин, концентрируют их до.суха и получают 62 мг сопянокислого блеомицина (эффективность 1200 мкг/мг-,: об- . щая эффективность 74,4 w ). Выход из культурного фильтрата 45%.

Полученный нродукт разделяют На ! цельные блеОмициновые компоненты водным раствором формиата аммония на CM- Сефадексе в колонке, определяя, что îí со,держит 90,8% блеомицина А

Этот метод разделения сдстоит в следующем. 50 мг указанного продукта растворяют. в 0,5 мл воды и earружают в кодонку, заполненную 5 мл Сефадекса С-25, затем элюируют дистиллированной водой.

Полученную голубоват -зеленую фракцию, содержащую блеомиции. мделякл, суспендируют в 0,02 К водном растворе хлористого аммония, вносят в колонку, заполненную 5 мл СМ Сефацекса, и эллюируют

0,1 М водным раствором хлористого аммония, После этого полученную фракцию, содержащую желаемое вещество. пропускают через копонку, заполненную 2 мл активированного угля, для адсорбции желаемого вещества, которое элюируют смесью 1:1 ацетона и 0,02 Н соляной кислоты. Затем элюат концентрируют досуха, получая 15 мг блеомицина A (эффективность 2540 мкг/мг общая эффективность 38,1 мг), Выход про5 дукта составляет 78,24%.

10 мг полученного вещества растворяют в 1 мг метанола, и в раствор в течение 10 мин пропускают газообразный сероводород. Затем раствор фильтруют, фильтрат концентрируют досуха, получая 7 мг свободного от меди солянокислого блеоми- цина A (эффективность 2500 мкг/мг, 5 общая эффективность 17,5 мг). оОсвобожденный от меди продукт гидролизуют 6 H водной соляной кислотой, подверГают электрофорезу на бумаге и определяют спермидин.

Пример 2, К среде, содержащей, %: 6 4 просяного желе, 0,5 глюкозы, 3,5 порошка соевых бобов, 0,75 крепкого отвара кукурузы, 0.3 хлористого натрия, 0.1 вторичного фосфета калия, 0,05 сульфата цинка, 0,01 сульфата меди, 0,2 нитрата натрия, 0,01 кремния и Q,Q1 фойо №1 (торговое наименование поверхностно активного агента}. прибавляют- 3-(й -4аминобутил-аминопропиламин в количестве

0,4 мгlмл, установив рН среды 6.5. 12 л обработанной среды загружают в стеклянный ферментатор емкостью 20 л и стерилизуют.

В эту среду инокулируют 800 мл культуральной жидкости ИМ ЬЬи уСЕЬ ИдЯ— @ (АТСС М 15003), которую в течение 48 час встряхивают для культивирования в среде того же состава, что приве® ден выше, и культивируют в течение 163. о час при 27 С при перемешивании со скоростью 350-370 об/ми, вводя через минуту воздух в объеме, равному объему среды. 7,0 л культурапьной жидкости фильтруют, фильтрат (эффективность 122;2 мкг/мл, общая эффективность 611,0 мг) экстрагируют, очищают по методике примера 1 и получают 180 мг солянокислого блеомицина (эффективность 1200,0 мкг/мг; общая эффективность 216 мг). Выход нз культу, рального фильтрата составляет 35,4%.

Полученный продукт растворяют в 10 мл дистиллированной воды, раствор загружают

s колонку емкостью 50 мл с СМ- Сефадексом, суспендированным в 0,02 H водном

Растворе1 формиата аммония для получения фракции, содержащей блеомицин А . Эту .

5 фракцию пропускают через колонку, заполненную 10 мл aa èèIIðîàaííîão угля, и адЗО сорбируют ее, промывают водой, элюируют смесью 1;1 (но объему) ацетона 0,02 Н водной соляной кислоты, Затем полученную активную фракцию элюата концентрируют досуха, получая 44,7 мг блеомицина А в

Зб

5 виде со янокислой соли (эффективность

2543 мкг/мг, общая эффективность 113,7 м ). Выход солянокислой соли составляет

52 6%.

Это вещество гидролизуют 6 H соляной кислотой, обрабатывают 10%-ным раствором едкого натра и проводят газовую хроматографию; используя колонку, заполненную Флуропакк 80 (торговое наименование), покрытый Силиконом 5F 96 (торговое наименование), Так определяют пик спермидина.

30 мг полученного солянокислого блеомицина А (эффективность 2543 мкг/мг, общая эффективность 76,28 мг) растворяют s 50 мл метанола, в полученный раствор в течение 30 мин вводят газообразный сероводород для получения осадка сульфида меди. Этот осадок отфильтровывают и промывают метанолом. Потом объединяют промывные жидкости ь фильрат и смесь упаривают досуха, получая 25 мг свободного от меди блеомицина A в впле соляиокис:) лой соли (эффектив.к>сто 2, ОЯ мкгlмг, о65 5082 1 1

Составитель Т. Головина

Техред N. Левицкая Корректор Л. Анджиевская

Редактор A. 5ep

Зак аз 2604 Тираж 5766 Подписное г.гНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35* Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент», r. ужгород, ул. Гагарина, 1g1 щая эффективность 62,5мг). Выход из содержащего медь вещества составляет 83.3%;

20 мг этого освобожденного от меди солянокислого блеомицина на A (эффек-:. тивность 2500 мкг/мг, общая эффективность 50 мг) растворяют в 2 мл дистиллированной воды, загружают в колонку, заполненную 5,мл анионо-. обменной смо лы Амберлит 1ЯА-400 (торговое наименование, сернокислый тип ноно- обменной смолы, производит Ром энд Хаас Ко.) и затем элюируют дистиллированной вюдой, элюат концентрируют досуха, получая 15,5 кг свободного от .меди сульфата блеомицнна А (эффективность 2500 мкг/мг, обutes эффективность 38,75 мг). Выход из

5 свободной от меди солянокислой соли 77„5%, Д р и м е р 3, Среда содержит,%:

4,0 порошка. соевых бобов, 1,0 дрожжевого экстракта, 0,3 хлористого натрия, «,9 масла сои, 0,0007 СиЯО 5гг О, О.ООО1

Fe80 7 Н,О, 0,0008 Ы 4Н Ои

4 2

0,0002 ькб 0 7 Н 0: рН устанавлиаа4 2 ют 7,0. Каждые 120 мл среды отдельно загружают: в колбы Сакагуши емкоетью

500 мл и стерилизуют. В среду инокулируют штамм МА 267-А, выделенный нз

1. почвы Яусашино-шо, Саитама-кен, который был идентифицирован как разновидность

Sttapto yeeO ц.еЗЙСг,Лип и который продуцирует в особенности блеомицин A .

Затем 3- (Й -4-аминобутил)-аминопрошщамин фосфат, который был подвергнут стерилизации с фильтром Яиллипор добавляют так, чтобы его количество составляло 0„5 мг/мл. Штамм культивируют при 27 С в течение 7 дней при перемешивании со ско ростью 130 об/мин. Собирают 5, > л куль, туральиОй жидкости, фильтруют,, фильтр&т (эффективность 196 мкг/мл, общая эффективность 253 мг; 4,5 л) экстрагируют к и Очищают по методике flpHLfep& 1в полу чая 137 мг сирого порошка солянокислого блеомицина «,5 (эффективность 1846 ,.мкгlм1 . общая эффективность 253 мг).

Выход нз кужьтуральной жидкости составгл ляет 28,&%. Оарой продукт хроматрограФируют используя колонку. заполненную

25 мл Сефвдэкса С-50. и элюируют днс, тиллнРованной водой. Полученные голубые

I активные фракцип собирают и концентриру б Kn досуха, получая 53„5 мг голубого по, рошка Е активиостьв 2613 мкг/мг (общая активность 140 мг); получают толь ко блеомнщщ А5. Выход из сырого порош- ка составляет 55.4%,. Экстинкция

1см

Ж при 293 нм полученного продукта равна .. 116, спермидиновая боковая цепь в нем была определена при помощи газовой хроматографии гндролизата продукта 6 Н сс линой кислотой, Ф

Формула изобретения

Способ получения антибиотика 3-(й—

4 аминобутнл)-амийottPotttt«teMttнo-блеo иunЭ, йа(блеомицина А ) путем выращивания г продуцента рода Я Ее э ог гуаеь на среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения выхода

Зб целевого продукта, выращивание осуществляют в присутствии 3-(М -4-аминобутил)-аминопропиламина нли M,iv -бис (3-аминолропил)-1, 4-днамннобутана.