Способ получения стойких гликопептидных антибиотиков

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистииескил

Республик (11)515463 (61) Дополнительный к патенту .— (22) Заявлено 09.08.72 (21) 1819085/23-4 (23) Приоритет (32) 13.08.71 (51) М. Кл. С 07 6 11/00

Государственный комитет

Совета MNHMcTpOB СССР по делам изобретений и открытий (31) 61063 (13) Япония (43) Опубликовано 25.05.76. Бюллетень ¹ 19 (45) Дата опубликования описания 26.07.77 (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Хамао Юмезава, Томохнсо Такита, Ясухико Мураока и Акио Фудзи (Япония) Иностранная фирма

"Заттдан Ходзин Бнсейбуцу Кагаку Кенкую Каи" (Япония) (71) Заявитель (S4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТОЙКИХ ГЛИКОПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКО — co-мн-сн-сн -

2 2 с, Изобретение относится к новому химическому способу получения стойких гликопептидных антибиотиков, которые применяются в медицине.

Известен микробиологический способ получения антибиотиков ряда блеомицина неполной структуры

Х вЂ” СОМ1

-C0-NH-С Н

Недостаток этого метода заключается в том, что при использовании микроорганизмов рода Strepaomyces параллельно продуцируются и нестойкие антибиотики неполной структуры

Предлагается способ превращения нестойких гликопептидных антибиотиков, применимый ко всем антибиотикам неполной структурь{ ll, в стойкие гликопелгидные антибиотики неполной структуры 1, заключаюшийся в том, что антибиотики .неполной структуры 11 попнергают окислению

2 обычно при 0-50 С. В качестве окислителей обычно используют феррицианид калия или двуокись марганца, а в качестве исходного продукта — неочищенную смесь, содержащую соединения неполной структуры ii, например флеомицин,УА=56, зарбамицин. Выделяют целевые продукты известными лриемалш. Идентифицируют полученные продукты прн помощи УФ-спектров поглощения. Гликопептидные антибиотики неполной структуры П имеют спектр поглощения УФ-лучей с максимумами

{ Ь { О/О поглощения Е 140-160 при 244 ммкм и E

50-60 при 300 ммкм, Глнкопептидные антибиотики неполной структуры П имеют спектр поглощения

{ 0/о

УФ-лучей с максимумами поглощения Е {

120-135 примерно при 293 ммкм и E 150-170 примерно при.244 ммкм.

Оба, антибиотика имеют соответственно два максимума поглощения. Однако соотношение более длинной волны максимума поглощения к более короткой волне максимума поглощения составляет примерно 2,8 для первого антибиотика, но примерно 1,2 для второго антибиотика.

Преимушеством данного способа является значительное повышение выхода очитценного продук а и возможность выделения стойких антибиотиков.

Пример 1. Используют флеомицин О, (медьсодержащий хлоргидрат) с максимумом поглощения Е 147 при 244 ммкм и другим

1см 4 /о максимумом поглощения Е < . 54 при 300 ммкм в метаноле. 20 мг порошкообразного флеомицина

О, растворяют в 1 мл воды и в растворе суспендируют 20 мг двуокиси марганца. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 40 час при перемешивании. После реакции суспенэию фильтруют и фильтрат пропускают через колонну, заполненную смолой "CM - Сефадекс С-25", предварительно обработанной 0,05 М раствором хлористого натрия для абсорбции продукта реакции. Затем концентрацию раствора хлористого натрия, применяемого в качестве элюата, линейно повышают от

0,05 до 1 М для элюирования продукта реакции. В результате элюируют непрореагировавший флеомицин 1з Ьо фракции, элюированной 0,40 М раствором хлористого натрия, а продукт реакции блеомицина Вз злюируют во фракции, элюированной

0,44М раствором хлористого натрия. Последнюю фракцию пропускают через колонну, заполненную

1 мл активного угля, что приводит к адсорбированию блеомицина Вз. Затем продукт промывают водой для удаления неорганических солей и элюируют смесью 0,02 н.раствора соляной кислоты с ацетоном (1:1) и элюат пропускают через продукт, что приводит к элюированию раствора голубого цвета, содержащего блеомицин Вз (медьсодержащий хлоргидрат). К элюату добавляют анионооб.,менную смолу "Дау Х-44". (тидроксильный тип) для доведения рН элюата до 6,0. и элюат фильтруют, растворитель удаляют и -высущйв мат. Получают

12 мг голубого порощка,блеомицина В (медьсодержап.ий хлоргидрат), Полученное соединение имеет специфический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для гликопептида неполной структуры П, имеет мак ° ., м о| поглощения Е,:59 пои 244 ммкм, лг макg ll 1 симум поглощения Е 137 при 293 ммкм и концевую адсорбцию в метаноле.

Величина. Rg для полученного соединения составляет 0,66 при тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол: 10%-ный ацетат аммония:

10 o-ная гидроокись аммония - 10: 9: 1) и 0,56 при тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол: пиридин: уксусная кислота: вода15: 10: 3: 12), что соответствует указанным величинам Rg для блеомицина Вз.

515461

Продукты гидролитнческого разложения полученных веще с"в следующие:

СН - С (— СН - СООН (I

ВН нН

ПЕ

HgN

СН )- СН,-СН,С(ОН Г

Э

НОО С цН

СН5 СН СН СН СООН

I I

MH ОН CH — г- CH CH ОООН vI ( ок жн, :0 нН -СН -СН-СООН

ЧН

25 Я -- т- СООТГ нн, сн,-си,-i a

30, СН,-СН,-СН,-СН -КН-С вЂ” NHz

Таблица 1

Антимикробная активность по отношению к микроорганизму Mycobacterium 607, определяемая по чашечному методу (активность стандартного блеомицина Аз — основания принимается эа 1000 и/мг), составляет 2720 ед/мг.

Сравнение стойкости полученного блеоми40 пина Вз и исходного флеомицина D< в кислой

O среде приведено в табл. 1.

1,0 мг полученного блеомицина В2 и такое же количество флеомицина D> растворяют в 10 мл

0,01 н,раствора соляной кислоты, и полученный

45 раствор выдерживают в кислой среде (рН2) при о

27 С в течение часа. Определяют остаточную антимикробную активность на Mycobacterium 607 по чашечному методу (выражена в расчете на !00 ч. первоначальноч антимикробной активности) .

Блеомицин В2 100 102 97 99 02

Флеомицин 01 100 20,8 5,3 2,7 0

515461

Таблица 2

4О

Пример 2. 20 мг порошкообразного флеомицина Е (медьсодержащий хлоргидрат) с максимумом поглощения E 154 п и

j. /о

1см о

244 ммкм, другим максимумом поглощения Е

1см

57 при 300 ммкм и концевым поглощением УФчасти спектра в метаноле окисляют по методике примера 1, и полученный продукт выделяют хроматографией с применением "CM ° Сефадекса С-25" в соответствии с методикой примера 1. В результате непрореагировавший флеомицин Е элюируют во фракции, элюированной 0,60 M раствором хлористого натрия, а полученный блеомицин В4 элюируют во фракции, элюированной 0,64 М раствором хлористого натрия.

В соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатывают активным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют и растворитель удаляют. Продукт высушивают и получают 10 мг голубого порошка блеомицина В4 (медьсодержащий хлоргидрат) . Полученное соединение имеет специфический спектр поглощения УФ-лучей, харцстерный для гликопептида неполной структуг о ры Т, и имеет максимум поглощения Е 162 при

1см

244 ммкм, другой максимум поглощения E

1см при 293 ммкм и концевое поглощение в метаноле.

Величина R f для тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол: 10%-ный ацетат аммония

: 10 o íàÿ гидроокись аммония - 10:9:1) составляет 0,50, а для тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол: пиридин: уксусная кислота:

:вода=15: 10: 3:12) -0,54.

Антимикробная активносгь íà Mycobacterium

607, определяемая по чашечному методу (активность стандартного свободного основания блеомицина Аз принимается эа 1000 и/мг), составляет

6354 и/мг. Сравнение стойкости полученного блеомицина В4 и исходного флеомицина 04 в кислой среде приведено в табл. 2. раствором хлористого натрия. В соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатывают акп1вным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют и растворитель удаляют, Продукт высушивают и получают 9 мг бесцветного порошка

5 блеомицина В2 (хлоргидрат, не содержащий медь).

Полученное соединение имеег специфический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для гликопептида неполной структуры Т, и имеет макси ñ, мум поглощения Е 161 при 244 ммкм, другой

1см максимум поглощения Е 127 при 293 ммкм и

1см концевое поглощение в метаноле (содержит сульфат меди) . Величина Rf для тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол: 10 -ный ацетат ал1л ония: 10 гная гидроокись аммония - 10:9:1) составляет 0,61, а для тонкослойной хромато- графин на авицеле (н-пропанол: пиридин: уксусная кислота: вода = 15:10:3:12) — 0,48.

Антимикробная активность íà Mycobacterium

607, определяемая по чашечному методу (активность стандарпгого свободного основания блеомицина А принимается за 1000 ед/мг), составляет

2680 ед./мг, Пример 4, 20 мг порошкообразггого флеомицина 0 г (медьсодержащий хлоргидрат), f t. а имеющего максимум поглощения Е 147 при

1см жоао

244 ммкм, другой максимум поглощения Е 54

1ем при 300 ммкм и концевое поглощение УФ-части спектра в метаноле, и 20 мг феррицианида калия : расгворяют в 1 мл воды и осуществляют реакцию при комнатной температуре в течение 48 час.

После реакции реакционную смесь пропускают через колонну, заполненную 30 мл "CM-Сефадекса

С-25", предварительно обработанной 0,05 М раствором хлористого натрия. Ферриш анид калия и продукт его реакции проходят через колонну, флеомицин и продукт его реакшш адсорбируются с образованием голубой полосы на верхней части колонны.

Концентрацию раствора хлористого натрия в качестве элюата повышают линейно от 0,05 до 1,0 л1 при элюированин продукта реакции. В результате неп рореа гиров ав шнй фле омицин 0 t элюируют во

Блеомицих В4 !

Флеомицин Е

100

95, 1,8

50

gn

Пример 3. 20 мг поро1пкообразного флеомицина D, (не содержащий медь хлоргидрат) с максимумом поглощения Е1 " 150 пои

1с,м

244 ммкм, другим максимумом поглощения Е

1см

56 при 300 ммкм и концевым поглощением УФчасти спектра в метаноле, содержащим CuSO4, окислягот по меюдике примера 1 и полученный продукт выделяют хроматографией с применением CM — Сефадекс С-25" по мего шке примера I. В результаге непрореагировавший флеомицин О, элюируют во фракш,и, элюированной 0,42 Ч раствором хл рис1о о на|рпя, а полученный блеомицин В2 элюируют во фракции, ппг41рова1шой 0,46 M фракции, элюированной 0,40 M раствором хлористого натрия, а продукт реакции — блеомицин В2— элюируют во фракции, элюированной 0;44 M раствором хлористого натрия.

В соответствии с методикой примера 1 последнюю фракцию обрабатьгвают активным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют н растворитель удаляют. Продукт высушивают и получают 6 мг голубого порошка блеомицина В2 (медьсодержащий хлоргидрат) . Полученное соединегп е имеет специфический спектр поглощения УФ-лучей, характерный для гликопептида неполной структу! 4 0 ры I, и имеет максимум поглощения Е 156 при

Мсм

244 ммкм, другой максимум поглощения Е, 124 ! см при 293 ммкм и концевое поглощегп(е в метаноле.

Величина Rf полученного соединения дчя тонкослойной хролгазографии на силика(еле (л1е анол.

10 о-ный ацетаг аммония: 10 Я-ная гидроогись

515461 аммония = -10 : 9 : 1) составляет 0,66, а для, тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропа- нол: пиридин: уксусная кислота: вода = 15: 10: 3: 12) — 0,56.

Пример 5. 100 мг соединения "УА-56" (медьсодержащий хлоргидрат), состоящего из

70 мг компонента Х„имеющего максимум поглощения Е 126,6 при 246,5 ммкм, другой макси1 о

1СМ о( мум поглощения E 45,6 при 300-303 ммкм и

1см концевое поглощенйе, и из 30мг компонента 1, ьЪ имеющего максимум поглощения Е 134 при

1см

245,5 ммкм и концевое поглощение в метаноле, растворяют в дистиллированной воде и доводят рН до 7,5 добавлением 1 н.раствора бикарбоната натрия.

К раствору добавляют 20г порошкообраэной двуокиси марганца, и полученную смесь перемешивают при 5-8 С в течение 9 дней, а затем фильтруют для удаления двуокиси марганца.

Фильтрат концентрируют под вакуумом и высушивают. Получают 96 мг неочищенного порошка.

Продукт растворяют в 0,05 н.растворе соляной кислоты и выдерживают при комнатной температуре в течение 16 час, подщелачивают до рН 6,0 добавлением раствора гидроокиси натрия и адсорбируют на колонне, заполненной 100 мл "СМ-Сефадекса С-25" (натриевый тип).

Концентрацию раствора хлористого натрия в качестве элюата повышают от 0,05 до 1,0 М при элюировании продукта реакции с использованием

1 л раствора хлористого натрия, Дегидрированный компонент g элюируют во фракции, элюированной

0,32 М раствором хлористого натрия, а компонент

Х вЂ” во фракции, элюированной 0,38 М раствором хлористого натрия. Непрореагировавший компонент 1 элюируют во фракции, элюированной 6,44 М раствором хлористого натрия, а непрореагировавший компонент Х вЂ” во фракции, элюиров,":„й

0,48 М раствором хлористого натрия.

В соответствии с методикой примера 1 полученный продукт обрабатывают активным углем, удаляют соли, раствор нейтрализуют и растворйтель удаляют, Продукт высушивают и получают 32 мг фиолетово-голубого порошка дегидрированного компонента Х соединения "УА-56" и 12 мг дегидрированного компонента У соединения "УА-56".

Полученный дегидрированный компонент Х имеет спектр УФ - поглощения с максимумами

1 /о 1чо поглощения Е 153 при 243 ммкм и Е1 116 при

1см

293 ммкм в метаноле.

Полученный дегидрированный компонент 1 имеет спектр УФ - поглощения с максимумами поглощения Е 152 при 242 ммкм и E 117

i /о 1 .

1см при 292 ммкм.

Величины Rg для тонкослойной хроматографии на силикагеле (метанол: 10 o-ный ацетат аммония;

10 -ная гидроокись аммония = 10: 9: 1) составляют 0,68 для дегидрированного компонента

Х соединения "УА-56" и 0,71 для дегидрированного компонента 1/ соединения "УА-56".

Величины Rg для тонкослойной хроматографии на авицеле (н-пропанол: пиридин: уксусная кислота; вода = 15; 10: 3 . 12) составляют 056 для дегидрированного компонента Х и 0,66 для дегидрированного компонента (.

Антимикробная активность по отношению к

Mycobacterium 607, определяемая по чашечному методу, составляет 2665 ед/мг для дегидрированного компонента Х и 1848 ед/мг для дегидрированного компонента г . В продукте гидролиза дегидрированных компонентов Х и Y соединения "УА-56" найдена аминокислота формулы УШ, а также наблюдается положительная реакция на нингидрин, характерная для "УА-56", что видно из результатов двух бумажных хроматограмм, Стойкость соединений, определяемая по методике примера 1, приведена в табл. 3.

Таблица 3

2О

96

94

4,5

3,8

100

Дегидрокомпонент Х

Дегидрокомпонент g

Компонент Х

Компонент 1

Формула изобретения

1, Способ получения стойких гликопелтидных антибиотиков неполной структуры

35 1 — т — СΠ— 58х à — со M-св,— Сн,—

N - -СО-NHу

4 СО ХН-СН -СН с последующим вьщелением целевого продукта известными приемами.

2, Способ по п.1, отличающийся тем, что

sa процесс осуществляют при 0-50 С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют феррицианид калия или двуокись марганца.

4. Способ поп,1, отличающийся тем,что у5 в качестве исходного продукта используют неочищенную смесь, содержащую соединения неполной структуры 11

5. Способ поп.1, отлича юшийся тем, что в качестве соединений неполной формулы I ( и (I ьп ) используют флеомицин, УА-56 и зарбамицин. от лича ющ ий с ятем, что проводят окисление не4О стойкого гликопептидного антибиотика неполной стуктуры