Реактив для определения триглицеридов

 

ОП И САНИ Е

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

Союз Советских (1 ) 639487

Социалистических

Республик

Х ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 13.12.73 (21) 1933651/28-13/

/1975398/23-04 (23) Приоритет 19.06.73 (32) 19.06.72 (31) P 2229849.3 (33) ФРГ (43) Опубликовано 25.12.78. Бюллетень ¹ 47 (45) Дата опубликования описания 23.01.79 (51) Ч.Кл. С) 01 N 31/14

Государственный комитет по делам изобретений и открытий (53) УДК 543.853.76 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Аугуст Вильхельм Валефельд, Ханс Меллеринг, Вольфганг Грубер, Эрих Бернт и Петер Решлау (ФРГ) (71) Заявитель

Иностранная фирма

<гБерингер Маннхайм ГмбХ» (ФРГ) (54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ

0,007 — 0,07 остальное

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к реактивам для определения триглицеридов в продуктах питания, крови и сыворотке.

Известен реактив для определения триглчцеридов, состоящий;из перекиси водорода, периодата и хромотроновой кислоты, добавляемой,после экстракции триглицеридов хлороформом с последующим удалением мешающих определению веществ цеолитом, омылением фильтрата спиртовой щелочью при 60 — 70 С с последующим выдерживанием раствора при 100 С в течение

30 мин (11.

Недостатком реактива является необходимость длительной предварительной подготовки пробы для анализа.

Известен также реактив для определения триглицидов, содержащий липазу из

Rhyzopus arrihizus, буфер, а-химотрипсин, глицеринкиназу, лактатдегидрогеназу, сывороточный альбумин, аденозин-5-фосфат, фоофоенолпировиноградную кислоту, восстаБовленный никотинамидадениндинуклеотид, пируваткиназу и триолин (2).

Для этого, реактива характерны большой расход эизима и большая длительность проведечия анализа для определения триглицеридов.

Целью изобретения является повышение эффективности реактива.

Предлагаемый реактив для определения триглицеридов содержит буфер, лппазу из

5 Rhyzopus arrihizus, аденозинтрифосфат (АТФ), никотинамидаденпндинуклеотид в восстановленной форме, фосфоенолпировиноградную кислоту, лактатдегидрогеназу, сывороточный альбумин, глицеринкиназу, 10 карбоксилэстеразу, додецилсульфат натрия, фосфоенолкиназу и сульфат магния, при следующем содержании компонентов, вес 0о

Липаза пз К zyzopus arrihizus 0,01 — 1,0

Аденозпнтрифосфат 0,5,— 5,0

Никотинамидадениндинуклеотид в восстановленной форме 0,05 — 1,0

Фосфоенолпировиноградная кислота 0,04 — 0,4

Лактатдегпдрогеназа 0,05 — 0,5

Сывороточный альбумин 0,01 — 0,2

Глицеринкиназа 0,005 — 1,0

Карбоксилэстераза 0,05 — 2,0

25 Додецилсульфат натрия 0,001 — 0,02

Фосфоенолкиназа 0,02 — 0,5

Сульфат магния с содержанием ионов магния

Буфер

639487

Компоненты:

Отличительным, признаком реактива является то, что он дополнительно содержит кар боксилэстер азу, додецил сульфат натрия, фосфоренолкиназу,и сульфат магния при у.казанном содержании компонентов реактива.

Предлагаемый, реактив позволяет сократить время проведения анализа в два раза, т. е. до 30 мин, и,количество потребления 10 энзима.в 50 раз.

B качестве буфера предпочтительно использовать 0,03 — 0,3 М .раствор триэтаноламина при рН 6 — 9 или боратный буфер.

Пример 1. Приготавливают реактив, устойчивый при хранении, состоящий из пяти ком понентов, которые, перед употреблением смешивают, его можно хранить в виде смеси в течение 1 — 2 дней, 20

Компоненты:

0,1 люль триэтаноламинного буфера с рН 7,6, содержащего 3 млюль сульфата магния, 1,5 л г/л л коровьевого сывороточного альбумина и 0,1 мгlмл додецилсульфата натрия (1); раствор 6 л моль никотинамидадениндинуклеотида в восстановленной форме (НАДН), 33 л л1оль АТФ и 11 ммоль фос- 30 фоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной воде (2); кристаллическая суспензия 2 мгlмл лактатдегидрогеназы и 1 мг/мл фосфоенолкиназы (3); Зэ раствор 0,2 л г/мл липазы из Rhyzopus

arrihiz0s и 4,0 мг/мл карбоксилэстеразы (4); кристаллическая суспензия 2 мг/мл глпцеринкиназы (5).

При умножении величины количества компонентов в мгlмл на 0,1 получают количество компонентов в вес. % .

Для компонентов, указанных в млюлял., 45 учитывается еще молекулярный вес.

2,9 мл компонента 1, 0,1 л л компонента

2 и 0,02 мл компонента 3 смешивают и устанавливают температуру смеси 25 С. Затем прибавляют 0,1 мл сыворотки,,содержащей подлежащий определению триглицерид, и инкубируют 5 лсин при .заданной темпераrylpe. Затем прибавляют 0,1 мл компонента

4, смесь выдерживают 15 — 20 мин при указанной температуре и затем замеряют, величину экстинкции на индикаторной шкале фотометра (при 366 или 340 нм) . Эту величину обозначают Еь Затем прибавляют к пробе 0,02 мл компонента 5,и через 10 мин снова замеряют экстинкцию. 3амеренную 60 величину обозначает Е2. Еще через 10 мин снова замеряют экстинкцию и замеренную величину обозначают Ез. Расчет:

ЬЕ= (Е,— Е2) — (Е2 — Еэ).

Общее количество .глицерина из триглицерида в мг/100 мл=ЛЕ 89,1.

Описачное определение повторяют девять,раз,,причем прибавляемое количество сыворотки может быть уменьшено на

0,01 мл. При построении графика полученные таким образом значения ЬЕ по отношению к применяемому количеству сыворотки образуют, прямую.

Из определенных, величин вычисляют пропорциональность (r), равную 0,9986, по сравнению с r (,идеальный случай), равной

1,000, что показывает очень высокую точность метода.

П р.и м е,р 2 (для предельно низких кон центраций отдельных компонентов).

Определяют коэффициет изменения (К). стандартное отклонение (С)

/ь среднее значение (X) 100

Проводят 10 измерений в 1 день, точно та кже,проводят 10,измерений в течение

10 дней по одному измерению в день.

Приготавливают успойчивый при хранении .реа|ктив,,состоящий,из пяти компонентов, которые смешивают, перед употр еблением, в .виде смеси они могут храниться в течение 1 — 2 дней.

0,03 моль триэтаноламинного буфера, рН 7,6, содержащего 3 млюль сульфата магния, 0,1 л г/мл коровьего сывороточного альбумина и 0,01 мг/мл додецилсульфата натрия (1); ,раствор 1 л моль НАДН, 10 лиюль АТФ ,и 2 ммоль фоофоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной воде (2); кристаллическая суспензия 0,5 мг/л л лактатдегидрогеназы и 0,2 яг/л л фосфоенолкиназы (3); раствор 0,1 мг/л л липазы на Rhyzopus

arrihizus и 0,5 мг/лил карбоксилэстеразы (4); кристаллическая суспензия 0,05 мг/мл глицеринкиназы (5).

2,9 мл компонента 1,01 мл компонента 2 и 0,02 мл компонента 3 смешивают и устанавливают температуру смеси 25 С. Затем прибавляют 0,1 мл сыворотки, содержащей подлежащий определению триглицерид и

15 мин инкубируют при 37 С. Затем прибавляют 0,1 мл компонента 4, смесь выдерживают 35 мин при указанной температуре и затем при 316 или 340 нм считывают величину экстинкции по индвкаторной шкале фотометра. Эту величину обознают Е;.

Затем прибавляют к пробе 0,02 мл компоtHBHTB 5 и через 20 л ин снова считывают экстинкцпю. Эту величину обозначают Е2.

639487

Еще через 20 лгин снова считывают величину, обозначаемую Ез. Расчет:

ХЕ= (Е) — Е ) — (Е,— Ез) ..

Общее количество глицерина из триглицерида в лгг/100 лг.г=ЛЕ 89,1.

Эти измерения повторяют 10 раз с каждой пробой серийно (одно за другим) пли в течение 10 дней, на основании полученных данных вычисляют среднюю величину и стандартное отклонение и определяют

К (%)

П р и м е:р 3 (для предельно высоких концентраций отдельных компонентов) .

Берут пробы в 15 различных сериях (первый столбец), к которым, прибавляют чистое вещество — тргиолин. Из сравнения ожидаемого (вычисленного) значения н найденного значения получают данные (в процентах). Результаты, приведены в таблице.

Приготавливают устойчивый при хранении реактив, состоящий из пяти компонентов, которые смешивают перед употреблением, в виде смеси они могут храниться в течение 1 — 2 дней.

Компоненты:

0,3 лоль триэтаноламинного буфера рН 7,6, содержащего 30 ллоль сульфатамагния, 2 лгг/лгл коровьего сывороточного альбумина и 0,2 лг/лл додецилсульфата натрия (1); раствор 20 ллоль НАДН, 100 ллоль

АТФ,и 20 ллоль фосфоенолпировиноградной кислоты в дистиллированной, воде (2); кристаллическая суспензия 5 лг/лгл лактатдегидрогеназы и 5 лгг/лгл фосфоенолкиназы товарная марка (3); раствор 100 лгг/лгл липазы из Rhyzopus

arrihizus и 20 лг/л)л карбоксилэстеразы (4); кристаллическая суспензия 10 лгг/лл глицеринкиназы (5).

2,9 л,г компонента 1, 0,01 лгл компонента

2 и 0,02 лл компонента 3 смешнвают и устанавливают температуру смеси 25 С.

Затем прибавляют 0,1 лгл сыворотки, содержа)щей лодлежащий определению триглицерид, и,инкубируют 5 лгин,при 20—

25 С. Затем прибавляют 0,1 лл компонента

4, смесь, выдерживают 7 — 10 лгин при заданной температуре и затем считывают .величину экстинкции по индикаторной шкале фотометра при 366 или 340 на. Эту величину обозначают Е). Затем прибавляют и пробе 0,02 лл компонента 5 и через 5 лгин снова считывают величину экстракции, обозначают считанное значение Е2. Еше через 5 лгин снова считывают значение экстинкции и обозначают его Ез. Расчет:

ХЕ= (Е) — Ез) — (Ез — Ез ) .

Оощее количество глицерина пз трпглицерида в лг/100 лл=ХЕ. 89,1.

Результаты приведены в таблице.

Триглицерид

Триглннерид св)воротни, лгг/100 ил

Триолинлобавка, .)ь /100 л. ) вычислено нв))дено, )гл/!0;) лл, ) 1

118 I 228

118

118

)18

11 02

2 2

2, )2

)! 2

202 . ) )

I) J ч/)2

302

302

324

423

624

312

408

399

507

708 .41 2

508

4:.)9

607

708

Х, 99,9

) ) 25

Формула изобретения

30 Реактив для определения триглпцеридов на основе буфера, липазы из Rhgzopus

arrihizus, аденозпнтрифосфата, никотинамидадениндинуклеотида в восстановленной форме, фосфоенолппровинограднай кислоты, лактатдегидрогеназы, сывороточного альбумина и глицеринкиназы, о т л и ч а ю щ.и йс я тем, что, с целью повышения эффективности реактива, он дополнительно содержит карбоксилэстеразу, додецилсульфат натрия, 40 фосфоенолкпназу и сульфат магния при следующем содержании компонентов, вес.

Липаза из К/г Jlzopus arrihizus 0,01 — 1,0

Аденозинтрифосфат 0,5 — 5,0

45 Никотинамидадениндину)клеотид в восстановленной форме 0,05 — 1,0

Фосфоенолппровиноградная кислота 0,04 — 0,4

Л актатдегидрогеназа 0,05 — О,"

Сывороточный альбумпн 0,01 — 0,2

Глице,ринкиназа 0,005 — 1,0

Карбсксилэстераза 0,05 — 2,0

Додецилсульфат натрия 0,001 — 0,02

Фосфоенолкиназа 0,02.— 0.5

Сульфат магния с содержанием,ионов магния

Буфер

Источники )гнформатцш, .и рипятые во

60 внимание при экспертизе:

1. ) on 1-iarde! Е. V., Zi!versmit D. В., 1.

Lab Clin, Мед. 1957, 50 р. 152 — 157.

2. Bucolo G. et а1. Mechanized Enzimatic

Determinaticn of Triglycerides in Serum, С1Ш. ГЬегп. 1975 21(3 ) и 494. aог

0,007 — 0,07 остальное

110

206

197

305

506

15 110

206

197

305

516) 110

205

20 1с)-;

305

506

) ) 100,9

100,0

100,3

100,2

100,8

9.),-, 100,2

99,8

100,6

99,0

100,0

100,0 ос) 8! 997

97,2