Способ модификации полисахаридов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТЗУ щтект;:, .т,-y««q с -,о - а

l;

732278

Союз Советскмк

Соцмалнстическмх

Реслублнк (61) Дополнительное к авт, сеид-ву— ! (22) Заявлено 281277 (21) 2565936/23-05. с присоединением заявки Ио(23) Приоритет—

Опубликовано 0505.80.Бюллетень Мо 17

Дата опубликования описания 050580 (si)e. Kn.

С 08 В 15/06

Госудврствеявый комитет

СССР во делам нзобретений в открытнй (53) УДК 678.13 (088, 8) Д. П. Янкаускайте, А. А. Дикчювене, A. -A. Б.Паулюконис и А.-С.A,Ãëeìæà (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной знзимологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ПОЛИСАХАРИДОВ

Изобретение относится к химии .природных соединений, точнее к способам получения носителей (сорбентов> для иммобилизации, а также для хроматографической очистки белков, в особенности ферментов.

Известен способ модификации аминоцеллюлозы сероуглеродом и изобутилхлорфермиатом, .позволяющий получить сорбенты для ковалентного связывания ферментов (11.

Полученный сорбент может взаимодействовать с водой, в частности с атмосферной влажностью, что отрицательно влияет на его устойчивость. 15

Использование его как сорбента для связывания ферментов возможно только в водных растворах, так как ферменты не только не растворяются s органических растворителях, но и инактиви- 20 руются ими.Поэтому сорбент в процессе его применения взаимодействует< не только с ферментом, но и с растворителем — водой.

Наиболее близким к предлагаемому 2э является способ модификации целлюлозы путем ее обработки гексаметилендииэоцианатом с целью получения производного целлюлозы, содержащего .свободные иэоцианатные группы, при- 30 годного для использования в качестве

"орбента иммунобелков (2).

Однако применение таких соединений для иммобилизации белков (в том числе ферментов) осложнено тем, что из-за реагирования иэоцианатов со всеми реакционноспособными группами белков легко происходит потеря каталитической активности ферментов, вследствие модификации активного центра или других участков, а также тем, что значительное количество содержащихся изоцианатных групп теряется в побочной реакции гидролиэа, поэтому сорбционная емкость носителей небольшая.

Цель изобретения — разработка способа получения модифицированных полисахаридов, пригодных для иммобилизации и хроматографической очистки белков, в том числе ферментов, обладающих химической стабильностью, повышенной сорбционной емкостью, и тем самым расширение арсенала носителей (сорбентов) °

Указанная цель достигается тем, что модификация полнсахаридов осуществляется их обработкой динзоцианатами с последующей дополнительной обработкой бифункциональными или

732278 моиофункциональными соединениями

B стехиометрическам иэ быт ке в

В качестве бифункциональиых сое- ° динений используют алифатические диамийы и дикарбоновые кислоты С - С

g. а s качестве моиофункциональных соединений используют алифатические, спирты С - С8 °

B качестве нерастворимого полисахарида примен яют целлюлозу, агароэу, декстран, хитин, крахмал и их производные в виде порошков или гранул. Реакция с диизоцианатом проводится в безводных органических растворителях, не содержащих подвижных атомов водорода, например,в диоксане,ацетоне, хлороформе и др. Реакцию 15 катализируют третичные основания и

".кислоты, наиболее подходящим является триэтиламин. Предпочтительны умеренные температуры - 20-50 С.

Промежуточное производное после" 20 удаления непрореагировавшего диизоцианата промыванием органическим растворителем, подвергают взаимодействию с бифункциональным или монофункциональным соединением, содержащим подвижные атомы водорода, структура которого: выбирается в зависимости ат назначения носителя. Реакция проводится в присутствии органического растворителя и катализатора, как указано для первой стадии, или без растворителя, применяя избыток

pearåHта.

В зависимости от длины алифатической цепочки Х получают носители с различной отдаленностью функциональ- 35 ных групп (-NH, -C00H и др.) от полисахаридной матрицы.

Пример 1. Получение носителя, содержащего аминогруппы. К суспензии

3,0 г порошковой целлюлозы в 30 мл 4() безводного диоксана прибавляют 1 мл

2,4-толуолдииэоцианата, 5 капель тризтиламина и смесь медленно перемешивают б .ч при температуре 40-50 С.

Затем целлюлозу отфильтровывают, промывают на фильтре 5-6 порциями диокса- 45 на по 20 мл . Полученное промежуточное производное па данным элементарнаго анализа содержит 4,7%N. В ИКспектре имеется полоса поглощения при 2270 см, соответствующая сво- 8() бодным изоцианатным группам. Производное суспендируют в растворе 0,2 r гексаметилендиамина в 30 мл диоксана, содержащего 5 капель триэтиламина. Смесь нагревают 4 ч при 60- 55

80 С, после чего носитель отфильтроО вывают, промывают несколькими порциями диоксана, смеси диоксан-вода

1:1 и водой. По данным элементарного анализа продукт содержит 6,5% N.

Концентрацию вводимых аминогрупп можно варьировать путем изменения исходного соотношения полисахариддиизоцианат, а также изменением интенсивности условий реакции. Полученный носитель, содержащий

65 аминогруппы, активируют известным глутаральдегидным методом и исполь,зуют для иммобилизации ферментов.

Результаты определения активности иьв обилнзованных препаратов приве-, дены в таблице. Для сравнения там же приведены данные, полученные при иммобилизации тех же ферментов йа широкоиспользуемом носителемакропористом аминосилохроме С-80„ проведенной в аналогичных условиях и с теь: же исходным соотношением фермент:носительв

242 6220 6, 1

По примеру 1

Аминосилохром С-80

1,4

152 2270

Пример 2. Получение носителя, содержащего карбоксильные группы °

Носитель получают как в примере 1, только вместо раствора гексаметилендиамина применяют раствор 2,0 r себациновой кислоты в 30 мл диоксана. По данным элементарного анализа продукт содержит 4,5% N. Для иммобилизации ферментов синтезированный носитель активируют водорастворимым карбоднимидом известным методом., Получены иммобилизованные препараты с активностью глюкозооксидазы

1120 Е/r, аспергнллопепсина — 6,2 E/r.

Пример 3. Получение носителей, содержащих гидрофобные радикалы. Получение носителя ведут как в примере 1, только вместо раствора гексаметилендиамина используют октиловый спирт. После аналогичной обработки получают носитель, содержащий октиловый остаток, присоединенный к фенильному кольцу через амидную связь (по данным элементарного анализа продукт содержит

4,0% N). Функциональные свойства носителя обусловлены гидрофобным взаимодействием с молекулами белков. При адсорбционной иммобилизации глюкоэооксидаэы на этом носителе получен препарат с активностью

80 Е/г, в та время как при применении исходной немодифицированной целлюлозы активность равна нулю.

Аналогичным образом модифицирована сефароэа CL-4B, только в этом случае водная суспензия носителя переводится в органический растворитель и обратно в водную среду промыванием смесями дноксан-вода с постепенно увеличивающейся (обратно-уменьшающейся) концентрацией

732278

Составитель Т,Мартинская

Техред М.Кузьма Коррректор Г. Решетйик

Редактор В.Романенко

Заказ 1535/3 Тираж 549 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 диоксана. Активность имм билнэованной на модифицированной сафарозе глюкоэооксидаэы 128 E/r °

Пример 4. Получение носителя, содержащего карбоксильные группы.

Носитель получают как в примере 1

I тол ько вместо раств ора гексаметилендиамина применяют раствор 1,5 г адилиновой кислоты в 30 мл диоксана.

По данным элементарного анализа продукт содержит 4,3% N. Для иммобилизации ферментов носитель активир-;ют водорастворимым карбодиимидом известным методом. Получена иммобилизованная глюкоэооксидаза с активностью 938 E/ã.

Спределение сорбционной емкости носителей производят следующим образом.

0,5 г носител - инкубируют в растворе 150 мг бычьего сывороточного альбук;.ина (BCA) в 5 мл воды в течео ние 3 ч, при температуре 4 С. Затем носитель отфильтровывают, промывают водой, общим объемом 10 мл и в фильтрате определяют количество несвязанного БСА, Носитель, содержащий аминогруппы по примеру 1, адсорбирует 233 мг/г

БСА, а носитель, содержащий карбоксильные группы по.примеру 2

155 мг/г SCA.

Предлагаемьй способ модификации полисахаридов является экспериментально простым и дает воэможность получить производные с различной структурой и свойствами по однотипной 2-стадийной методике. Полученные производные пригодны как носители для иммобилизации ферментов и др. белков и обладают при этом большой емкостью сорбции. Активность иммобилизованных на аминопроизводном целлюлозы ферментов в 1,6-2,8 раза, а иммобилиэованиых на носителе, содержащем карбоксильные группы в 4-7 раэ выше, чем при использовании обычного носителя — аминосилохрома. Возможность получения иммобилиэованных препаратов с. высоким уровнем каталитической активности и с большим выходом имеет существенное экономическое значение при практическом применении. Полученные носители, в отличие от производных, содержащих свободные изоцианатные группы, являются устойчивыми в водной среде.

Активация носителей осуществляется обычными методами, поэтому значительно снижаются потенциальные возможности инактивации ферментов, существенной для носителей, содержа щих изоцианатные группы. К достоинствам способа относится вариабельность структуры носителя поскольку

1 М вследствие высокой реакционноспособиости изоцианатных rpynn, на второй стадии могут быть использованы соединения различной структуры Так для иммобилизации таких сложных

;соединений как ферменты и др. белки требуются достаточно специфические сорбенты, расширение их арсенала является весьма,полезным. Сфера применения модифицированных полисахаридов не ограничивается иммобилиза- . цией белков. В частности, особенно перспективным может оказаться их

20 применение для хроматографической очистки различных биохимикатов.

Внедрение способа целесообразно осуществить в системе промышленности химических реактивов, предназначенных для биохимии и молекулярной биологии.

Формула изобретения

1. Способ модификации цолисахаридов обработкой дииэоцианатами, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью получения сорбентов, обладающих химической стабильностью и высокой сорбционной емкостью, для иммобилизации или хроматографической

3S очистки белков, проводят дополнительную обработку полученного продукта бифункциональными или Монофункциональными соединениями в стехиометрическом избытке.

40 2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и и е я тем,что в качестве бифункциональных соединений используют алифатические диамины и дикарбоновые кислоты С - С8.

3. Способ по п.., о т л и ч а ю45 шийся тем, что в качестве монофункциоиальиых соединений используют алифатические спирты С - СВ.

Источники Информации, принятые во внимание при экспертизе

50 1, Авторское свидетельство СССР .9479782 кл. С 08 В 15/06, 1973, 2. Авторское свидетельство СССР

9351858, кл. С 08 В 15/Об, 1970 (прототип) .