Способ определения е-розеткообразующих клеток

 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Е-РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ

КЛЕТОК

Изобретение относится к медицине, и именно к иммунологии.

Известен способ . определения Е-розет-" кообразуюших клеток{ Е-РОК) путем смешения суспензий эригроцитов барана и лнмфоцитов с последующим инкубированием смеси и подсчетом розеток (1 .

Однако известный способ не обеспечивает точного определения Е-РОК из за нежелательных изменений поверхности эригроцитов барана фиксатором - неспеl0 цифического прилипания фиксированных эритроцитов барана к клеткам крови человека и возможного обнажения в мембране бараньих эритроцитов скрытых антнгенов, к которым имеются рецепторы, у

3$ лимфоцитов человека.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Цель достигается тем, чтоспособ оп20 ределен ия Е-розеткообразующих клеток осуществляют путем смешения суспензий эритроцитов барана и лимфоцигов с последующим инкубированием смеси и подсчетом розеток, эритроциты перед смешением обрабатывают ацетальдегкдом при концентрации эритроцитов 9,0t1,0% и ацетальдегида 7,2й0,1% при рН 7,0-7,2 и "20-25 С

22-24 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Фиксацию эритроцитов осуществляют смешением равных объемов 18% (по плотному осадку) взвеси отмытых 0,85%-ным раствором Й аСС бараньих эритроцитов и

7,2% раствора ацетальдегида, содержащего 0,85%-ную ЙаС6 .(рН раствора ацетальдегида предварительно доводят до 7,07,2 с помощью ЙаОН). Смесь выдерживают 22-24 ч при 20-25 С при периодическом перемешкрании. Затем эритроциты трижды отмывают 0,85%-ным раствором

Й aCt при ценгрифугировании (3 мин, 3 гыс. об/мин). Отмытые фиксированные эритроциты суспендируюг в 0,85%-ном растворе N aCR до 10%ной концентрации (по плотному осадку). Клеточную концентрацию взвеси определяют подсчетом

8629 в камере Горяева. Препарат фиксированных о эритроцитов барана хранят при 3-5 С беэ кон серванта. Ф иксирова нные эр итроциты сохраняют пригодность для определения

Е-POK в течение не менее 1 года (срок наблюдения), Пример 1. Выделение лимфоцитов человека производят в растворе, составленном иэ 10 мл 10О/-ного раствора желатина, содержащего 0,85/-ную МаС(, >р и 0,6 мл раствора гепарина (без консерванта) с активностью 5000 МЕ/мл. В

0,5 мл приготовленного раствора берут из вены самотеком 10 мл крови. Кровь отстаивают 30 мин при 20-25ОС. Иэ пробы крови лимфоциты выделяют в фиколл-верографиновом градиенте следующего состава: 7 объемов 36,7% верографина и 16 объемов 9% водного раствора фиколла, плотность градиента равна 1,077. На

1 объем градиента в узкой центрифужной пробирке наслаивают 2 объема надосадка, образовавшегося над слоем эритроцитов при отстаивании крови. Пробу центрифугируют

35 мин при 20-25, 1400 об/мин. Лимфоциты отсасывают из границы раздела жидкостей, дважды отмывают средой

199 5 мин при 20-25 С, 1200 об/мин.

Концентрацию лимфоцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Взвесь лимфоцитов разводят средой 199 до конечной концентрации 2 ° 10 клеток/мл.

6 дважды отмытые 0,85%-ным раствором NaCO и один раэ средой 199 фиксированные эритроциты суспендируют в ñðå.де 199 до концентрации 6-10 10 кле35 ток/мл, исходя иэ результатов определения концентрации эритроцитов в исходной 10/-ной взвеси фиксированных клеток.

0,5 мл полученной взвеси лимфоцитов ос4О торожно наливают на дно конической центрифужной пробирки, к ней добавляют

0,5 мл приготовленной взвеси фиксированных эритроцитов барана. Содержимое осторожно смешивают и оставляют 20 мин при

37 С. Пробу центрифугируют 5 мин при

500 об/мин при 20-25 С и оставляют на ночь при 3-5ОС. Затем содержимое пробирки перемешивают осторожным вращением в вертикальном положении 30 с. Пробу помещают в камеру Горяева и произво- 5о дят подсчет Е-РОК, принимая эа нихлимфоциты с не менее чем тремя плотно прикрепившимися эритроцитами. Вычисляют на основе не менее трех параллельных определений процентное содержание Е-POK ы в общем количестве лимфоцитов.

Для получения сравнительных данных в контроле вместо фиксированных эрит19 4 роцитов применяют в тех же условиях наг ивные эритроциты барана, выделенные из свежей крови, собранной в раствор

Олсвера. Полученные следующие результаты при определении Е-РОК (%) человека с эритроцитами: нативными — 32,8> 1,6; 38,2+-1,0; 42,2 0,4; фиксированны« ми 31,8t1,1; 34,6 0,9; 34,8+0,5.

Приведенные данные показывают, что в реакции розеткообразования с фиксированными эритроцитами барана выделяются менее колеблющиеся показатели содержания Е-РОК по сравнению с применением в реакции нативных эритроцитов. При этом средние количества нагивных и фиксированных эритроцитов, приходящихся на одну Е-РОК, практически одинаковы. Существенно сокращается время на проведение анализа в результате гого, что концентрация фиксированных эритроцитов onpeaeasется подсчетом один раз для большой партии фиксированных эригроцитов.

Пример 2. Выделение лимфоцитов осуществляют так же, как в примере 1. С каждой из двух проб лимфоцитов человека, выделенных соответственно из крови двух доноров по способу, описанному в примере 1, четырехкратно определяют содержание E-POK с каждой из грех партий нагивных эритроцитов и с одним препаратом фиксированных по предлагаемому способу эригроцитов барана. Результаты анализа полученных данных сведены в таблицу.

Как видно, содержание Е-РОК значительно колеблется для одной и той же пробы лимфоцитов в эависимости от осо бенностей нативных эритроцитов. Сравнение кюффициенгов вариации, вычисленных для нативных эритроцитов суммарно и для фиксированных эритроцитов, показало существенное (Р < 0,05) уменьшение степени варьирования результатов определения

E-P0K при использовании фиксированных эритроцигов.

Пример 3. В параллельном опыте проверяют не изменяется ли специфичность выявления Е-РОК при использовании фиксированных по предлагаемому способу эритроцитов барана в сравнении с нативными, Опыт ставят следующим образом.

Иве одинаковые пробы лимфоцитов, выделенных по методике примера 1, истощают бараньими эритроцитами: одну — нагивными, другую - фиксированными; количество эригроцитов, использованных дпя

"истощения, одинаковое — 100 млн. эригроцигов на 20 млн. лимфоцитов. В надосадках обеих проб в реакции роэеткооб8629

1S

28,0к

0,9

13 62

2,80

3,26 е

1, 16%

34,6+

1,4

29,7j

1,3

35,8+

2,1

38,3к, 1,1

6,49ф

2,20%

14,90+

3, 10%

31,81

I,О

32,8t

1,4

27,0+

0,9

35, 2+

1,0

36,0+

1,9

Составитель С. Малютина

Редактор Л. Повхан Техред Ж.Кастелевич Корректор M. Шарошн

Заказ 7619/4 Тираж 690 П одписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 разования с нативными эритроцитами барана по тому же способу определяют ко- личество E-POK. Получают следующие результаты: количество Е-POK после "истощения" нативными эритроцитами снижается с 32,8t1,6 до 4,1+0,7; количество

Е-POK после "истощения фиксированными эритроцитами снижается с 31,8 1,1 до

3,4+0,2.

Эти результаты показывают, что

Е РОК человека одинаково реагируют с нативными и фиксированными эритроцитами.

Проверка специфичности выявления

Е-POK с фиксированными эритроцитами

Формула изобретения

Способ определения Е-розеткообразуюmHx клеток путем смешения суспензий. эритроцитов барана и пимфоцитов с последующим инкубированием смеси и подсчетом розеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, эритроциты перед смешением об«9 6 путем микроскопии мазка, окрашенного по Браше, подтверждает специфичность выявления E-POK в реакции с фиксированными эритроцитами.

Предложенный способ фиксации эритроцитов барана обеспечивает ax стабилизацию и пригодность для определения Е-POK человека. При этом не изменяется caela фичность выявления Е-POK. Способ обеспечивает снижение вариабепьности результатов определения Е POK человека иэмю особенностей различных партий нативных, бараньих эритроцитов и их нестойкости, а также экономию времени на подсчет кскцентрации эритроцитов в каждой партии. рабатывают ацетальаегндом при концентрации эритрацитов 9,011,0% и ацетальдегила 7,2+0,1% при рН 7,0-7,2 и 20з5 25 С 22-24 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Фримель Х. Иммунопогические методы. M., Мир, 1979, с. 503.