Способ диагностики демиелинизации нервной ткани

 

ОПИСДНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскмк

Социалистических

Республик

< 874О32 (61) Дополнительное к авт. свил-ву— (22) Заявлено 18.07. 78 (21) 2646599/28- 3 с присоединением заявкк №вЂ” (23)Приоритет (51)М. Кл.

А 61 В 10/00

)аеударстеениый комитет

СССР вв делам изебретеиий и открытий

Опубликовано 23 ° 10.8! . Бюллетень № 39

Дата опубликования описания 25. 10.81 (53) УДК 616. 8 (088.8) (72) Авторы изобретения

П. Г. H«".çàðîâ и К. Ф. Перевозчикова

У

%, Ордена Трудового Красного Знамени научйо-. исследовательский институт экспериментальной медицнны (71) Заявитель (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДЕ! !ИЕЮПЫИЗАЦИИ НЕРВНОЙ

ТКА1!И

Изобретение относится к биологии преимущественно к иммунопатологии, и может быть использовано в медицине для оценки демиелинизирующей активности сыворотки крови людей и животных с демиелинизирующими заболеваниями нервной системы.

Известен способ диагностики демиелинизации нервной ткани, заключающийся в культивировании в течение

48 ч кусочков коры головного мозга то взрослых животных (крыс) в среде, содержащей испытуемую сыворотку больного, с последующей гистологической обработкой и изучением кусочков под микроскопом !.1 .

IS

Однако непригодность этого способа для массового применения в лечебньм учреждениях обусловлена тем, что нервная .ткань чувствительна к ма«20 лейшим изменениям условий среды. Сначала ткань должна адаптироваться к условиям среды, для чего ее выдерживают 24 ч в синтетической питатель

-2 ной среде, состоящей из ингредиентов высшей степени химической чистоты, с добавлением ростостимулирующих факторов биологического происхождения, при поддержании строго определенного состава газовой фазы культур. Часть культур (20-30Z) к концу исследования гибнет, несмотря на соблюдение всех требований по их поддержанию, в связи с чем необходимы затраты на постановку дополнительных (запасйых) культур.

По истечении первых 24 ч инкубации среду асептически заменяют свежей1 добавляя при этом исследуемую сыворотку больного и комплементs и кусочки ткани культивируют s присутствии сыворотки еще 24 ч. Общая продолжительность инкубации, таким образом, составляет 48 ч. После этого кусочки ткани фиксируют, производят гистологическую обработку, делают срезы ткани на микротоме, окрашивают их и изучают под микроскопом, 874032

% подавления включения холестерина

- Н сыворотками

Включение холестерина- Н (имп/мин) 45 Иссле дуемые сывосло ульротки

От жи-., вотных с ЭАЭ 120

880Ф129 85

Морфологическая оценка дпмиелинизации имеет при этом качественное выражение (степень демиелинизации выражается в крестах, например вЂ,+, ++, +++), поэтому точность оценки зави-" сит от квалификации исследователя, Таким образом, известный способ затягивает процесс диагностики и имеет сложную технологию.

Цель изобретения — ускорение и 1в упрощение способа.

Указанная цель достигается тем,что при осуществлении способа путем инкубации крови обследуемого с нервной тканью взрослых животных,инкубацию ведут в течение 1-3 ч в присутствии НЗ холестерина, определяют его включение в нерв ную ткань и при снижении включения по сравнению с контролем диагностируют демиелинизацию нервной ткани.

Способ осуществляют следующим образом.

Инкубацию кусочков нервной ткани с исследуемой сывороткой и комплементом производят в течение 1-3 ч в присутст» вин холестерина — Н. Оценка демиелинизации при Iом основана на измерении снижения радиоактивности кусочков, пр нзводимом с помощью бета-счет-. чика. Концентрация холестерина - Н в среде мояет составлять от 0,5 до

3 микрокюри/мл.

Холестерин- Н включается в миелиновыа оболочки кусочков нервной ткани, после че;-о производится индикация гов35 реждения миелина (демиелинизации) исследуемо". сывороткой.

Вместо гистологической обработки кусочки ткани промывают в физиологическом растворе в течение часа для удаЯ 40 удаления избытка холестерина -Н, после чего радиоактивность кусочков ткани измеряют с помощью бета-счетчика.

H p и м е р. Производилось исследование демиелинизирующей активности сывороток морских свинок, больных экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом (ЭАЭ) на пике заболевания, при наличии выраженной неврологической симптоматики (исхудание, паралич нижних конечностей, нарушение функции тазовых органон) .

Сыворотки животных сохраняли замороженными при -20 С до использования. о

Непосредственно перед использованием сыворотки разморажнвали и прогре- 55 вали при 56 С 30 мин.

Кусочки нервной ткани размером, 1 лмэ вырезали из коры мозжечка взрослых крыс,(возраст около 2 месяцев) и помещали по 5-10 шт. в стеклянные флаконы (типа пенициллиновых) с 1 мл питательной среды.

Состав среды: среда Игла с добавлением 3%-ного раствора глютамина (1мл на 100 мл среды) и 40%-ного раствора глюкозы (1,6 мл на 100 мл среды) — 60%, исследуема. сыворотка — 25%, комплемент свежая сыворотка морской свинки -5-15%. Общий объем сыворотки в питательной среде доводили до 40% нормальной сывороткой морской свинки, прогретой при 56 С 30 мин. Кроме того, в среду добавляли раствор холестерина — Н до конечной концентрации

0,5-3 микрокюри на мл среды.

Кусочки нервной ткани инкубировали в в этой среде при 37 С в течение 1-3 ч. о

Затем кусочки переносили пастеровской пипеткой на лист фильтровальной бумаги и бумагу помещали в ванночку с физиологическим раствором на

1 ч при комнатной температуре для удаления из ткани невключившегося изотопа. Каждые 20 мин производили смену физиологического раствора.

Затем бумагу высушивали, вырезали из нее участки с кусочками нервной ткани и с помощью бета-счетчика измеряли радиоактивность каждого кусочка.

Для получения сравнительных данных параллельно проводилось такое же исследование, но вместо сыворотки животных с ЭАЭ в питательную среду добавляли сыворотку здоровых животных.

В таблице приведены данные радиоактивности кусочков нервной ткани, инкубированных с исследуемыми сыворотками (импульсы аа 1 мин и % подавления включения холестерина - Н сыворотками животных) .

От здоровых живот ных 120 7813+947 0

Составитель Л. Соловьев

Редактор С. Патрушева Техред А. Савка Корректор Ю. Макаренко

Заказ 9110/7 Тираж 690 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная„ 4

Предлагаемый способ обеспечиваЕт возможность быстрого определения демиелинизирующей активности сыворотки (в течение нескольких часов) у больных с подозрением на демиелинизирующий процесс в нервной системе, что особенно важно для постановки верного диагноза и своевременного начала лечения; высокую чувствительность и объективность, позволяющую выявлять количественные различия с демиелинизирующей активности сывороток; простоту постановки исследования, исключающую сложный и капризный этап культивирования нервной ткани.

Формула изобретения

Способ диагностики демиелинизации нервной ткани путем инкубации крови

874032 6 обследуемого с нервной тканью взрослых животных, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, инкубацию ведут в течение 1-3 ч в присутствии НЗ холестерина, определяют его включение в нервную ткань и при снижении включения по сравнению с контролем диагностируют демиелинизацию нервной ь ткани .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизс

t5

1 Kiernan 1. А., Pett i t О. R. Органная культура центральной нервной системы взрослых крыс;"Ехр. Менго1"

1971, т. 32, с. 111-120.