Иммунодиагностикум

 

Союз Советскнк

Соцнапнстнческнк

Респубики

О П И С А Н И Е („, д()щ у

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22)Заявлено 21.05.80 (21) 2927020/30-lg с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23.02.82. Бюллетень № 7

Дата опубликования описания 23 . 02 . 82 (51)М. Кл.

A 61 K 39/00

3ЬаударстинаыН комитет

eCel ае делан кэа4ретекий и открытка (53) УДК 616.995. .428(088.8) (72) Авторы изобретения

А, И. Майоров, В. А. Чижов и P. Г. P (7() Заявитель

Научно-исследовательский институт пу и кролиководства (54) ИИИУНОДИАГНОСТИКУИ

Изобретение относится к акарологии и может быть использовано для выявления иммунитета к отодектозу (ушной чесотке), саркоптозу и нотоедрозу (зудневой чесотке) плотоядных.

Известен клещевой антиген для диагностики и лечения аллергической астмы человека, а также диагностического тестирования и клинической десенсибилизации пациентов с клещевой аллергией $1 $.

В современной акарологии в СССР и за рубежом не разработаны специфические тесты для установления иммунитета у животных против отодектоза, саркоптоза и нотоедроза, в то время, как эти заболевания довольно широко распространены у плотоядных, и пораженность поголовья зверей в отдельных зверохозяйствах колеблется в пределах 10-253.

Цель изобретения - приготовление антигена для иммунодиагностики при отодектозе, саркаптозе и нотоедрозе плотоядных.

Поставленная цель достигается применением антигена из клещей родов

0todectes, Sarcoptes, Notcedres в качестве иммунодиагностикума при зудневой и ушной чесотке плотоядных.

Антиген готовят следующим образом.

Собранных паразитов от больных животных заливают эфиром, после чего

lO процеживают через сито, размер отверстий у которого 0,8 мм. Такой размер ячеи сита позволяет свободно проходить клещам вместе с жирорастворителем (эфиром). Все крупные частицы

15 волос, корочки, струпья и т.д.) ос-. таются на поверхности сита. Такая операция позволяет очистить клещей от посторонних примесей. Клещей отде20 ляют от обезжиривающего растворителя с помощью воронки Бунхнета со слабым всасывающим действием. Клещей промывают 3-ч раза в небольшом количестве обезжиривающего растворителя, а затем

3 90 о высушивают при 18-22 С. Высушенных клещей помещают в ступку с битым стеклом, тщательно растирают и доводят до лорошкообразной массы. Затем порошок, полученный из паразитов, экстрагируют с помощью физраствора в объеме 1:50. Полученная суспензия тщательно перемешивается, фильтруется через бумажные фильтры или марлю с ватой, и полученный фильтрат центрифу гируется при 3000 об/мин в течение

30 мин. Верхний слой сливают и к нему добавляют раствор формалина (из расчета на 100 мл антигена 0,1 мл формалина).

Антиген представляет собой коричневую прозрачную жидкость, свободную от взвешенных частиц. Серологически активен в реакциях диффузной преципитации в агаровом геле (РДПА) и встреч ного электроиммунофореза (ЭИф) .

Реакция РДПА представляет собой агрегацию (соединение) клещевого антигена с сь>врроткой крови в присутствии специфических антител и проявляется в образовании полосы преципитата в слое arapa между лунками, содержащими антиген и имунную сыворотку.

Для постановки РДПА используют испытуемые сыворотки, не требующие специальной обработки. В отдельных случаях для постановки реакции могут быть взяты пробы цитратной крови. По своей простоте метод преципитации в агаре доступен для большинства лабораторий.

Для постановки РДПА применяют, осветленный бактериальный агар в виде

1i-ого геля на стериальном физиологическом растворе. Раствор агара готовят и расплавляют на водяной бане.

Растопленнь>й агар заливают ровным слоем на предметные стекла или в чашки Петри толщиной 3-4 мм. После застывания arapa в нем вырезают круглые лунки диаметром 3 мм и глубиной

3-4 мм так чтобы объем каждой лунки ю з составлял 0,02-0,03 см . Расстояние между соседними лунками должно быть

3-4 мм. Вырезанный агар удаляют с помощью иглы от шприца или отсасывают с помощью пастеровской пипетки.

Лунки целесообразно делать специальным штампом. Необходимо следить за тем, чтобы лунки не сообщались между собой, а в агаровом слое не было трещин. Порядок расположения лунок следующий: вокруг центральной

6567 лунки, содержащей антиген, располагают на равном расстоянии (3-4 мм) шесть лунок для сыворотки.

После заполнения стекла или чашки Петри с агаром помеш>ают в термостат при + 37 C во влажной камере (в с чашке Петри, эксикаторе) .

Предварительное чтение реакции производят через 4-6 ч, а окончатель-!О ное — через 18-20 ч.

При чтении реакции преципитации в агаре стекло рассматривают на темном фоне, в проходящем свете, направленном под углом 45 к объекту. Исо !

5 точником света может служить осветитель микроскопа. Реакция оценивается по степени четкости линии преципитата.

Положительная РДПА характеризуется наличием тонкой, четкой линии преци20 питации между лунками с сывороткой и антигеном. Расплывчатые полосы в геле, диффузные или органические изменения

его прозрачности, а также отсутствие их расценивается,как отрицательный

2s результат РДПА.

Положительный результат РДПА указывает на наличие антител в крови у животных к зудневой или ушной чесотке, т. е. на наличие иммунитета к зр этим заболеваниям.

Отрицательность РДПА свидетельствует об отсутствии иммунитета.

Для выявления животных, невосприимчивых к зудневой или ушной чесотке, 35 можно также применять реакцию встречного электроиммунофореза, Этот метод более экспрессивен.

Для постановки реакции встречного электроиммунофореза на чистоту обез49 жирекную стеклянную пластинку размером 8 х 15 см наливают 30 мл 13-ного горячего раствора Дифко" или аналогичного осветленного бактоагара, приготовленного на буферном растворе, 45 разведенном пополам дистиллированной водой. После застывания в агаровом геле делают лунки при помощи пробойника, соединенного трубкой с вакуумнасосом.

M Диаметр лунок должен быть 1,8 мм, з глубина 2,5 мм, объем 0,02 см, pac— стояние между центрами соседних лунок каждого горизонтального ряда должно составлять 6 мм. Лунки следует располагать не ближе 1 см от края агаровой пластинки.

Для более точного соблюдения дистанции между лунками используют заФормула изобретения

Составитель А. Филиппова

Редактор О. Юрковецкая Техред 3. фанта

Корректор Л. Бокшан

Тираж 717 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 448/9

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 9065 ранее размеченную миллиметровую бумагу, которую кладут под стеклянную пластинку, или же используют направ/ ляющую пластинку из оргстекла с просверленными для пробойника отверстиями.

Буферн.ie растворы, применяющиеся для постановки РИЭОФ, должны иметь рН 8,6-8,9. Вороналовый буфер готовят путем растворения 10,32 г мединала 10 в 300 мл дистиллированной воды с последующим добавлением 1,84 г веронала.

Раствор помешивают и держат в водяной о бане при 40 С до полного растворения веронала. 15

Кровь у животных берут до кормления в стеклянные капилляры, которые с одного конца закрывают пластилином и центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 5 мин. го

Каждую испытуемую сыворотку вносят в отдельную лунку четных вертикальных рядов, причем в последние лунки рядов вносят соответственно контрольные положительную и нормаль- г5 ную сыворотки. Антиген закапывают пастеровской пипеткой во все лунки нечетных рядов, после чего пластинку помещают в камеру прибора для бумажного электрофореза марки ЭФ-2 или эо аналогичного прибора так, чтобы ток проходил параллельно горизонтальным рядам лунок.

К краям пластинки прикрепляют полоски фильтровальной бумаги и опускают их свободные концы в ванны, заполненные буферным раствором. Камеру закрывают крышкой и подключают к выпрямителю тока так, чтобы положительный полюс был справа (со стороны 4о крайнего вертикального ряда с сыворотками). Сила тока должна составлять t0-15 мА на каждую стеклянную пластинку.

Результаты реакции анализируют че- <5 рез 30-60 мин после размещения пластинки в силовом поле. Для этого пластинку осматривают в косопроходящем

67 6 свете (осветитель ОИ-18 или другие источники света) на емном фоне.

Положительная реакция встречного электроиммунофореза характеризуется наличием тонкой, четкой линии преципитации в горизонтальных рядах геля на середине расстояния между лунками с сывороткой и антигеном. Расплывчатые полосы в геле, диффузные или ограниченные изменения его прозрачности, а также отсутствие изменений расцениваются как отрицательный результат.

Положительный результат реакции встречного злектроиммунофореза указывает на наличие специфических антител у животных к ушной или зудневой чесотке.

Использование изобретения позволит выявить иммунных животных к,зудневой и ушной чесотке, а при формировании стада - отбирать поголовье зверей, невосприимчивых к отодектоэу, саркоптозу и нотоедроэу. Это даст возможность увеличить деловой выход молодняка, снизить затраты на ветеринарно-санитарные мероприятия по борьбе с указанными заболеваниями, предотвратить ущерб от падежа.

Предлагаемые методы выявления иммунитета с помощью РДПА и встречного электроиммунофореза позволяют создать поголовье зверей, невосприимчивых к отодектозу, саркоптозу. и нотоедрозу.

Применение антигена, приготовленного из кпещей родов Otodecter Sarcoptes, Notocdres, в качестве иммунодиагностикума при зудневой и ушной чесотке плотоядных.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Патент Франции 11 2 145376,кл. А 61 К 23/00, 1973.