Способ получения олигодезокситиотимидилатов

 

О h И С A Н И Е >910651

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советсинк

Соцнапнстнчесинк

Респубпни (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30. 09. 76 (21) 2414492/23-04 с присоелинением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 07 ° 03.82. Бюллетень Рй 9

Дата опубликования описания 1 0 .03. 82

jI5I ) Nl. Кл.

С 07 Н 19/06

9кударстмнанб квинтет

CCCP ав аннан изебретеннй и вткрмтнй (53) УДК 547. .455.07 (088.8) В.Ф;Кобзар

В.П. Кумарев, В.С. Богачев, Л.В. (72) Авторы изобретения с

Институт цитологии и генетики Ced oго отделение l

АН СССР (Vl ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОДЕЗОКСИТИОТИИИДИЛАТОВ

НОСНОВ 0 ТЬ

0 О—

/, О Ы вЂ”--0,0 l

0 S — "- — ц-Н

OR

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения олиго1 где Th - остаток тимина;

R - водород, остаток тиофосфата или S-2-цианэтилтиофосфата; и = 0; 1; 2; 3. дезокситиотимидилатов общей формулы

Олигодезокситиотимидилаты являютс тиоаналогами природных полидезоксирибонуклеотидов и способны успешно заменять их в ряде важных биохимичес

4 серы понижена настолько что она не способна участвовать ни во внутримолекулярном взаимодействии с собственной 5 -ToS-группой, ни .в межмолекулярных реакциях до снятия защиты.

Недостатками этого способа являются низкий выход олигонуклеотида, за.грязненность олигонуклеотида предыдущим олигомером и продуктами деградации исходного и образующегося компонентов; длительное время синтеза, а также проведение процессов выделения и очистки на каждой стадии синтезированного: олигомера

Скорость образования олиготимидилатов в случае применения триэтиламмонийных солей исходного тимидин-3 -фосфотиоата и мономера низка даl же при повышенной температуре..

Целью изобретения является упрощение способа получения и повышения выхода олигодезокситиотимидилатов.

Цель достигается тем, что олигодезокситиотимидилаты формулы 1 получают путем взаимодействия литиевой соли тимидин-(или олиготимидилил)"

1 1

-3, -фосфотиоатов с 2,5 -дидезокси-5 -йод-производными тимидина общей формулы

3 910651 ких систем, например в ферментативных . реакциях, катализируемых PHK-зависимой ДНК-полимеразой (ревертазой), полинуклеотидкиназой и различными фосфодиэстеразами.

Известны два способа получения олигодезокситиотимидилатов. Ключевой

I стадией в них является создание 3,5-фосфотиодиэфирной связи между остатками тимидина, входящими в состав олигомера. Для этого используют моно меры особого типа, содержащие в одной молекуле как электрофильную группу, способную замещаться (тозилат), так и нуклеофильную (тиофосфат), которая способна атаковать освобождающееся место.

Образование 3,5 -фосфотиодиэфирной связи происходит в результате реакции замещения тозилата в 5 -ToS1»

-тимидин-3 -0- цианэтилфосфотиоатах(1) или в 5 -ToS-тимидин-3 -S-2-цианэтилфосфотиоатах (21 тиофосфатом тимидина или олиготимидилата.

Наиболее эффективным является спо- 2> соб (2). Пентатиотимидилат в,этом случае получают взаимодействием 1 эквивалента триэтиламмонийной соли тимидин-(или олиготимидилил)-3 -фос1 фотиоата с 1-5 эквивалентами той же соли - 5 -ToS-тимидин-3 -S-цианэтилфосфотиоата в диметилформамиде в присутствии трибутиламина.

По окончании реакции проводят щелочной гидролиз цианэтильной защиты. зз

Олигомер выделяют и очищают хромато- . графическими методами. Полученный продукт со свободной. 3 -фосфотиоатной группой вновь обрабатывают мономером. Таким образом, производят ступенчатое наращивание олигонуклеотидной цепи. Средний выход на стадию составляет 304. время реакции 1-4 суток при 30-37 С, общий выход пентатиотимидилата в расчете на исходный ти4$ мидин-3 -фосфотиоат 0,73.. Использование в этом -способе мономеров с

5-цианэтилфосфотиоатными группами дает меньше побочных продуктов, чем в случае О-цианэтилфосфотиоатных про50 изводных (1) так как нуклеофильность где Th имеет приведенные выше зна" чения;

К - водорЬд, остаток Li+-соли !

S-2-цианэтилфосфотиоата, в диметилформамиде при комнатной температуре с последующими обработкой полученного олиготимидилата щелочью и взаимодействием с новым мономером.

Целевой продукт. выделяют известными приемами. Продукт образуется практически r, количественным выходом, поэтому его не следует подвергать хроматографической очистке и можно использовать на следующей стадии синтеза

910651

НОСНОВ 0 Th

-- О

О, 00 Я8 С Н4Сж 0+ Щ

so ть

НОСН2 О тЬ

0 . 0ф ЗН4С

2де Th - остаток тимина.

Реакция тимидин-3 -фосфотиоатов с 2,5 -дидезокси-5 -йодтимидин"3-S-2-цианэтилфосфотиоатами протекает в два раза быстрее,чем в известном способе для соответствующих толуолсульфонильных производных. Это позволило сократить время реакции, и сни- вить температуру реакционной смеси, Зз до 18-25оС.

Использование тимидин-3 -фосфо-! тиоатов в виде литиевых солей позволило уменьшить разложение реагентов и продуктов. Литиевые соли по сравнению с аммонийными солями и солями щелочных металлов оказались наиболее реакционноспособными. Использование почти эквивалентных соотношейий ре-.— агентов. (3-53,-ный избыток) при от;сутствии побочных продуктов и практически количественноМ выходе олигонуклеотида существенно упрощает процесс его выделения. Ионообменную хроматографию применяют. только в конце синтеза, а выделение на промежуточных стадиях проводят простым,осаждением продукта ацетоном или при необ" ходимости гель-хроматографией на сефадексах.

ЯДля гидролиза цианэтильной защиты целесообразно использовать гидроокись лития, так как образующуюся литиевую соль олигонуклеотида можно сразу применять на следующей стадии.

Пример 1. 2 -Дезокси-этими" дилил{3" .5 )-5 -дезокси-5 -тиотимидин)-3 "S-2-цианэтилфосфотиоат (1).

Гимидин-3 -фосфотиоат (дилитиевая соль, дигидрат, 0,0386 r, 0,1 ммоль) и 2,5 -дидезокси-5 -тиотимидин-3 е 1

-S-цианэтилфосфотиоат (литиевая соль, 0,053 г, 0,105 ммоль) смешивают в

1 мл диметилформамида, смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Конец реакции определяют методом йодометрического титрованйя тиофосфатных групп и хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе в гради енте йаС8 после щелочного. гидролиза цианэтильной защиты. По окончании реакции к реакционной смеси добавляют ацетон (5 мл), выпавший осадок центрифугируют,. промывают ацетоном (3 х 4 мл), сушат в вакууме. Выход соединения 1 в виде дилитиевой соли

0,0685 г (953). Результаты анализа образца после очистки гель-хроматографией на сефадексе 6-25 в 0,02 И

NH4HC0g приведены в таблице.

Пример 2. 2 -Дезокси- 1тимидилил-(3 - 5 )-дезокси-5 -тиотими-! I дин -З.-фосфотиоат (2).

7 9106 .Соединение 1 из примера 1(0,0685 г, 0;095 ммопь) растворяют в 1 мл 0,5 н. гидроокиси лития, выдерживают 1 ч, нейтрализуют избыток щелочи катионообменной смолой Дауэкс-50 е Н -форме до рН 7, смолу отфильтровывают, фильтрат лиофильно высушивают. Выход соединения 2 в виде трилитиевой соли

0,063 г (98i).

Пример 3. 2 -дезокси -(гимидилил-(3 -!- 5 )-5 -дезокси-5 тио тимидилил-(3 - 5 )5 "дезокси-5 -тиотимидин) -3 -фосфотиаат (3).

Трилитиевую соль соединения 2

<0,063 r, 0,095 ммаль) из примера 2 растворяют при встряхивании в 1 мл диметилформамида, прибавляют раствор литиевой соли 2,5 "дидезакси-!

-5 -иодтимидин-3 -S-2-цианэтилфос. фотиоата (0,050 г, 0,099 ммоль)

1 !!л диметилформамида и выдерживают

1 ч. Продукт выделяют, как в примере 1, используя вдвое большее каличество ацетона, Защиту с тиофосфатной группы снимают так же, как в при2$ мере 2. Выход тетралитиевой соли соединения 3 0,089 г (951). Результаты анализа приведены в таблице.

Пример 4. 2 "Дезакси-(тимидилил-(3 " 5 )-ди-(5 -дезокси"5 -тио- ЗО тимидилил)-(3 - 5 )-5 -дезокси-5 -тиотимидин3-3 -фосфотиоат (4).

Тетралитиевую соль соединения 3 иэ примера 3 (0,089 r, 0,089 ммоль) растворяют в 2 мл диметилформамида З$ при встряхивании. Прибавляют литиевую соль 2,5 -дидезокси-5 -йодтимидин-3 -S-2-цианэтилфасфотиоата (0,0475 г, 0,0935 ммоль) и встряхивают 3 ч. Продукт выделяют как в при- "в мере 3. Выход пенталитиевой соли соединения 4 0,110 г (934}. Результаты анализа приведены в таблице.

Пример 5. 2 -Дезокси- (тими-! дилил-(3 . 5 )-три-(5 -дезокси-5-тиотимидилил)-(3 5)-5 -дезокси-5 -тиотимидин)-3 -фосфотиат (5) °

Это соединение получают, как соединение 4 в примере 4, используя $Ф

0,055 г (0,042 ммоль) пенталитиевой соли соединения 4 и (0,022 г, !

0,044 ммоль) литиевой соли 2,5-!

-дидеэокси-5 -йодтимидин-3 -S"2-цианэтилфосфотиата. Выход гексалити- $$ евой соли соединения 5 0,064 г (931).

Результаты анализа приведены в таблице.

51 Ц

Р и и е Р 6. 2 -Деэокси-(тимидилил.(3 5 )-три-(5 -деэокси-5 —

-тиотимидилил)-(3 5 )-5 -дезокси-5 -тиотимидин (6), Пенталитиевую соль соединения 4 (пример 4, 0,055 г, 0,042 ммоль) и

2,5 -дидезокси-5 -йодтимидин (0,03 г.

0,084 ммоль) растворяют при встряхивании в 1,5 мл диметилформамида. Затем раствор выдерживают еще 6 ч, осаждают олигонуклеотид 6 мл ацетона, осадок центрифугируют, промывают ацетоном (3!!5 мл), высушивают в вакууме, растворяют в 1 мл 0,02 н.

NH4HCOq и наносят на колонку с сефадексом 6-25 (5!!50 см). Элюцию про" водят 0,02 н. ИН4НСО в 204-ном этаноле, рН 7,5. После удаления NH4HCO и воды в вакууме продукт лиофильно высушивают. Выход соединения 6 в виде тетрааммонийной соли 0,063 r (943).

Результаты анализа приведены в таблице.

Для ферментативного расщепления

0,1 ммоль саединения 6 инкубируют с сырым змеиным ядом (0,05 мг) в

0,05 М трис-HCQ буфере и 0,01 М МдСЮ! при 37 С s течение 10 мин. Раствор концентрируют в вакууме, продукты гидролиза выделяют хроматографией на бумаге в системе изопропанол-вода (6:4), элюируя их водой и определяя концентрацию спектрофотометрически. !

При гидролизе образуются 2,5 -ди-! дезокси-5 -тиотимидин-5 -фосфат и

2 -дезокситимидин, которые были идентифицированы по УФ-спектрам и сравнением с контрольными образцами соответствующих кислородных соединений.

Правильность структуры полученных олигодезокситиотимидилатов (1-6) ос" новывается: на количественном протекании реакции образования 3 - 5 -фосфотиодиэфирной связи без каких-либо побочных продуктов; на наблюдении увеличения молекулярного веса и отрицательного заряда, что следует иэ результатов гель-хроматографии и ионообменной хроматографии; на образовании при неполном фосфодиэстеразном гидролизе набора олигонуклеотидов, число которых соответствует числу мономерав исходного олигонуклеотида, что свидетельствует о природном (3 !. 5!)типе связи между ними;

9 910651 на полном расщеплении окислителями фосфотиодиэфирных связей в исходном ч олигонуклеотиде с образованием набо- с ра окисленных мономеров; л

Уф-спектр макс нм (р g MOKC )

НОа

Градиентная элюция" моль

Соединение

267(9600) 0,63

267 (19200) 0, 46

267 (19200) 0,46

266 (28800) 0,32

266 (38400) 0,23

266 (48000) 0,15

266 (48000) 0,16

0,060

О, 062

О, 090

0,120

0,130

О, 138

0,125 сократить затраты времени на одну стадию до 3-4 ч, довести средний вы" ход на стадию до 953, снизить темпе" ратуру и эа счет применения йочти эквивалентных соотношений реагентов и отсутствия побочных продуктов существенно упростить процедуру выделения и очистки продукта. Гель-хроматография на сефадексе

С-25 в 0,02 M бикарбонате аммония в 203-ном этаноле, колонка 5х50 см; расчет вели по формуле Кд = Че-ЧО)V, где V . - объем выхода вещества с колонки; V - свободный объем; V1

= 2,5 г/см Ч колонки. " Ионообменная хроматография на

ДЭАЭ-целлюлозе, колонка О, 5 K 60 см, градиент 0-0,3 И NaC3 в 7 И мочевине, рН 7,5.

Предлагаемый способ получения олигодеэокситиотимидилатов позволяет зю формула изобретения

Способ получения олигодеэокситиотимидилатов общей формулы носн, и Р, 0 8 ——

0 00 ф

S — - — СН Th

OR мерами, содержащими 5 -электроноакf .цепторную группу и 3 -S-2-алкилфосфотиоатную группу, в диметилформамиде и обработку полученного олиготимидилата щелочью с последующим взаимодействием с новым мономером, о тТимидин-3 -фосфотиоат (1) 2 d(Tps Tps С Н Сй) (2) 2 d(Tps Tps) (3) 2 d(Tps Tps Tps) (4) 2 d(Tps Tps Tps Tps) .(5) 2 d(Tps Tps Tps Tps Tps) (6) 2 d(Tps Tps Tps TpsT) где Th - остаток тимина;

R - Н, остаток тиофосфата или

S-2-цианэтилтиофосфата; п=О;1;2;3 включающий взаимодействие тимидин-3 -фосфотиоата с нуклеотидными моно10 на соответствии УФ-спектров полуенного олигонуклеотида Уф-спектрам оответствующих кислородных олигонукеотидов.

Составитель Г. Коннова

Редактор 3. Бородкина Техред С.Мигунова Корректор M. Демчик

Заказ 1021/26

Тираж 390 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д. 4/5 филиал ППП "Патент", г . Ужгород, ул. Проектная, 4

11 910651 12

% л и ч а ю шийся тем, что, с где Th имеет приведенное значение; целью упрощения процесса и повыаения . R - Н, остаток Li -соли S-2выхода целевого продукта, литиевую -цианэтилфосфотиоата ° соль тимидин-(или олиготимидилил)-3-!

Источники информации, -фосфотиоатов подвергают вэаимодейст".. принятые во внимание при экспертизе вию с 2,5 -дидезокси-5 -йодпроизвод- 1. Stanislav Chladek and Joseph ными тимидина общей формулы Nagyvary, Nucleophi1 ic >

ЮСН2 О

Some Nuc leoside Phosphorothioa tes" Я, Am. Chem. Soc., 94, 2079, 1972.

2.4 . Kresse., К. Nagpa 1 and .

Nagyvary Nucleoc Acid. Kes. 2, OR 1 "9. 1975 (прототип).