Способ ингибирования синтеза рибосомных рнк

 

=„.. .

Г.Б.Абдуллаев, Н.Х.Иехтиев и Ф.И.Абдуллаев

1»

Научный центр биологических исследованй

АН Азербайджанской CCP (72) .Авторы изобретения (73) Заявитель (54 ) СПОСОБ.ИНГИБИРОВАНИЯ СИНТЕЗА РИБЬСОИНЫХ PHK

Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике, касается техники ингибирования синтеза рибосомных РНК и может быть использовано в качестве тест-метода для изучения синтеза рибонуклеиновых кислот в клетках высших организмов.

Известен способ ингибирования синтеза рибосомных PHK путем инкубирования биологического материала с раствором селенита натрия (1).

Однако известный способ применим лишь для ингибирования активности

А-формы Фермента только в системе бесклеточного синтеза.

Для опытов in vivo в литературе способы ингибирования синтеза рибосомных РНК неизвестны.

Цель изобретения - ингибирование синтеза рибосомных PHK в нативных клетках.

Указанная цель достигается тем, что в способе ингибирования синтеза рибосомных PHK путем инкубирования биологического материала с раствором селенита натрия интактные бластодермы отделяют от желтка, инкубируют с селенитом натрия, затем добавляют в инкубационную смесь Н3-уридин в концентрации 40-50 мк Ки/мл, отмывают от невключившейся метки, добавляют PHK-носитель, уридин и контролируют степень ингибярования определением фракции PHK-ДНК.

1О

Способ осуществляют следующим образом.

Оплодотворяют зрелую икру, определяют стадии развития по Нейфаху, 1S отделяют интактную бластодерму от желтка, инкубируют с 10-40 шМ селенита натрия, охлаждают, добавляют трихлоруксусную кислоту (ТХУ) и из" меряют радиоактивность.

Инкубацию проводят после отделения бластодермы от желтка в присут" ствии антибиотиков. В инкубационную смесь добавляют смесь Н -уридин в концентрации 40- 0 мк Ки/мл, отмы3 9323 вают от невключившейся метки, добавляют РНК-,носитель 0,1 мл (5 мг/мл) немеченный уридин 0,1 мл (10 мг/мл) и контролируют степень ингибирования определением фракции PHK-ДНК 5 методом Шмидта-Таннгаузера.

Пример 1. Каждой из 20 самок вьюна инъецируют 1 мл гонатропина с концентрацией 5000 ед., после

36-часовой инкубации при 17О С икра 1о созревает, ее выделяют у самок и у

10 самцов сперму, В полученную икру в чашках Петри добавляют суспензию выделенной у 10 самцов спермы, в течение 5 с перемешивают в присутствии д

10 мл дехлорированной водопроводной воды и оставляют на 5 мин. Оплодо-, творенную икру промывают водой до полного удаления полостной жидкости из спермы, Затем помещают в чашки gg

Петри, заливают 200 мл воды, содержащей 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина 50 ед,/мл. Инкубацию оплодотворенной икры проводят при 21 С.

Под микроскопом по методу Нейфаха 2s определяют 10-тичасовую стадию развития. Отделяют зародыши (бластодермы) от желтка, сначала промывая для разрушения оболочек зародышей в 200 мл 0,53-ного раствора трипсина в течение 7 мин, затем .неоднократно промывая зародыши раствором Гольфретера.

ЗатеМ отделенные зародыши помещают в 9 пробирок, заливают буфером Гольф- З ретера двойной концентрации на

0,05 tris-НС1 буфере рН 7,6, в присутствии 100 ед,/мл пенициллина, 50 ед./мл стрептомицина до достижения уровня 1 мл. Переносят пробирки в ледяную баню на 5 мин. В каждую пробирку добавляют Н -уридин из рас9» чета 40-50 мк Ки/мл, встряхивают несколько раз и оставляют в ледяной бане на 10 мин для отстаивания.

В 4-ю, 5-ю, 6-ю пробирки добавляют селенит натрия до конечной концентрации 4 ммоль, в 7-ю, 8-ю, 9-ю пробирки добавляют селенит натрия до конечной концентрации 40 щмоль. Переносят все пробирки в. водяную баню при 21ОС и инкубируют в течение 1 ч.

После инкубации в каждую пробирку добавляют 3 мл раствора Гольфретера при 0 С для остановки реакции, тщао тельно перемешивают содержимое пробирки и осторожно отсасывают раствор до уровня 1 мл. Процедуру повторяют

99 ф три раза для полного удаления невключающейся метки. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора Гольфретера и замораживают в бане (сухой лед+ацетон), дают возможность оттаять в лебяной бане, затем добавляют в каждую пробирку 1 каплю PHK-носителя с концентрацией 5 мг/мл, затем в каждую пробирку добавляют по

20 мкл раствора немеченного уридина (10 мг/мл). Дальнейшую обработку полученной смеси для количественного определения РНК проводят по методу

Шмидта-Таннгаузера, для чего в каждую пробирку добавляют 503 ТХУ до конечной концентрации 10i, гомогенезируют стеклянным пестиком, затем центрифугируют при 4000 об/мин

10 мин. Надосадочную жидкость (кислоторастворимая фракция) переливают в отдельные пробирки, подвергают анализу по методу Ives и др.

Осадок высушивают и проводят гидролиз следующим образом.

В каждую пробирку вливают по

2 мл 0,5 H NaCH, осторожно размешивают, проводят инкубацию в течение

2 ч. Пробирки после гидролиза переносят в ледяную баню, добавляют 50/

ТХУ до концентрации 101, в осадок при этом выпадают ДНК-белки, а в растворе остаются рибонуклеотиды

РНК. Растворы центрифугируют при

4000 об/мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость обрабатывают эфиром до рН 7 и измеряют радиоак- тивность на сцинтилляционном счетчике (SL-30 Intertechnik, France) .

По включению метки в PHK судят. об интенсивности синтеза PHK. Устанавливают, что ингибирование синтеза

PHK на этой стадии не происходит.

Далее об относительной интенсивности синтеза PHK в зародышах на различных стадиях развития судят по включению Н -уридина в тотальную PHK c учетом внедрения метки в суммарную кислоторастворимую фракцию и в фосфорилированные производные уридина.

Пример ы 2-5. Процесс проводят, как описано в примере 1, но рассматривают 11 16,17,18-часовые стадии развития зародышей. Степень ингибирования соответственно составляет 27,2, 21,3, 53,4 и 72,5Ф, т.е. возрастает.

В табл..1 приведены результаты исследований действия селенита натТаблица 1

Стадии раз- Вариант опыта Включение вития, ч (mM Иа S10 ) метки в

PHK

Степень ин-.: гибирования, о

9-10

Контроль

2,g

2,5

+40

2,6

145

3,6

1 0-11

Контроль

140

+40

27,2

4,6

410

15 16

Конт рол ь

390

260

+40

21,3

3 7

4,2

16-17

230

Контроль

53,4

+40

2,0

4,0

265

17-1 8

Контроль

4,0

220

72,5

5 9323 рия на синтез PHK в зародышах вьюна на различных стадиях развития по предлагаемому способу и известному способу (контроль) при времени инкубации 60 мин, S

Данные табл. 1 показывают, что . угнетение селенитом натрия (40 Ф1) синтеза PHK в основном происходит на стадии развития 11-18 ч, когда во всех зародышах, преимущественно, 0 происходит синтез рибосомных- РНК. доза вещества в 4 mM по сравнению с системой in vitro в опытах in vivo неэффективна, что связано со сложной системой клеточных барьеров прони- !5 цаемости.

8 табл. 2 приведены результаты действия различных концентраций селенита натрия на синтез PHK в зародышах вьюна ia vivo на стадии гаструлы 20 при времени инкубации 60 мин.

Данные табл. 2 показывают, что, начиная с 10 пФ1, селенит натрия ингибирует включение метки в PHK. Hau99 6 более сильное ингибирование отмечено при действии 40 mM селенита натрия, Таким образом, в отличие от известного свойства селенита натрия ингибировать активность А-формы ДНКзависимой РНК-полимеразы в системе бесклеточного синтеза РНК, предлагаемый способ позволяет ингибировать селенитом натрия в концентрациях 1040 mM синтез рибосомных РНК в эмбриональных клетках зародышей вьюна на стадии гаструлы.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяет ингибировать синтез рибосомных PHK

in vivo, т,е.. в живом организме, что делает возможным изучение полного цикла синтеза pHGocoMHblx PHK в высших организмах, что ведет к более глубокому пониманию процессов гене,тического аппарата в эукариотических клетках.

932399

Табли ца 2

Включение метки,отнесенное к включению метки в свободные нуклеотиды

Ю

Количество

Включение метки в PHK зародышей, импульс/мин

Степень ингибирования синтеза РНК, Ж.селенита натрия, щЦ

3408

4,8

3395

4,8

2160

3,6

20

2,8

972

2,6

576

49Формула,изобретения

Составитель А. Бражникова

Редактор В.Пилипенко . Техред Т. Маточка Корректор А.Гриценко

Заказ 3774/64 Тираж 883 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета, СССР по делам изобретений и открытий . 113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ ингибирования синтеза рибосомных PHK путем инкубирования ! биологического материала с раствором

:селенита натрия, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ингибирования синтеза рибосомных PHK в нативных клетках, интактные бластодермы отде- ляют от желтка, инкубируют с селени" том натрия, затем добавляют в инкубационную смесь Н -уридин в концент3» рации 49-50 мк Ки/мл, .отмывают от невключившейся метки, добавляют PHKноситель, уридии и контролируют степень ингибирования определением фракции PHK-ДНК.

Источники ийформации, принятые во внимание при .экспертизе

1. Авторское свидетельство CCCP

é 627162, кл. С 12 К 1/02, 1978.