Способ получения гемолизина
Союз . Советскнк
Соцнапнстнческни
Республик
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
3 (5l )M. К.е. ° А 61 К 37/02 3Ъеударстеенный комитет но делам изобретений и открытий Опубликовано 15.07.82. Бюллетень № 26 Дата опубликования описания 17 . 07 .82 (53) УДК615.363. . 018. 51 (088. 8) M.М. Монастырная, Е.И. Вожжова, Э.П. и Г.Б, Еляков (?2) Авторы изобретения Тихоокеанский институт биоорганиче Дальневосточного научного центра (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕМОЛИЗИНА Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения природных физиологически активных белков и пектидов, в частности к способу получения анемонотоксина, обладающего ге5 молитическои активностью, Известен способ получения гемолизина из актинии Stoichactis hei ianthus включающий гомогенизацию цельных актиний, экстракцию в дистиллированной воде, последующую очистку центрифуги" рованием, гельфильтрацию на сефадексе Г-75 и ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе (1 J. Однако этот способ не обеспечивает 15 выхода целевого продукта достаточной чистоты (содержится в качестве примеси три минорных белка ) и высокой удельной активности (8800 ГЕ/мг). Сырьевая база для получения гемолизи- го на ограничена. Цель изобретения — повышение удель" ной активности целевого продукта, его чистоты и расширение сырьевой базы. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения гемолизина из морских актиний, включающему их гомогенизацию, экстракцию дистиллированной водой, последующую очистку центрифугированием и ионообменной хроматографией на KM-целлюлозе, в качестве источника-сырья используют актинию Homostichantus duerdemi и после центрифугирования проводят очистку на политетрафторэтилене. Пример. 1 кг актиний Homostichantus duerdemi, свежевыловленных или хранящихся в замороженном состоянии при -13оС, гомогенизируют (1000 об/мин, 5 мин) при соотношении ткань: вода равном 1:3, экстрагируют в течение 12 ч при 4 С, затеи центрифугируют при 20000 д в течение 1 ч. Прозрачный раствор 1,5 л (15 мг/мл белка по Лоури) концентрируют лиофилизацией до 0,5 и наносят на колонку (3,5 х 100 см) с политетрафторэтиленом (полихром 1), урав" Формула изобретения Стадия выделения Гемолитическая активность белка, ГЕ/мг Выход белка в мг/кг актиний Суммарный экстракт 20000 400 Хтоматография на полихроме 1 242 2000 102 5000 Ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе Рехроматография на КМцеллюлозе 20 12500 ВНИИПИ Заказ 4936/8 Тираж 714 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 94276 новешенным дистиллированной водой, Элюцию осуществляют дистиллированной водой, скорость элюции 120 мл/ч. В результате хроматографии удается избавиться от основной массы баластных белков. фракции, проявляющие гемолитическую активность, объединяют и используют для хроматографии на колонке (1,5 х 30 см) с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-32, Ватман, Англия); уравно-1о вешенной 0,01 M ацетатным буфером рН 6,0. Элюцию белков осуществляют линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 1 М в ацетатном буфере по 0,650 л каждого. Фракции, проявля- 5 ющие гемолитическую активность, объединяют и используют для рехроматографии на КМ-целлюлозе в тех же условиях. Гомогенность гемолизина, полученного по предлагаемому способу, доказывают методом диск"электрофореза в 104-ном полиакриламидном геле в натрий додецилсульфате при рН 7,5 и N -концевого анализа, М -концевая аминокислота гемолизина - серин. 25 Полученные результаты показывают, что препарат гемолизина,полученный предлагаемым способом, является индивидуальным белком. Данные по выходу белка и удельной активности препарата на всех стадиях выделения представлены в таблице. 3 4 Способ позволяет получить препарат, очищенный от основной массы примесных высокомолекулярных белков уже на первой стадии очистки не политетрафторэтилена и высокоочищенный препарат после хроматографии и рехроматографии на карбоксиметилцеллюлозе. Использование высокоэффективного гидрофобного сорбента значительно упрощает процесс получения гемолизина, так как исключается необходимость в применении трудоемкогс и дорогостоящего процесса изоэлектрофокусирования после хроматографии. Сравнения активности белка, выделенного из актинии (0,00 мкг/мл) с активностью белка полученного по известному способу из актинии (0,1 мкг/мл) показало, что предлагаемый способ позволяет получить препарат с более высокой удельной активностью (12500 ГЕ/мл белка). Предлагаемый способ обеспечивает повышение удельной активности целевого продукта в 5 раз,уже на первой стадии очистки сокращает время. его выделения и позволяет получить продукт, являющийся индивидуальным белком, без примесей минорных белков. Способ получения гемолизина из морских актиний, включающий их гомогенизацию, экстракцию дистиллированной водой, последующую. очистку, центрифугированием и ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта, его чистоты и расширения сырьевой базы, в качестве источника сырья используют актинию Homosticantus duerdemi и после центрифугирования проводят очистку на политетрафторэтилене, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Delч1n J P 1solation and Partial Purification of Hemolitic Гох п from Sea Anemone. Stoichaeus helianthus. J, Pha rmaceutical Science, 63, 9, 1478-1480, 1974
