Способ получения глицерин-дегидрогеназы
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ из микроорганизмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, фракционирования сульфатом аммония и терйоинактивации примесных белков, отличагощийс я тем, что, с целью увеличения образования целевого продукта в расчете на литр культуры, снижения продол жительности ферментации и получения фермента со сниженной К для субстрата , в качестве микроорганизмов из вида Aerobacter aerogenes используют штаммы Aerobacter aerogenes DSM 1643 или Aerobacter aerogenes NCIB 418, a после .завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэроб ное культивирование.§ 2.Способ по п. 1, отлича- i- ю щ и и с я тем, что в процессе ана-, эробного культивирования вводят допол| в нительные количества глицерина додостижения 1% его содержания в ереде . .5 3.способ поп. l,oтличaю щ и и с я тем, что в питательную среду вводят биотин в концентрации 50 мкг/л.
(19) (Н) СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК (51) С 12. N 9/04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К IlATEHTY (21) 3271751/28-13 (22) 16. 12. 80 (46) 23.11.83. Бюл. Р 43 (31) P 2952410. 5 (32) 27.12. 79 (33) ФРГ (72) Петер Шталь, Ханс Зайдель (ФРГ)
° и Хервиг Бруннер (Австрия) (.71) Берингер Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (53) 577 ° 15(088.8) (56) 1. Lin E.Ñ., Nagasanik В.
Activation of glycегоl де))уйгоуепаве from Aегоbacter aегоctenes by
monovalent cations.-lornal Biolog.
Chem., 1960, v. 235, М 6, р 18201823.
2. Burton R.Ì. Glycегоl dehydro»
genase from Aегоbacter aегоgenes
N8724. — Methods in Enzymology
Editors S..P.Colowick,N.O.Kaplan, New pork, 1955, v. 1, р.397-400. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ из микроорганизмов
Aегоbac ter aегоgenes посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, фракционирования сульфатом аммония и терйоинактивации примесных белков, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения образования целевого продукта в расче-. те на литр культуры, снижения продолжительности ферментации и получения фермента со сниженной К для субстрата, в качестве микроорганизмов из вида Aегоbacter aегоgenes используют щтаммы Aегоbacter aегоgenes DSM 1643 или Aегоbacter aегоgenes NC1B 418, а после .завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэроб ное культивирование. 6
2. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в процессе ана эробного культивирования вводят допо нительные количества глицерина до. достижения 1Ъ его содержания в среде. Ф
3. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в питательную среду вводят биотин в концентрации
50 мкг/л.
1056909
Изобретение относится к биохииической промышленности в частности к получению ферментных препаратов,и может быть использовано для энзиматического определения глицерина и
его производных (после расщепления последних до глицерина).
Известен способ .получения глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов
Aегоbacter aегоgenes штамма 1033 путем их аэробного культивирования 10 на содержащей глицерин (0,2%) среде с последующей очисткой фермента из экстрактов клеток. Культивирование проводят в течение 18 ч, а вьжод фермента составляет 57,5 ед/л . культуры. Среда культивирования не содержит биотин или дрожжевой экстракт. Величина КА для вйделения фермента не определена точно, но, исходя из значений активности при двух концентрациях субстрата, Kì должна быть меньше, чем 1- 10 М 11) .
Недостатками способа являются необходимость длительного (не менее
18 ч) культивирования клеток, низкий выход фермента в расчете на литр культуры, а также низкая величина Км для глицерина.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов Aегоbacter aегоgenes посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экс- 35 тракции клеток, фракционирования сульфатом аммония и термоинактивации примесных белков. Культивирование микроорганизмов проводят при аэрации в течение 18-24 ч на среде с 1,5Ъщ глицерина. Выход фермента после культивирования в течение 24 ч составляет 83 ед/л среды (2J .
Недостатками известного способа, являются низ кий выход фермента в расчете45 на литр среды, необходимость длительного культивирования, а также получение фермента с высокой К ц, (4 Ф М), свидетельствующий о невысоком сродстве фермента к субстрату. Последнее обстоятельство не позволяет эффективно использовать полученную глицерин-дегидрогеназу для энзиматического определения глицерина при низких концентрациях последнего.
Целью изобретения является увеличение образования целевого продукта в расчете на литр культуры, снижение продолжительности ферментации и получение фермента со сниженной К для субстрата. 60
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов Aегоbacter aегоgenes посредст вом их аэробного культивирования в . содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, функционирования суль фатом аммония и термоинактивации примесных белков, в качестве микроорганизмов из вида Aегоbacter aегоgenes используют штаммы Aегоbacter
aегоgenes DSN 1643 или Aегоbacter
aегоgenes NC1B 418,а после завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэробное культивирование.
В процессе анаэробного культивирования вводят дополнительные количества глицерина до достижения 1% его содержания в среде.
Кроме того, в питательную среду вводят биотин в концентрации 50 мкг/л.
Использование микроорганизмов
Aегоbacter aегоgenes штаммов РБМ
1643 или NC18 418 позволяет значительно увеличть выход глицерин-дегидрогеназы по активности (не менее, чем в 10 раз) даже при исполь зовании известных способов культивирования и выделения фермента. Предложенная в изобретении последователь-ность культивирования — сначала аэробные условия с подводом кислорода или кислородсодержащих смесей в течение фазы логарифмического роста, а затем анаэробные условия, позволяют получить фермент с болы1им выходом, чем при чисто анаэробных условиях.
Увеличение образования глицериндегидрогеназы происходит также при введении на стадии анаэробного куль тивирования дополнительных количеств глицерина, т.е. количеств болы|их, чем потребляется микроорганизмами.
Предпочтительно также вводить в среду культивирование биотин в концентрации 50 мкг/мл вместо дрож- жевого экстракта.
При культивировании в указанных условиях за 6-8 ч ферментации достигается максимальное содержание глицерин-дегидрогеназы, причем окончание культивирования может быть определено по начинающемуся снижению Рн среды. Выход фермента составляет при этом 3000-9000 ед/л среды. Величина К у выделенного фермента состав,ляет 6,6 10 М.
Выделение фермента из биомассы микроорганизмов проводят после разрушения клеток ультразвуком и последующего отделения растворимого фермента с помощью центрифугирования.
Экстракт клеток фракционируют сульфатом аммония. Примесные белки выпадают в осадок при насыщении 35%, а глицерин-дегидрогеназы — при доведении насыцения сульфатом аммония до 45%. Содержащий глицерин-дегидрогеназу осадок растворяют в буфере и нагревают при 60 С в течение 4 мин о
1056909
Составитель В.Муронец
Редактор Н. Рогулич Техред Л.Микеш
Коррек тор A, 3имокосов
Заказ 9369/59 Тираж 523
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Подписное
Филиал ППП Патент, г ° Ужгород, ул. Проектная, 4 для денатурации примесных белков, которые отделяют цен трифугирован ием.
Удельная активность очищенного фермента — 20 ед/мг белка.
Пример 1. Микроорганизмы
Aегоbacter aегоgenes штамма РСМ 1643 культивируют в среде, содержащей, Ъ: пептон из каэеина 0,8; мясной пептон 0,8; К2НРО4 0,3; (НН4) НР04 0,2;
БаС3 0,6; глицерин 1; биотин 50 мкг/л рН 7,0. Культивирование проводят при 10
37 С, продувании воздуха и перемео шивании в 10-литровом ферменте. В ферментер подают 300 л воздуха в час до окончания фазы логарифмического роста. Интенсивность перемешивания 15
300 об/мин.
При завершении фазы логарифмического роста прекращают доступ воздуха и начинают добавление глицерина.
При этом концентрация глицерина возрастает от 0,3 до 1,0Ъ при окончании ферментации, протекаицей за 6 ч.Количество полученной биомассы составялет 10 г/л, а активность глицериндегидрогеназы — 9000 ед/л.
Полученную суспенэию культуры обрабатывают в аппарате, генерируюц„ем ультразвук, в течение 3 мин. Разру-.шенные клетки центрифугируют для отделения нерастворимых компонентов и определяют активность глицерин- 30 дегидрогенаэы в надосадочной жидкости
Для дальнейшей очистки экстракт фракционируют сульфатом аммония, доводят насыщение раствора сульфа- 35 том аммония до 35Ъ и отделяют баластные белки центрифугированием, затем доводят насыщение до 45% и отделяют осадок, содержащий глицерин-дегидрогеназу. Осадок фермента растворяют в 0,1 М фосфатном буфе1ре с рН 7,0, содержащем 0,85Ъ МЫСЫ. Раствор нагревают при 60"С в течение 4 мин для инактивации примесных белков,. которые отделяют центрифугированием. Прозрачный раствор содержит глицерин-дегидрогеназу с удельной активностью 20 ед/мг и Kù для глицерина 6,6 (О М.
Актив ность глицерин-дегидрогеназы определяют спектрофотометрически при 366 нм по образованию НАДН в ходе ферментативной реакции. Реакционная смесь общим объемом 3,05 мл содержит 2,65 мл буфера с рН 10 (0,12 М NaHCOy и 0,04 М (NH4)SO4), 0,1 мл 1 О М раствора НАД, 0,2 мл
1,5 М раствора глицерина и 0,1 мл экстракта или раствора фермента, разведенного в соответствии с его активностью. Реакцию начинают добавлением глицерина.
Пример 2. Культивирование и выделение фермента проводят,как описано в примере 1, но в качеетве микроорганизмов используют штамм
Aегоbacter aегоgenes NC1B 418 (обозначаемый также как Entегоbac-.
ter aегоgenes). Длительность культивирования составляет 8 ч. Активность глицерин-дегидрогеназы
4000 ед/л культуры.
Применение предлагаемого способа позволяет в 50-100 раз увеличить выход глицерин-дегидрогенаэы в расчете на литр культуры, снизить время культивирования в 3-4 раза, а также получить фермент с величиной
К 6,6 (О М, которая в 60 раз ниже, чем величина Км при других способах получения глицерин-дегидрогеназы. Получение глицерин-дегидрогеназы с более низкой величиной К позволяет более эффективно использовать этот фермент, особенно, в аналитических целях.
