Способ выращивания ортомиксовирусов

 

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ОРТОМИК: СОВИРУСОВ в среде культивирования в, ; присутствии стимулятора репродукции вирусов, отличающийся I teM, что, с целью повышения выхода i вирусов, в качестве стимулятора ре; продукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацбтш1бутан или нитрозомётилмочевину в концентрации 125 или 1-20 мкг/мл соответственно, при этом вирусы обрабатывают стимулятором до внесения в среду культивирования . (Л С

аюЯ0 ао

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, Н ARTOPCKONIV СВИДВТВВСТВУ с

ГОСУДАРС.ГВЕННЫЙ КОМИТЕТ ОООР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРИТЬЙ (21) 3393261/28-13 (22) 23.12.81 (46) 23.03.84. Бюл. У ll (72) Н.Б.Лхматуллина, М.Х.Шигаева, Н.И.Деревцова, Д.А.Абдукаримова и К.Г.Мустафин (71) Институт микробиологии и вирусологии ЛН Казахской ССР и Казахский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. С.М.Кирова (53) 576.858(088.8) (56) 1. Заявка Великобритании

Ф 1279859, кл. С 6 F, 1961.

2. Авторское свидетельство СССР

У 610864, кл. С 12 N 7/00, 1977 (прототип).

Зав . С 12 И 7/ОО// С 12 tl 7/ОО;

С 12 К 1/.91 (54) (57) СПОСОБ ВЫРЛЦИВАНИЯ ОРТОИИК; СОВИРУСОВ в среде культивирования в, .присутствии стимулятора репродукции вирусов, отличающийся

: тем, что, с целью повьппения выхода

:вирусов, в качестве стимулятора ре:продукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацетилбутан йли нитрозометилмочевину в концентрации 125 или 1-20 мкг/мл соответственно, при зтом вирусы обрабатывают стимулятором до внесения в среду культивирования.

1081208

Таблица 1

Кратность повьппения

ЕЕ ЭНД50

Концентрация

ДАБ, мкг/мл

Экспозиция, ч

Титр РГА

Штаммы

Конт- Опыт роль

Конт- Опыт роль

ВПЧ

512

1024 8,3

1024 8,3

2048 8,3

4096 8,3

4096 8,3

2048 8,3

512 8,3

1024 7,6

1024 7,6

9,9

512

i0,1

5!2

398

10,9

512

794

11,2

512

631

100

512

10. 3

512

MSN

512

9,1

20

512

9,8

139

Изобретение относится к вирусологии и касается способа выращивания ортомиксовирусов.

Известен способ выращивания вирусов в присутствии стимулятора репродукции вируса, в частности полисахаридов, продуцируемых Escherichia

coli выращенной в условиях лимитирования по лизину Г1 1.

i0

Известен также способ выращивания ортомиксовивусов в среде культивирования в присутствии стимулятора репродукции вирусов — липидных экстрактов печени и почек крыс (2 3. 15

Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода вирусов °

Целью изобретения является повышение выхода вирусов.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу вйращивания ортомиксовирусов в среде культивирования в присутствии стимулятора репродукции вирусов, в качестве стимулятора репродукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацетилбутан или нитрозометилмочевину в концентрации

1-25 или 1-20 мкг/мл соответственно, при этом вирусы обрабатывают стиму- 30 лятором до внесения в среду культивирования.

Способ осуществляют следующим образом.

П р и и е р ). Вирусы гриппа, штамм WSN и штамм Вейбридж(ВПЧ ) раз-. множают в хорионаллантоисной полости 10-11 дневных куриных эмбрионов °

Вирус перед заражением обрабатывают

1,4-бис-диазоацетилбутан (ДАБ 1 в конечной концентрации 25 20, 16, 14, 12, 10 и 1 мкг/мл. Навески ДАБ раст. воряют в фосфатном буфере с рН 6,0, соединяют с суспензией вируса и инкубируют при комнатной температуре, периодически встряхивая. Контакт вируса с ДАБ длится 1 и 2 ч. Затем обработанный и необработанный вирус титруют до 10 и по 0,2 мл WSN u

0,1 мл ВПЧ каждого разведения вводят в аллантоисную полость 10-11 дневного куриного эмбриона. Через 48 ч

WSN и 24 ч ВПЧ инкубации при 37 С эмбрионы вскрывают и по характеру агглютинации эритроцитов на дне пробирки судят о наличии вируса. Гемагглютинирующую активность учитывают по реакции гемагглютинации на плексигласовых пластинках с куриными эритроцитами. Инфекционные титры вируса рассчитывают ло методу Рида и Менча и выражают в Р ЭИД . О стимуляции репродукции судят йо соотношению титров ннфекционности обработанного и необработанного вируса.

Результаты влияния ДАБ на размножение ортомиксовирусов в куриных эмбрионах приведены в табл.1.

1081208

Титр РГА 8$ ЭИД

Концентрация

ДАБВ мгк/мл

Экспо

П1таммы зиция, ч

Опыт Конт- Опыт роль онтоль

2048

512

10,0

512

2048

631

2048

512

10,3

50 1

512

1024

7,6

9,6

100

512

1024

7,6

8,7

Ъ- т

Обработка вируса низкими концентрациями ДАБ повышает репродуцируе-... мость инфекционного вируса. Наибольший эффект наблюдается при обработ-! ке 14 мкг/мл ДАБ в течение 2 ч, когда выход вируса увеличивается в

794 ВПЧ и 631 MSN раз.

Пример 2. Вирусы штаммов

ЮИ и ВПЧ культивируют аналогичным образом, а обработку проводят нитТаблица 2

Концент,Штаммы рация

HIM мкг/мл

Титр РГА

ЭкспоКратность повышения

90 зиция, ч КонтКонт- Опгт роль

Опыт роль

ВПЧ

1024

8,5

8,7

1,6

2048

8,5

9,5

10,0

2048

8,5

9,8

20,0

1024

8,5

9,0

3,0

8,5

20,0

2048

9,8

2048

8,5

10,0

32,0

Ii3

512

8,5

8,6

9,4

8,5

1024

8,0

1024

8,5

I0,0

9,5

512

8,6

1,3

512

1024

8,5. 8,9

2,5

512

1024.

8,5

8,9

2,5

0 512

1 512

2 512

0 512

1 512

2 - 512

0 512

1 512

2 512

0 512

Продолжение табл. 1

Кратность повышения

ЭНДУ

7,6 251

7,6 10,4

: розометилмочевиной в концентрации

Ь 20, 10, 5 и 1 мкг/мл. Контакт виру20; са с НМИ длится 0,1 и 2 ч при комнатной температуре и периодическом встряхивании. Дальнейший ход экспериментов с обработанным и необработанным

Ф вирусом сходен с примером 1.

25 . Результаты влияния НИИ на размножение ортомиксовирусов в куриных эмбрионах приведены в табл.2.

1081208

П.одолжение табл.

Е Э1 Д„.о

Титр РГА

Экспо зиция ч

Кратность повышения

ЭИД .р

Концентрация

ДАБв мгк/мл

Штаммы

Опыт Конт- Опыт роль нт-. ль

20,0

7,7

1024

512

° 0

WSN

8,3

7,9

7,4

1024

i6,0

8,6

7,4

2 512

31,6

8,9

2048

13,0

7,4

2048

512

25,0

8,8

7,4

512

6,3

8,2

7,4

512

О 512

8,0

7,4

5I2

512

12,6

8,5

7,4

1024

2 512

0 512

1 512

2 512

7,6

7,4

512

3,2

1024

4,0

1024

8,0

7,4

Т а б л и ц а 3

БОЕ/мл

Концентрация

ДАБ, мкг/мл

Экспозиция, ч

Кратность повышения, БОБ/мл

Штаммы

Вирус не Вирус обраобработан ботан

1212 10

1,3 10

2,0 10

5,2 " 10

1,4 ° 10

ВПЧ . 25

234,6

92,9

1,4 " 10

142,8 аибольший стимуляционный эффект обнаружен при обработке 10 мкг/мл

НИМ в течение 2 ч, когда выход вируса превышается в 32 ВПЧ и 25 MSN раз. 35

Пример 3. Вирусы штаммов

ИИ и Вейбридж размножают в культуре клеток куриных фибробластов ° Обработку вируса проводят ДАБ в кон- ; 4р центрации 25, 20 и 26 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая.

Двухсуточные культуры куриных фибробластов в матрасах объемом 4 мл заражают по 0,5 мл соответст- ., вукпцих разведений обработанного и необработанного вируса, выдерживают при комнатной температуре 1 ч. Затем инокулянт удаляют, а клеточный пласт промывают раствором Кэнкса и покрывают средой 199 с 1,8Х агаром Дифко инкубируют при 37 С в течение 3—

5 сут и подсчитывают количество бля.шек. Титр вируса выражаегся в единицах бляшкообразования (БОЕ/мл ).

Результаты влияния ДАВ на репродукцию ортомиксовирусов в культуре куриных фибробластов приведены в табл.3.

Продолжение табл, 1081208,5 * )0 7,6 " 10 . З04, 25

),2 107 )9,0 i )О

8З,З

1 ) 10 1 4 10

В

I27 3

l6

Экспози- БОЕ ция, ч

Вирус не обработан

Концентрация

HMM мкг/мп

/мл Кратность повышения, Вирус обра- БОЕ/мл ботан

Штаммы

ВПЧ

1,4 " 10 1,8 ° 10 12,8

1,4 10. 2,8 ° 10 20,0

1,4 ° 10

2,2 ° 10 15,7

1,2 10 1,6 10 13,3

7 а

WSN

1,2 10 2,5 10 20,8

2,3 10

107

l9,2

Использование предлагаемого спо- полностью исключить вероятн соба выращивания ортомиксовирусов. сения бактериального загряз позволит. увеличить урожаи вируса в среду культивирования вирус

Составитель,:".Смирнова

Редактор Н.Рогулич Техред y,дубинчак Корректор Л.Пилипенко

Заказ 1478/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Обработка вируса низкими концент:рациями ДАБ повышает выход вируса и в условиях заражения культуры клеток. Наибольший эффект ДАБ оказывает в концентрации 25 мкг/мл при экспозиции 2 ч. Бляшкообразующая способность такого вируса превышает контроль в 234 ВПЧ и 304 MSN раза.

Пример 4. Вирус получают аналогичным образом, обрабатывают ф

Максимальный эффект НММ обнаружен в концентрации 20 мкг/мл, когда бляшкообразующая способность изучаемых вирусов превышает контроль в 20-23 раз ° НИМ в концентрации 16, 20 н 25 мкг/мл

2 ч прн комнатной температуре, периодически встряхивая. Дальнейший, ход экспериментов с обработанным и

1необработанным вирусом сходен с при мером 3.

Результаты влияния НММ на репро" дукцию ортомнксовирусов в культуре куриных фибробластов приведены в

1табл.4.

Таблица 4

«В

200-800 раэ в зависимости от клеточной системы, используемой для выращивания вирусов (по известному спо-. обу в 5,4 pasa), снизить трудоем45 ость эа счет приготовления стимуляторов из коммерческих препаратов, ость вненения в ов.