Способ и.и.дзержинской прогнозирования течения воспалительного процесса

 

Способ прогнозирования течения воспалительного процесса путем постановки реакции розеткообразования с нейтрофилами, отличающийся тем, что, с целью снижения травматичности способа, у пациентов берут кровь, наслаивают на градиент фиколлуротраста с плотностью 1,073 - 1,083 г/мл далее выделяют фракцию нейтрофилов, инкубируют ее со взятыми в равных частях 2,5%-ным раствором спонтанных эритроцитов барана и 2,5%-ным раствором комплементарных эритроцитов человека , затем определяют число образо вавшихся тотальных Д-нейтрофилов и при увеличении их относительно нормы в 8-19 раз прогнозируют острый воспалительный процесс, a при увеличении § Д-нейтрофилов t в 3-7 раз относительно нормы прогнозируют хроническую форму течения воспалительного процесса.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК у А 61 В 10/00

ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTGPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3604451/28-13 (22) 17.06.83 (46) 23.05.84. Бюл. Р 19 (72) И.И.Дзержинская (71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт нм. Н.И.Пирогова (53) 616.07(088.8) (56) 1. Воробьева А.И., Лорис Ю.И.

Руководство по гепатологии, М.,1979,С, 68-7! .

2. Авторское свидетельство СССР по заявке У 3471980/13, кл. А 61 В 10/00, 1982. (54) СПОСОБ И.И,ДЗЕРЖИНСКОЙ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО

ПРОЦЕССА. (57) Способ прогнозирования течения воспалительного процесса путем поста,SU„„109 325 А новки реакции розеткообразования с нейтрофилами, отличающийся тем, что, с целью снижения травматичности способа, у пациентов берут кровь, наслаивают на градиент фиколлуротраста с плотностью 1,073 - 1,083 г/мп далее выделяют фракцию нейтрофилов, инкубируют ее со взятыми в равных частях 2,5%-ным раствором спонтанных эритроцитов барана и 2 5%-ным раствором комплементарных эритроцитов человека, затем определяют число образо. вавшихся тотальных Д-нейтрофилов и при увеличении их относительно нормы в 8-!9 раз прогнозируют острый воспалительный процесс, а при увеличении

Д-нейтрофнлов I в 3-7 раз относительно нормы прогнозируют хроническую форму течения воспалительного процесса.

С. .

1093325

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для пронозирования течения воспалительного процесса.

Лейкоциты играют основную роль в 5 противомикробной защите. Дефекты в любом из звеньев антимикробных систем нейтрофилов ведут к заболеваниям, характеризующимся частыми повторными инфекциями (I).

1О

Известен способ дифференциальной диагностики острых и хронических воспалительных процессов, заключающийся в том, что разработан метод выделения популяции предшественников гранулоцитарного ряда„ позволяющий диагностиро вать острый и хронический воспалительный процесс 12)

Недостатками способа являются дли- 1-. тельность исследования,травматичность 2О так как берется пунктат костного моз- 1

ra.

Целью изобретения является снижение травматичности способа, позволяющего выделит популяпию клеток, отражаю- 25 щую барьерную функцию костного мозга и изучение ее диагностической ценности

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу прогнозирования 3О течения воспалительного процесса путем постановки реакции розеткообраэования с нейтрофилами, у пациента берут кровь, наслаивают ее на градиент фиколл-уротраста с плотностью

I 073-I 083 г/мл, далее выделяют фракцию нейтрофилов, инкубируют ее со взятыми в равных частях 2,5Х-ным раствором спонтанных эритроцитов и

2,5Х-ным раствором комплементарных эритроцитов человека, затем определяют число образовавшихся тотальных

Д-нейтрофилов н при увеличении их от" носительно нормы в 8-19 раз прогнозируют острый воспалительный процесс, 45 а при увеличении Д-нейтрофилов в

3-7 раз относительно нормы прогнозируют хроническую форму течения воспалительного процесса, Способ осуществляют следующим

50 образом.

У пациента берут кровь, разделение клеток крови производят наслаиванием цельной крови на двойной градиент, 1,070"1,073 Й 1,080-1,083 г/мл с последующим центрифугированием при

0ОС и 1500 об/мин. Получают две чистые. популяции клеток: взвесь лимфоцитов между плазмой и раствором

Фиколл-уротраста с плотностью 1,070l,073 г/мл и взвесь нейтрофилов между двумя растворами с плотностью

1,070-1,073 и 1,080-1 083 г/мл.

0,1 мл нейтрофилов (3 ° 10 клеток к 1 мп ) сливают с 0,05 мл раствора спонтанных эритроцитов барана и

0,05 мл 2,5Х-ного раствора комплементарных эритроцитов человека. Смесь клеток выдерживают 10-20 мин при

0-4ОС. Затем центрифугируют 10-20 мин. при 0-4 С. Вторую инкубацию прово о дят в течение 1-2 ч при 4 † С, центрифигируют при 0-4ОС и 1000-1500 об/ мин в течение 10-20 мин, фиксируют

3Х"ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере pH — 7,4 в течение 10-20 мин. Добавляют дистилированной воды и центрифугируют

5-15 мин при 1000-1500 об/мин. Насадок выбрасывают, оставляют 0,1-0,3 мл взвеси клеток, перемешивают и наносят на предметные стекла, Сушат, фиксируют метанолом в течение 510 мин, красят азур-эозином 5-10 мин.

В препарате просчитывают 200 клеток.

3а роэеткообразующий Д-нейтрофил считают клетку, присоединившую три спонтанных эритроцита барана и три комплементарных эритроцита человека.

Вычисляют процентное и абсолютное содержание розеткообразующих клеток, Пример 1. Пациент А., здоровый донор.

В силиконированную пробирку на

3 мл смеси фиколл-уротраста плотностью 1,073 г/мл и 3 мл смеси плотностью 1,083 г/мл наслаивают 3 мл крови с последующим центрифугированием при

4 С и 1500 об/мин в течение 20 мин.

Получают две клеточные взвеси взвесь лимфоцитов и взвесь нейтрофилов. Взвесь нейтрофилов 3 10 в 0,1 мл соединяют с 0,05 мл 2,5Х-ного раствора спонтанных эритроцитов барана и

0,05 мл 2,5Х-ного раствора комплементарных эритроцитов .<еловека. Смесь клеток выдерживают 20 мин при 4 С с последующим центрифугированием в о течение 15 мин при 4 С. Вторую инкубацию осуществляют в течение 90 мин. при 4ОC. Фиксируют 20 мин ЗХ-ным раствором глютарового альдегида, центрифугируют, осадок наносят на предметные стекла, сушат, фиксируют метанолом 10 мин, красят азур-эозином в течение 10 мин, считают в 6-7 разных полях зрения в иммерсионной системе микроскопа 200 клеток, присоединяют

10933

100 100

3 йе менее 3 ЭБ и 3 ЭЧ. Абсолютное содержание Д-нейтрофилон рассчитывают по формуле

С- г

N—

Ф где Ь вЂ” количество нейтрофилов в

1 мкл периферической крови;

Ф вЂ” нейтрофилы н формуле крови, .; 10 — Д-разеткообразующие неитро- филы, ..

100 1100-показатели, приводящие результаты к объему 1 мкл.

В иммерсионной системе микроскопа н 7 разных полях 3 . розеткообразуюших Д-нейтрофилов содержание лейкоцитов н 1 мкл крови 6750, процентное содержание нейтрофилов в формуле крови 60 . Подставив в формулу цифровые значения получим:

6750 3 60

Д-POH = — — -- — -- — = 121 5 в 1 мкл

100 00 (.норма)

Пример 2,Больнои Х., история болезни Ф 2382, поступил н клинику .по поводу фибропластической индурации

° полового члена. Сопутствующие заболевания — церебральный атеросклероз с явлениями эпилептоидных приступов сосудистого генеза; остаточные явлеI ния полимиэлита.

В силиконированную пробирку на

3 мл раствора фиколл-уротраста платт ностью 1,070 г/мл и 3 мл 1 090 г/мл 35 наслаинают 3 мл крови, центрифугируют в течение 10 мин при О С и

1000 об/мин, В результате оседают на дно эритроциты, взвесь.лимфоцитов образует кольцо над раствором фиколл- 4О уротраста с плотностью 1,070 г/мл, а взвесь нейтрофилов образует кольцо над раствором фикалл-уротраста с плот ностью 1,080 г/мл, Нейтрофилы в количестве 3 10 в 0,1 мл соединяют с 45

0,05 мо 2,5 -ного раствора спонтанных эритроцитов барана - 0 05 мл

2,5 -ного растнара комплементарных эритроцитон человека. Смесь клеток инкубировали 10 мин при О С с после- 50 дующим центрифугированием в течение

10 мин при 0 С и 1000 об/мин, Вторую инкубацию осуществляют н течение часа при 0 С. Фиксируют 15 мин о

3%-ным раствором глюторового альдеги. 55 да с последующим центрифугиронанием при комнатной температуре в течение

5 мин. Осадок. наносят на предмет25 4 ное стекло, сушат, фиксируют 5 мин метанолом, красят asyp-эоэином в течение 5 мин. Считают в иммерсионной системе микроскопа в 5-7 разных полях 200 нейтрофильных клеток, присоединивших не менее 3 ЭБ и 3 ЭЧ. В данном примере содержание Д-POH н периферической крови 2425,5 н 1 мкл (35X ), Е-РОП(промиелоциты) 491,4 н 1 мкл (84 ), Е-POM (миелоцитм), 898,5 в мкл (96 ), Е-POIO(юных)

804,9 в..l мкл (86 ), Е-РОНп(палочкоядерных нейтрофилов) 1467,1 в I мкл (95 ), Е-РОНс (сегментоядерных нейтрофилов) 2455,7 в 1 мкл (98 ).

В данном примере морфологические показатели клеточного состава костного мозга в пределах нормы, .: промиелоциты 5 0 миелоциты 8, палочкоядерные неитрофилы 13,1, сегментоядерные нейтрофилы 21,4.

Костно-мозговой индекс созревания нейтрофилов обозначает отношение молодых гранулоцитарных элементов к зрелым нейтрофилам. В норме он ранен 0,6-0,8. В данном примере он в норме и равен 0,6. Содержание клеток нейтрофильного ряда также в норме и составляет 55,6%. Однако сравнение суммы розеткообраэующих клеток нейтрафильного ряда в костном мозге и периферической крови показало следующее:

Костный мозг (Kl )

6115 6 в 1 мкл (воспаление)

1,0

5767,8 в 1 мкл (норма) Поздние тотальные Д-нейтрофилы

2425д5 в 1 мкл воспаление)

121,5 н 1 мкл (норма) 1

У практически здорового человека

Е-P OFI (в костном мозге) 5788,5 в 1 мкл, Д-РОН (в периферической крови) 121,5 н 1 мкл, У бального человека

E-P0H (в костном могзе) 6115,6 н 1 мкл, Д-POH (a периферической крови) 2425,5 в 1 мкл.

Таким образом, при воспалении изменяется барьерная функция костного мозга и происходит ныход популяции нейтрофилов, участвующей в воспалительной реакции. Количество розеткообразующих поздних тотальных Д-нейтрофилов н периферической крови в нор.. . в 47 раз меньше, чем розеткаобрачу 1093325 щих предшественников нейтрофильного ряда в костном могэе. При активной фазе воспаления содержание поздних

Д-POH в периферической крови увеличивается в 19 раз. При купиравании процесса эти показатели нормализуются °

Пример 3. Больной Н., история болезни !1р 2056, поступил в клинику по поводу болезни Пейрони. Пока- !б затели крови; лейкоциты. 8400 в 1 мкл, сегментоядерные нейтрофилы 4032 в 1 мкл (48 ), палочкоядерные нейтрофилы 252 в 1 мкл (3%) р эозинофихят!

924 в 1 мкл (Il ), лимфоциты 2268 !5 в 1 мкл (27 ), маноциты 924 в 1 мкл (Il ) . В анализе мочи белок 0,093%р лейкоциты 20-30 в поле зрения, солиаксалаты и много слизи, 3 мл периферической крови наслаива 20 ли на 3 мл раствора фиколл-уротраста с плотностью 1,072 г/мл и 3 мл раствора с,плотностью 1,082 г/мл. Центрифугировали в течение 5 мин при

О

0 С и 1000 об/мин. В результате по- 25 лучали две клеточные взвеси: лимфоцитарнрю и нейтройнльную. Нейтрофилы в количестве 3 10 в 0,1 мл соединяли с 0 05 мл 2.5 .-ного раствора ЭБ и 0,05 мл 2,5 .-ного раствора ЗЧ. Смесь клеток инкубировали 15 мин при 0 С с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 0 С и, 1000 об/мин.

Вторую инкубацию осуществляли в течение 2 ч при 10 С. Фиксируют 20 мин

3 -ным раствором глюторальдегида. "..

Центрифугируют !О мин при 1000 об/мин осадок наносят на предметные стекла, сушат, фиксируют 7 мин метанолом, красят азур-эозином в течение 7 мин. 4О

Считают в иммерсианной системе микроскопа в 5-7 разных полях 200 Д-нейтрофилов.

В данном примере содержание Д-POH

378,4 в I мкл (13%), Е-РОП (прамиела- 4 цитов) 14,7 в мкл (78%)р Е-POH (миелоцитов) 274 в 1 мкл(87 ), E-POIO (юных) 277,8 в 1 мкл (63%),Е-РОНп .(палочкоядерных) 816,8 в 1 мкл (59%), Е-РОНс (сегментаядерных) 578 в l мкл (37 ).

В исследуемой периферической крови содержание лейкоцитов 4100 в

1 мкл, сегментоядерных нейтрофилов

2911 в 1 мкл (71%), палочкоядерных нейтрофилов 41 в I мкл (I ) эозинафилов 41 в 1 мкл (1/)р лимфоцйтов

984 в 1 мкл (24%)р маноцитов 123 в

l мкл (3%), Таким образом, все показатели крой ви у больного в пределах нормы. В костном мозге сумма элементов нейтрофильного ряда также в норме и составляет 56,6 . Однако кастно-мозговой индекс созревания нейтрафилов значительно ниже нормы и составляет

0,28. Сумма розеткообраэующих клеток нейтрофильного ряда в костном мозге B 5 раз меньше, чем в норме:

Костный мозг

I96I 3 в I

Л. км мкл дефицит) р ° мкл (норма)

378 4 (дефицит)

2. — р

Ф °

l 21,5 (норма) 5767,8 в 1

Д-РОН (ПК) У практически здоравага человека:

Е-P0H — 5788,5 в 1 мкл (в костном мозге), Д-РОН вЂ” 121 5 в l мкл (в периферической крови).

У больного с хроническим воспалительным процессом:

E-P0H — 1961,3 в 1 мкл (в костном мозге), Д-РОН вЂ” 378,4 в 1 мкл (в периферической крови).

Таким образом, при хроническом воспалительном процессе в костном мозге нарушается костна-мозговой индекс созревания нейтрафилов и имеется глубокий дефицит розеткоабраэующих нейтрофилов. Больной получал антибактериальную и витаминатерапию. После проведенной терапии состояние удовлетворительное, жалоб нет температура утром и вечером нормальная. В анализе мочи лейкоциты 2-3 в поле зрения, В моче роста микрафлары не обнаружено.

Пример 4. Больная Р., история болезни N - 645, поступила в больницу с диагнозом хронический пиелонефрит, правосторонний нефроптоз. Болеет в течение 5 лет.. При поступлении жалобы на тупые боли в поясничной области, субфибрильную температуру, сла. бостье Аналич мочи: уд,вес 1025, реакция кислая, лейкоциты 6-8 в поле зрения, эритроциты 1-2 в поле зрения.

В посеве мочи роста микрофлоры не . обнаружено.

На рентгенограммах стоя и лежа снижение очистительной функции правой пачки с замедленным выведением препарата иэ нее. Дефицит суммарной очистительной способности почек 25 .

5 а них Ц-POH в 50 раз. Активация воспалительного процесса подтверждена клиническими и лабораторными данными.

Предложенный способ подвергался тщательной проверке. Отработан метод количественного определения поздних (тотальных) Д-нейтрофилов в сравнении с другими способами. Проведен сравнительный анализ у 16 клинически здоровых людей и 146 больных с воспалительными заболеваниями почек.

Таким образом, с помощью данного способа установили, что предлагаемыи. способ является прогностическим, так как диагностирует наличие острого хронического воспалительного процееса, При остром воспалительном процессе количество поздних (тотальных)

-нейтрофилов в периферической крови увеличивается в 8-!9 раэ, при вялотекущем хроническом процессе их коичество увеличено в 3-7 раз.

Впервые разработан метод выявления оздних (тотальных) Д-нейтрофилов. зучение популяции Д-нейтрофилов озволит изучить характер изменения анной популяции в организме человеа при ряде патологических состояний, которых участвуют нейтрофилы, в астности в гематологическай практие, а также при воздействии на оргаиэм человека различных зкстремальix воздействий космические, океаологические исследования, а таке в различных областях народного озяйства связанных с профессиональ ми вредностями, Впервые получены достоверные поаэатели поздних Д-нейтрофилов.

Полученные данные меняют представение не только о существующих норах, но и роли рецепторного аппараа Д-нейтрофилов в организме человека.

Розеткообразующая способность позд. них Д-нейтрофилов позволяет диагнос- тировать наличие или отсутствие деицита клеток — предшественников и тем самым прогнозировать исход воспа ительного процесса и необходимость коррекции в лечении.

Способ достаточно прост, атравматичен и может быть использован в любой клинике для прогнозирования теения воспалительного процесса, переода его в хроническую форму, а своеременно и правильно под< бр пная тераия значительно сокращав T ср 1к лечения.

Тираж 688 Полписн ."

aropop,.óë.Ïðîeêòíëÿ, 7 09332

Заключение: у больной билотеральный пиелонефрит с преимущественным поражением правой почки.

3 мл периферической крови наслаивают на 3 мл раствора фиколл-уротраста с плотностью 1;071 г/мл и 3 мл раствора фиколл-уротраста с плотностью 1,081 г/ил,,центрифугируют при

1500 об/мин в течение 15 мин при 4 С °

Получают две клеточные взвеси: лимфо- !Р . ци тарную и нейтрофильную. Нейтрофилы в количестве 3 10 в 0,1 мл соединяют с 0,05 мл 2,5Х-ного раствора ЭБ и

0,05 мл 2,5Х-ного раствора ЗЧ, Смесь клеток инкубируют )5 мин при 4 С с IS последующим центрифугированием в течение 15 мин при 1500 об/мин и 4 С.

Вторую инкубацию осуществляют в,течение I ч,,при 4 С. Фиксируют 15 мин о

3Х-ным раствором глютеральдегида, 2р центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин, осадок наносят на предметное стекло, сушат,,фиксируют метанолом 5 мин, кра" сят азур - зозином в течение 5 мин, Считают в иммерсионной системе микро- 25 скопа в 6-7 разных полях зрения 200

Д-нейтрофилов. д

5.1У,82,В периферической крови содержание лейкоцитов 7850 в 1 мкл, в сегментоядерных нейтрофилов 3532,5 в 1 мкл (45X), лимфоцитов 3454 в

1 мкл (44 ), моноцитов 785 в 1 мкл (I IX), Д-РОН 812,4 в ìêë (23X). нь

Больной назначена стимулирующая терапия продигиозаном. На фоне стимуля35 ции отмечена активация воспалительного процесса. Температура 39-40 С, о

Анализ мочи по Нечипоренко: лейкоциты 12500 в 1 мл мочи. к

Иммунологическое исследование 4р

16.1У,82. Лейкоциты !6050 в 1 мкл9 сегментоядерные нейтрофилы 14445 в м

I мкл (90Х),лимфоциты 1605 в 1 мкл(IОХ), моноциты 160 в I мкл (l ) Д-РОН 6789,2

:в 1мкл (47Х), Больной проведена интен" 45 сивная антибактериальная терапия.

23,1У.82. Лейкоциты крови 4300, ф

Д"POH 595,9 в 1 мкл (23X).

Анализ мочи: уд.вес. 1015, лейка- л ,циты 3-4 в поле зрения, эритроциты 0-1 в поле зрения. Больная выписывается

1 под наблюдение уролога, Таким образом, содержание Д-POH в периферической крови отражает активность воспалительного процесса, х так как стимулирующая терапия проди- в

55 гиазаном увеличивала содержание Поза- и д»ЮI